1.3.4 1,3 Propanodiol 5s601b

El 1,3 Propanodiol (C3H8O2) también conocido como trimetil glicol ó propilen glicol es un compuesto orgánico lineal, con dos grupos hidroxilo. Se trata de un líquido viscoso e incoloro miscible con el agua.

Fig. 1.3.15 1,3 Propanodiol (PDO)

Se observó por primera vez en 1881 y a pesar de ser uno de los productos de fermentación más antiguos conocidos, no se prestó atención a su ruta microbiana de transformación durante más de un siglo. Presenta

interesantes

aplicaciones:

puede

utilizarse

como

monómero

en

policondensaciones, para producir plásticos con propiedades especiales mejorando su estabilidad térmica e hidrolítica, como poliésteres, poliéteres y poliuretanos y también como disolvente. Otras de sus aplicaciones frecuentes es el diseño de refrigerantes y tintas acuosas. La amplia variedad de aplicaciones ha permitido estimar que para el año 2020 el PDO tendrá un mercado potencial de 230.000 toneladas métricas por año. Actualmente se producen más de 120.0000 toneladas de PDO al año, la mayoría a través de síntesis química. Existe dos procesos de producción vía química del PDO: hidratación de acroleína y hidroformilación de óxido de etileno. La síntesis química requiere altas temperaturas y presiones y catalizadores caros, además de generar subproductos tóxicos, por lo que es costosa. En ambos casos generan rendimientos inferiores al 43%. Esa es la razón por la que el PDO aún tiene un bajo volumen de producción en el mercado. Gracias a los beneficios medioambientales, y el uso de un subproducto proveniente de una energía renovable, la biosíntesis se convierte en una gran alternativa a la síntesis química.

Para el desarrollo sostenible es importante la producción verde de poliéster plástico. Se ha trabajado en el campo de los poliésteres a partir del 1,4 butanodiol más que en los formados a partir del 1,3 propanodiol, a pesar que estos son más biodegradables debido a la escasez de PDO de calidad. El poliéster formado a partir de PDO microbiológico puede conseguirse con un proceso benigno para el medio ambiente. La producción del PDO es más eficiente cuando se utiliza glicerina como base de la fermentación en lugar de glucosa, lográndose conversiones mucho mayores, dado el estado altamente reducido que presenta el carbono. Teniendo en cuenta este potencial, sin embargo, hay que asegurar la fermentación anaeróbica de la glicerina en ausencia de captadores externos de electrones. El PDO es un químico emergente y se ha renovado el interés en su producción biotecnológica. El descubrimiento de un nuevo poliéster, el polipropilen tereftalato (PPT) a partir del PDO, requiere un incremento drástico en su producción. El PPT es un poliéster biodegradable, fue descubierto y patentado en 1941 pero su aplicación era muy limitada debido a que el PDO era demasiado caro. Presenta un gran potencial en la industria textil dada su alta elasticidad, que lo hace idóneo para desarrollar fibras con propiedades como la suavidad, adaptación, facilidad de tinción y resistencia, que han superado fácilmente al nylon en el desarrollo de cierres, sellos, conectores, cubiertas de extrusión y empaques tipo blister. El impacto del desarrollo de aplicaciones y procesos relacionados con el PDO se refleja en las más de 500 patentes generadas entre 1970 y el 2006, estando más de 50 relacionadas con su producción por vías biotecnológicas. Las grandes compañías químicas, tienen varias patentes relacionadas, como Corterra® de Shell y Sorona® y Hytrel® de DuPont. Se genera un gran volumen de glicerina como subproducto en la producción de biodiésel por transesterificación. Existen varias opciones para transformar ese residuo en producto y una de ellas es la transformación microbiana en PDO. Al aprovechar un subproducto, la producción de PDO se vuelve atractiva no solo medioambientalmente sino también económicamente.

La comparación entre la glucosa la glicerina como sustratos, favorecía a la glucosa por su bajo precio. Sin embargo dada la abundancia actual de glicerina, la producción con glucosa es más costosa, y es preferible reservarla para otras aplicaciones como la fermentación alcohólica. Varias compañías han intentado desarrollar tecnologías nuevas y más eficientes para la producción de PDO. En el nuevo proceso de Shell, el PDO se obtiene haciendo reaccionar óxido de etileno con monóxido de carbono e hidrógeno. En el de DuPont se produce por fermentación con microorganismos recombinados. Este nuevo proceso implica un ahorro energético del 40% frente al proceso convencional, disminuyendo además en un 20% las emisiones de gases que afectan al efecto invernadero. Por su desarrollo, el equipo de DuPont y Tate & Lyle fueron merecedores en 2007 del premio “Heroes of Chemistry” concedido por la American Chemical Society. Para conseguir que la vía microbiológica sea económicamente competitiva se requiere tanto de cepas de alto rendimiento como de sustratos económicos, lo cual ha motivado la búsqueda de nuevas cepas capaces de emplear subproductos con alto contenido de glicerina como fuentes de carbono para la fermentación. La conversión biotecnológica de glicerina en PDO se consigue con microorganismos en condiciones anaerobias o microanaerobias. Las bacterias productoras más estudiadas pertenecen a los grupos Clostridia y Enterobacteria. Ambas familias siguen la ruta de regeneración del NADH pero presentan diferencias en algunos metabolismos que son esenciales económicamente a la hora de una producción a escala industrial. La conversión completa no es posible dado al requerimiento de un equivalente adicional reducido

Riesgo biológico

Aerobio/Anaerobio Producción de esporas Subproductos principales Rendimiento (Kg PDO/Kg glicerina) Máximo rendimiento teórico (mol/mol)

Clostridia

Enterobacteria

Clase 1 (Reconocido generalmente como seguro)

Clase 2 (Potencialmente patógeno)

Estrictamente anaerobio. Dificultades en el manejo Sí Ácido acético y ácido butírico

Potencialmente aerobio. Organismos robustos de fácil manejo No Ácido acético y etanol

0,5

0,4

0,72

0,72

Fig. 1.3.16 Principales diferencias entre los grupos Clostridia y Enterobacteria.

Los estudios de producción de PDO a partir de glicerina con cepas de Clostridia son numerosos. La variedad más estudiada es el Clostridium butyricum, seguida del C. acetobutylicum y C. pasteurianum. Actualmente se trabaja en el campo de la ingeniería genética para modificar el C. butyricum combinando las propiedades con otras especias con el objetivo de desarrollar un microorganismo más eficiente. La fermentación con enterobacteria lleva a la acumulación de dos productos principales, PDO y ácido acético, mientras que los productos secundarios como ácido butírico, lactato, formato, succinato y etanol se producen en cantidades variables dependiendo de las condiciones del cultivo. Con C. butyricum, PDO es el producto principal, con ácido butírico y acético como subproductos, además de CO2 y H2. La bacteria C. pasteurianum produce gran variedad de productos en la metabolización además del PDO, como n-butanol, etanol, ácidos acético, butírico y láctico. De acuerdo con Bibl (1991) las concentraciones que inhiben la fermentación de la glicerina con C. butyricum son de 60 g/L para el PDO, 27 g/L para el acetato y 19 g/L para el butirato, y se aceptan concentraciones de glicerina de hasta 80 g/L. Barbirato (1998) demostró que en fermentaciones por cargas, usando C. butyricum, con 112 g/L de glicerina se obtienen concentraciones finales de PDO de 63,4 g/L que es cercano a la máxima concentración tolerada para ese microorganismo. El rendimiento fue de 0,69 mol/mol y la máxima producción de 1,85 g/Lh obteniendo como subproductos 8,1 g/L de ácido acético y 7,5 g/L de ácido butírico. Papanicolau (2000) investigó la producción la producción de PDO con una cepa aislada de C. butyricum. La máxima concentración obtenida en continuo fue de 31-38 g/L con un rendimiento de 0,55 mol/mol. Utilizando dos etapas, se llegaba a 41-46 g/L con una producción máxima de 3,4 g/Lh. Dentro del grupo de las Enterobacterias, existen numerosas especies capaces de convertir la glicerina en PDO, siendo las más prometedoras Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii y Escherichia coli Otras especies como K. oxytoca y K. planticola también son válidas, pero presentan conversiones y productividades bastante menores.

Las conversiones alcanzadas, dependerán en gran medida del tipo y cantidad de subproductos generados. Mu (2006) utilizó K. pneumoniae para fermentar glicerina cruda, obteniendo concentraciones de 61,9 g/L y una producción de 2 g/Lh. El uso de glicerina cruda, simplifica el proceso y reduce los costes de operación. A parte de los grupos mencionados, las cepas de la familia Lactobacillus: Lactobacillus brevis y Lactobacillus buchneri son capaces de producir PDO a partir de glicerina en presencia de glucosa, que es fermentada convirtiéndose en ácido acético, etanol y ácido láctico. Otras variedades como Lactobacillus collinoides, aislada a partir de sidra, o Pediococcus pentosaceus, procedente de cerveza, pueden degradar la glicerina a PDO en presencia de azúcares. El Lactobacillus reuteri, ha llamado la atención dentro de este grupo ya que produce un agente antimicrobiano denominado reuterin que contiene 3HPA, un intermedio valioso para la industria química. Una vía en desarrollo es la de los microorganismos termofílicos productores de PDO, aunque aún existen pocos estudios sobre el tema, pero el uso de dichas bacterias puede ser ventajoso, consiguiendo un proceso más eficiente económicamente. En las fermentaciones termofílicas, pueden utilizarse corrientes calientes procedentes de etapas anteriores del proceso sin la necesidad de consumir energía en el enfriamiento antes del fermentador. Además, la separación posterior por destilación también ahorra una cantidad importante de energía. Entre estos microorganismos, destaca el Caloramator viterbensis, que con una temperatura óptima de 60,7 ºC, es capaz de producir PDO con un rendimiento de 0,69 mol/mol generando únicamente como subproducto orgánico ácido acético. La producción biológica de la glicerina y del PDO es conocida, pero no se ha demostrado aún, que un único microorganismo pueda llevar a cabo el proceso completo. Tampoco se han encontrado microorganismos naturales que conviertan directamente la glucosa en PDO. La ingeniería metabólica puede usarse para manipular los caminos de fermentación de manera que se reduzca o incluso se elimine la formación de subproductos.

La

manipulación genética de los microorganismos, también puede conseguir aumentar la producción del producto o los metabolitos deseados. Algunos estudios han desarrollado microorganismos recombinados para producir PDO a partir de glucosa. Hartlep (2002) presento una estrategia en dos fases para la conversión. En la primera, un E. coli recombinado produce glicerina a partir de D-glucosa, que después se convierte en PDO con K. pneumoniae. Se consiguen concentraciones de PDO de 86,6 g/L. En un proceso de DuPont, usan un E. coli recombinado que contiene genes de S. cervisiae para la producción de glicerina, y de K. pneumoniae para la de PDO. Así se obtienen concentraciones de 135 g/L utilizando glucosa como sustrato. La producción que se alcanza es de 3,5 g/Lh, con conversiones de 0,51 (Sanford 2004). La necesidad de grandes cantidades de vitamina B12 y su elevado precio es la mayor limitación para la producción de PDO a gran escala, utilizando este proceso. Cultivos de E. coli que son capaces de convertir glicerina a PDO se han basado en genes del dharegulon, de K. pneumoniae o C. freundii. Sin embargo el rendimiento es bajo. La razón principal son los subproductos tóxicos que se forman, con el glicerol-3-fosfato. González- Pajuelo (2005) desarrolló un C. acetobutylicum recombinado introduciendo un plasma (pSPD5) que es capaz de producir 1104 mM de PDO en cultivo por cargas con un rendimiento de hasta 0,65 y producción de 1,70 g/Lh. Los autores concluyeron que el C. acetobutylicum puede utilizarse para la producción industrial continua a partir de glicerina cruda proveniente del biodiésel. Zhang et al. (2006) ensayó un E. coli JM109 recombinado (pHsh-dhaB-yqhD) que contiene genes yqhD de un tipo salvaje de E. coli y dhaB de C. freundii. Esta recombinación llega a producir 41,1g/L en un cultivo optimizado que contiene 61,8 g/l de glicerina. En fermentaciones por cargas con azúcares como co-sustrato, Yang (2007) consiguió hasta 83,56 g/L con un rendimiento de 0,62 mol/mol y una productividad de 1,40 g/Lh utilizando K. oxytoca M5al, un cultivo mutado deficiente en biosíntesis de ácido láctico.

En el primer estudio piloto a escala de producción usando K. pneumoniae M5al Cheng (2007) obtuvo 58,8 g/L, rendimiento de 0,53 y productividad de 0,92 g/Lh.

M icr o o r g an ismo M od. C . b u tyric u m C . b u tyric u m C . b u tyric u m C . a c e to b u tylicu m K . p n e u m o n ia e K . p n e u m o n ia e K . p n e u m o n ia e K . o xyto c a E . c o li E . c o li C a lo ra m a to r

No No No Si No Si Si Si Si Si No

P r o ce so

C o n ce n tració nR e n d imie n toP ro d u cció n R e fe re n cia D O(g /L ) YP D O(mo l/mo l) PP D O(g /L h )

B a tch C o n tin u o 1 e ta p a C o n tin u o 2 e ta p a s F e d -B a tch F e d -B a tch F e d -B a tch F e d -B a tch F e d -B a tch ----B a tch

6 3 ,4 3 1 -3 8 4 1 -4 6 8 3 ,9 6 1 ,9 8 6 ,6 5 8 ,8 8 3 ,6 1 3 5 ,0 4 1 ,1 ---

0 ,6 9 0 ,5 5 --0 ,6 5 0 ,4 9 --0 ,5 3 0 ,6 2 0 ,5 1 --0 ,6 9

1 ,8 5 --3 ,4 0 1 ,7 0 2 ,0 0 --0 ,9 2 1 ,4 0 3 ,5 0 -----

B a rb ira to (1 9 9 8 ) P a p a n ik o la o u (2 0 0 0 ) P a p a n ik o la o u (2 0 0 0 ) G o n zá le z (2 0 0 5 ) Mu (2 0 0 6 ) H a rte le p (2 0 0 2 ) C h e n g (2 0 0 2 ) Ya n g (2 0 0 7 ) S a n fo rd (2 0 0 4 ) D u P o n t Z h a n g (2 0 0 6 ) S e yfrie d (2 0 0 2 )

Fig. 1.3.17. Resumen estudios microorganismos productores PDO

Las rutas metabólicas de producción del PDO han sido ampliamente estudiadas aunque no del todo comprendidas, y a menudo las conversiones teóricas, no corresponden a los datos experimentales. Bajo condiciones anaeróbicas, una parte de la glicerina se oxida vía DHA hasta el piruvato (glicólisis) y otra se reduce vía 3HPA hasta PDO. Una pequeña cantidad de la glicerina, en torno a un 5% se utiliza para biomasa y producción de energía si no existe otra fuente de carbono. En condiciones de anoxia, la NADH2 que se produce durante la glicólisis y la producción de biomasa, se regenera mayoritariamente en la reducción hasta PDO, pero también en otras fermentaciones simples a partir del piruvato hasta acetato, H2, nbutirato, lactato, etanol,… En las ocasiones que se alcanzan conversiones mayores que las esperadas, se postulan reacciones adicionales. En presencia de oxígeno, por ejemplo puede existir una influencia del ácido tricarbónico cíclico, que genera más equivalentes de reducción.

Fig. 1.3.18 Ruta metabólica de transformación de glicerina en PDO

La cantidad y composición de los distintos subproductos, difiere entre los distintos microorganismos, y es función además de las condiciones del proceso. Para conseguir elevadas conversiones de PDO es importante que la formación de derivados de la reducción del piruvato sea mínima. Las mejores conversiones se obtienen cuando sólo se forma acetato y PDO, y pueden llegar a 0,72 mol/mol. Si se utilizara glucosa como sustrato en la fermentación, las conversiones obtenidas son menores, alcanzado como máximo valores de 0,51 mol/mol al tratarse de un compuesto en un estado menos reducido que la glicerina. Para que la producción biológica de PDO sea económicamente viable, es necesaria una estrategia eficiente de ahorro de energía en las etapas de separación y purificación del producto. Ya que el PDO se usará mayoritariamente en la industria química de los polímeros, el grado de pureza a obtener debe estar comprendido entre un 95-98%,

dependiendo del tipo de impurezas que contenga y las propiedades específicas demandadas. Como la concentración del producto en el caldo de fermentación es sólo en torno a un 10%, todas las opciones de recuperación necesitan incluir una primera etapa de eliminación de agua, por ejemplo por evaporación. Esta etapa se resulta ser la que más energía consume de todo el proceso de recuperación. Existen numerosos enfoques para la recuperación del PDO. En ocasiones es necesaria la eliminación de la biomasa en primer lugar por centrifugación o microfiltración. Se ha comprobado que el tratamiento del caldo de fermentación de C. butyricum con una floculación con chitosan y poliacrilamida, seguido de una extracción reactiva con butiraldehído y una destilación reactiva sobre una resina de intercambio ácida catiónica, separa la biomasa y las proteínas solubles. Se obtiene como resultado una mezcla de PDO, 2,3 butanodiol, glicerina y acetales de glicerol. Se ha experimentado con la extracción líquido-líquido con varios disolventes, como el polipropilen glicol, ácido oleico y otros compuestos orgánicos, pero el coeficiente de distribución que presenta el PDO en estos disolventes no es lo suficientemente alto para que una extracción simple sea eficiente. Un proceso bastante simple y barato consiste en el uso de zeolitas en un módulo de filtración con flujo cruzado que separa la biomasa y enriquece el caldo de fermentación en PDO. Se ha ensayado también con la separación cromatográfica en un intercambiador catiónico, pero no se han conseguido resultados económicamente viables aún.