Examenul Biochimic Al Urinei 2ro73

EXAMENUL BIOCHIMIC AL URINEI Introducere Urina este un lichid biologic, produs al excreţie renale, cu o compoziţie complexă, alcătuită din apă, substanţe minerale, substanţe organice. etc. Compoziţia urinei depinde de o serie de factori cum sunt: aportul exogen (alimentaţie), metabolismul intermediar, starea de funcţionare a unor organe (rinichi, ficat), medicaţie etc. Urina excretată în condiţii de funcţionare normală (fiziologică) a organismului are o compoziţie şi caracteristici fizico-chimice bine determinate, acestea modificându-se, mai mult sau mai puţin profund, odată cu modificarea factorilor menţionaţi. De aceea un examen de laborator al urinei poate furniza clinicianului date utile privind atât explorarea metabolismului intermediar cât şi a funcţiei diverselor organe. Pentru ca rezultatele examenelor de laborator să reflecte fidel starea de funcţionare a organismului, la colectarea urinei din care urmează să se efectueze determinările trebuie să se ţină seama de anumite prescripţii. Colectarea şi conservarea urinei Colectarea urinei se face în vase de sticlă, bine spălate şi acoperite, iar pentru examenul bacteriologic trebuie să fie sterile. Uneori este necesară utilizarea unor recipiente închise la culoare deoarece unele substanţe pe care vrem să le determinăm (ca de exemplu, bilirubina, porfirinele) sunt sensibile la lumină, iar expunerea lor conduce la rezultate false. Colectarea urinei se face diferit, în funcţie de produsul pe care vrem să îl determină şi de testul utilizat: Urină Urina spontană recoltată din jetul mijlociu

Timp de colectare Prima urină de dimineaţă

A două urină de dimineaţă Urina spontană, recoltată în oricare moment al zilei

Teste efectuate - examen bacteriologic - examen cu stripuri - testul pentru punerea în evidenţă a nitriţilor (doar pentru urina recoltată în recipient steril) - examinarea microscopică a sedimentului urinar - determinarea semicalitativă a proteinelor urinare - alte determinări biochimice calitative - examen cu stripuri - determinarea semicalitativă a proteinelor şi glucozei urinare - determinarea semicalitativă a glucozei urinare postprandial

Teste neindicate - determinarea cantitativă tuturor compuşilor biochimici (pentru toate situaţiile în care folosim urina spontană).

- testul pentru punerea în evidenţă a nitriţilor - examen bacteriologic - examinarea microscopică a

Urină Urină recoltată prin puncţie suprapubiană

Timp de colectare -

Teste efectuate - examen bacteriologic

Urina colectată pe anumite intervale de timp

Perioadă de timp bine determinată, de obicei 24 ore (sau 3 ore pentru unele determinări)

- determinarea cantitativă tuturor compuşilor biochimici (24 ore). - sedimentul minutat Addis-Hamburger (3 ore)

sedimentului urinar Teste neindicate - determinarea cantitativă tuturor compuşilor biochimici. - examen bacteriologic - examinarea microscopică a sedimentului urinar

Pentru urina de 24 ore colectarea începe la ora 8 dimineaţa după ce s-a aruncat urina emisă la această oră. Porţiunile urinate în continuare în cursul zilei şi a nopţii se colectează împreună, numai urina emisă a doua zi dimineaţa la ora 8 se colectează separat. Conservarea urinei. Pentru ca urina să nu se altereze în timpul colectării este necesară conservarea ei. Se poate face fie prin congelare imediată sub -20°C, prin depozitare la frigider (4-80C), fie prin adăugarea unor substanţe conservante, dar care să nu afecteze componentele urinei. Partea experimentală Examenul sumar al urinei Examenul sumar al urinei cuprinde: • examenul macroscopic • examenul biochimic • examenul microscopic al sedimentului urinar. 1. Examenul macroscopic al urinei: a) Volumul Nu intră în analiza sumarului de urină, ci doar la determinările ce se efectuează cantitativ pe urina de 24 de ore, dar din motive didactice îl vom trata în acest capitol. Cantitatea de urină emisă în 24 de ore, denumită diureză, se colectează întrun vas de sticlă acoperit cu un capac şi se măsoară cu un cilindru gradat. În condiţii normale, diureza la bărbaţi este de 1500 ml (1200 -1800 ml) iar la femei 1200 ml (1000-1400) dintre care 3/4 sunt eliminate în cursul zilei şi numai 1/4 în cursul nopţii (raport diurn / nictemeral 3/1). La copii diureza creşte cu vârsta. Diureza în clinostatism este mai mare decât în ortostatism, funcţia normală se poate adapta la eliminarea unui volum foarte mic (25 ml/oră) sau foarte mare (1200 ml/oră) de urină, după necesităţile de moment. În condiţii fiziologice volumul urinei din 24 de ore depinde de ingestia de lichide, alimentaţie şi temperatură, precum şi de masa corporală şi de factorii emoţionali (starea psihică). Produşii finali azotaţi, ingestia de cafea, ceai şi băuturi alcoolice (în special berea) au efect diuretic, crescând volumul urinei emise în 24 ore. Modificările patologice ale diurezei se referă la: - volumul de urina eliminat în 24 de ore: poliurie, oligurie, anurie. - ritmul eliminării în 24 de ore: nicturie, opsiurie.

Poliuria înseamnă producerea unei cantităţi de urină ce depăşeşte 2 litri în 24 de ore. Se întâlneşte în: - condiţii fiziologice: frig, umezeală, emoţii, consum excesiv de lichide sau produse vegetale bogate în apă, consum excesiv de cafea; în poliuriile fiziologice raportul nictemeral rămâne nemodificat; - condiţii patologice: hipertiroidie, istrare de diuretice în insuficienţa cardiacă sau edeme renale, după crize dureroase (angor pectoris, colică renală), după crize de epilepsie, diabet zaharat, diabet insipid, glomerulonefrită, pielite, pielonefrite acute sau cronice, scleroză primară sau secundară, rinichi polichistic, TBC renal, hipertrofie de prostată etc; nicturia este caracteristică poliuriilor de cauză renală. Oliguria înseamnă producerea unei cantităţi de urină mai mică de un litru în 24 de ore. Se întâlneşte în: - condiţii fiziologice: ingestia de cantităţi mici de lichide, pierdere excesivă de apă prin transpiraţie; - condiţii patologice: insuficienţă cardiacă, deshidratări prin vărsături, diaree şi hemoragii, şoc, colaps, afecţiuni hepatice, hipotiroidie, stări febrile, tulburări nervoase reflexe, glomerulonefrite difuze, glomerulonefrite cronice, nefrite interstiţiale, nefropatii tubulare toxice, litiază renală, tumori ale micului bazin, cuduri ureterale prin rinichi mobil etc. Anuria înseamnă incapacitatea completă a rinichiului de a produce urină (se elimină totuşi o cantitate mai mică decât 150 ml urină în 24 de ore). Anuria apare în toate afecţiunile în care se produce oligurie, dacă acţiunea factorilor cauzali este mai intensă sau de durată mai lungă. b) Aspectul Aspectul urinei normale variază în funcţie de timpul trecut de la emisiune, de temperatura mediului ambiant, de tehnicile de conservare. La emisiune, urina normală este limpede, transparentă. La o examinare făcută după câteva ore, apare o suspensie sau un depozit floconos (nubecula) compus din celule descuamate ale căilor urinare, iar la femei şi din celule vaginale descuamate. În cazul urinelor alcaline sau neutre, aspectul imediat după emisiune poate fi tulbure, datorită fosfaţilor alcalino-pământoşi. Ţinută la temperatură prea scăzută, urina se tulbură datorită cristalizării acidului uric şi a uratului acid de sodiu. Conservată defectuos, urina formează depozite de carbonat de calciu şi fosfat amoniaco-magnezian. Pentru a diferenţia modificările patologice ale aspectului urinei de modificările ce depind de factorii mai sus amintiţi, se folosesc următoarele modalităţi: - încălzire uşoară pentru dizolvarea cristalelor de acid uric şi urat acid de sodiu (5 ml urină într-o eprubetă încălzită la flacără); - acidifiere cu acid acetic pentru dizolvarea depozitelor de carbonat de calciu, fosfat amoniacomagnezian, fosfaţi alcalinopământoşi (5 ml urină peste care se pipetează un ml acid acetic 10%). Modificări patologice ale aspectului urinei se întâlnesc în afecţiuni renale ale căilor excretoare renale şi sunt datorate prezenţei elementelor figurate ale sângelui (hematii, leucocite), mucusului şi diferiţilor cilindri. Analiza unei urini tulburi (cu excepţia determinării acidităţii), se execută numai după ce urina a fost limpezită prin sedimentare. Există şi afecţiuni renale (insuficienţa renală cronică) în care urina este foarte limpede, ca apa, transparentă şi fără sediment datorită poliuriei.

c) Culoarea Culoarea urinei este dată de substanţele colorate pe care le conţine. Dintre acestea unele apar ca produşi normali sau patologi ai metabolismului intermediar (pigmenţi urinari, cromogeni, etc.), iar altele sunt de provenienţă alimentară (de exemplu coloraţie roşie după consum de sfeclă şi varză roşie) sau medicamentoasă. În mod fiziologic, urina prezintă modificări şi anume: - urina nocturnă este mai închisă la culoare faţă de urina diurnă; - urina acidă: este mai închisă la culoare faţă de urina alcalină; - urina ce conţine medicamente sau produşi de conjugare ai acestora poate fi: - verde albastră în cazul albastrului de metilen; - brună până la neagră în cazul fenolului, rezorcinei, salolului, pirogalolului, taninului; - roşie în cazul piramidonului, aspirinei. Schimbări ale coloraţiei urinei pot fi atribuite şi diferitelor afecţiuni renale sau extrarenale: - urina galben-portocalie, în boli febrile acute sau după transpiraţii acute; - urina galbenă palid, în diabet insipid, scleroză renală, insuficienţă renală cu poliurie, după agenţi diuretici; - urina roşie, în hematurie (bulion de came), hemoglobinurie, porfirie; - urina cenuşie, în methemoglobinemii, sarcom; - urina brună în sindroame icterice: - urina verde-roşiatică, până la verde-neagră în nefrite acute hemoragice, sindroame icterice forme grave; - urina neagră, în alcaptonurie. d) Mirosul Urina normală are un miros fad, miros de migdale amare, datorită acizilor volatili sau substanţelor urinoide. Urina normală poate avea miros modificat şi anume: - accentuat, în urinele concentrate; - de violete, după istrare de medicamente cu esenţă de terebentină; - dezagreabil, după aport exogen de sparanghel, usturoi, hrean. Modificările patologice ale mirosului urinei pot fi: - miros amoniacal în boli infecţioase sau tumorale renale şi ale căilor excretoare renale; - miros putrid în infecţii cu floră anaerobă; - miros de mere acre în diabet, vărsături acetonemice ale copiilor. 2. Examenul biochimic al urinei Examenul biochimic se efectuează în prezent cu ajutorul stripurilor urinare (numite şi bandelete reactive). Acestea analizează semicantitativ unii produşi prezenţi în urină: urobilinogenul, bilirubina, corpii cetonici, acidul ascorbic (unele dintre ele), glucoza, proteinele, hematiile, nitriţii, leucocitele precum şi pH-ul şi densitatea urinară Banda de test conţine mai multe zone distincte, fiecare corespunzătoare unui anumit parametru de testat. Introducerea benzii în urină va produce sau nu modificarea coloraţiei în fiecare zonă. Modificările vor fi comparate cu o scară etalon, livrată odată cu testul, în care se face corelaţia între concentraţia parametrului analizat şi modificarea de coloraţie obţinută.

Un strip este alcătuit din 4 straturi suprapuse: o folie protectoare de nylon, o hârtie impregnată cu reactivul corespunzător, o hârtie de filtru absorbantă şi un de plastic. Folie protectoare de nylon Hârtie impregnată cu reactiv Hârtie absorbantă de plastic

Indicaţiile utilizării stripurlor urinare: - boli renale şi de tract urogenital. În acest caz, se urmăresc modificările de culoare la nivelul bandeleltelor reactive în special a următorilor parametrii: pH, leucocite, nitriţi, proteine, hematii, densitate urinară. Importanţa efectuării unui examen sumar de urină de rutină reiese din faptul că bolile renale şi de tract urogenital rămân adesea asimptomatice o perioadă lungă de timp conducând adesea la alterări ireversibile. De exemplu, insuficienţa renală reprezintă stadiul terminal al diverselor nefropatii primare şi secundare iar singura posibilitate de tratament a acesteia este reprezentată de dializă sau de transplantul renal. În plus, are repercusiuni negative asupra altor organe şi sisteme, îndeosebi asupra sistemului cardiovascular. - boli metabolice (în special diabetul zaharat). Se urmăresc glucoza şi corpii cetonici urinari şi nu numai acestea deoarece, în timp, diabetul zaharat se complică cu diverse forme de nefropatie. - boli hepatice şi anemii hemolitice. În acest caz importantă este determinarea urobilinogenului şi a bilirubinei. În multe boli hepatice simptomatologia apare doar în stadii avansate iar un diagnostic precoce conduce la instituirea imediată a tratamentului, evitând complicaţiile ce pot apărea ulterior. - monitorizarea unor tratamente cu schimbarea, la nevoie, a strategiei terapeutice. - medicina generală cu scopul efectuării de screening-uri pentru depistarea bolilor aflate într-un stadiu incipient asimptomatic. Mod de lucru Se utilizează urina proaspătă necentrifugată, de obicei prima urină de dimineaţă. Urina se colectează într-un vas de preferinţă steril (dacă recipientul nu este steril, nu se interpretează nitriţii). Bandeleta se imersează timp de două secunde în urină în aşa fel încât toată suprafaţa să fie acoperită. Se îndepărtează excesul de lichid lipind marginea benzii de marginea vasului cu urină, apoi se pune banda în poziţie orizontală. Se compară zonele reactive de pe bandă cu cele corespunzătoare de pe scala etalon într-un interval de 60 de secunde (pentru leucocite intervalul de 60-120 de secunde). Nu se vor depăşi două minute pentru compararea rezultatelor. Parametrii determinaţi cu ajutorul stripurilor urinare a) Densitatea urinară Principiu Testul determină concentraţia ionică a urinei bazându-se pe eliberarea protonilor care, în prezenţa cationilor formează un complex. Reacţia produce schimbarea culorii indicatorului (albastru de brom-timol). Constituenţii neionici ai urinei, cum ar fi glucoza sau ureea nu sunt determinaţi. De aceea, o creştere a

densităţii datorită concentraţiei glucozei > 1000 mg/dl (> 56 mmol/L) nu este determinată prin acest test. EGTAH K + H+ EGTAH * + K+ 4

Anionul albastru de brom - timol + H+ (colorat în albastru)

3

Albastru de brom timol (colorat în galben)

(* = Etilenglicol – bis (β-aminoetileter) – N,N’-tetraacetic acid) Surse de eroare: - prezenţa proteinelor (100-500 mg/dl) conduce la rezultate fals crescute. Acelaşi fenomen are loc şi în cazul urinei cetoacidozice. - la un pH de 7 sau mai mare, valorile sunt mai mari cu 0,005 g/ml Semnificaţii clinice Densitatea urinei normale, numită normostenurie, variază între 1,015-1,025 g/cm3. În condiţii de hidratare sau de deshidratare a organismului, limitele sunt mai largi, variind între 1,000-1,030 g/cm3. În condiţii fiziologice densitatea urinei variază invers proporţional cu cantitatea emisă şi direct proporţional cu cantitatea de substanţe pe care le conţine şi cu intensitatea culorii. Valorile mai mici de 1,010 g/ml au o semnificaţie analitică deoarece în acest caz leucocitele şi hematiile suferă o liză rapidă. Aşa se explică rezultatele negative obţinute la citirea sedimentului urinar dar cu rezultate pozitive pe strip. În cazul alterării funcţiei de concentrare a rinichiului, sau a eliminării anormale a unor metaboliţi, corelaţia dintre densitate şi diureză se pierde. Patologic se remarcă următoarele situaţii: - Hiperstenurie, densitate peste 1,025, apare în diabet, proteinurie, urinei concentrate survenite în urma unui regim de sete, transpiraţii abundente, stări febrile etc. - Hipostenurie, densitate sub 1,015, apare în diabet insipid, aport excesiv de apa sau alimente bogate în apă (fructe). - lzostenurie, densităţile tuturor emisiunilor din 24 de ore sunt egale şi cuprinse în jurul valorii de 1,002 (densitatea ultrafiltratului plasmatic glomerular). Apare în caz de insuficientă renală gravă dovedind incapacitatea de diluare sau concentrare a rinichiului. b) pH-ul. Principiu Zona reactivă conţine un amestec de trei indicatori: roşu metil, albastru de brom-timol şi fenolftaleină. În limita de pH de 5-9 se obţine o culoare care variază gradat de la portocaliu-galben-verde până la albastru.

Br

Br

Br OH

O

+

-H

Br

O

O-

+H+ SO3-

SO3-

Albastru de brom-timol

galben

albastru O-Na+

O OH O R

+2NaOH

O

O

-H2O

R

R

R -

OH

O Na

incolor

Fenolftaleina

rosu

COOH N+

COOH +

N

N(CH3)2

H rosu

-H

+H+

rosu metil

urina acida: portocalie

-

+

N

N

N(CH3)2

galben urina alcalina: verde

Surse de eroare în cazul probelor de urină care staţionează timp îndelungat înainte de a fi lucrate, pH-ul poate vira spre alcalin ca rezultat al creşterii bacteriene.

Semnificaţii clinice În mod normal, urina are o reacţie acidă. pH-ul urinei este determinat în cea mai mare măsură, de proporţia de fosfaţi bibazici (alcalini) şi monobazici (acizi) aflaţi în urină. După cum se ştie, rinichiul este irigat de sânge, care are un pH de aproximativ 7,4 şi formează urina cu un pH acid. Această variaţie de pH se realizează, în parte, prin modificarea proporţiei dintre fosfaţii acizi şi alcalini. Raportul acestora în plasmă (pH = 7,4) este: NaH 2 PO 4 1 = Na 2 HPO 4 5 iar în urină (pH = 4,5-5,5) se inversează:

NaH 2 PO 4 5 = Na 2 HPO 4 1 În cazurile în care urina atinge aciditatea maximă, raportul este egal cu 50:1. Prin acest mecanism sunt cruţate o mare cantitate de baze fixe ale organismului (în special Na+, dar şi K+, Mg2+ şi Ca2+). pH-ul urinar variază între 5,8 şi 7,4 în cursul zilei; urina de dimineaţă are un pH de 5-6. În condiţii fiziologice, pH-ul urinar variază în funcţie de alimentaţie. Într-o alimentaţie strict carnală, urina este acidă, cu un pH cuprins între 5,2 - 5,3, în timp ce într-o alimentaţie exclusiv vegetariană, urina este alcalină, cu un pH cuprins între 7,0 - 7,5. În cazul unei alimentaţii mixte, reacţia urinei este slab acidă. Trebuie reţinut faptul că, după istrarea de bicarbonaţi sau tratament cu ape minerale, urina are o reacţie alcalină. Ca şi volumul urinei, valoarea pH-ului este supusă unui ritm nictemeral. Urina cea mai acidă se elimină spre miezul nopţii şi cea mai puţin acidă (uneori alcalină) dimineaţa. Prin păstrare timp mai îndelungat, urina poate deveni alcalină căci prin contaminare cu germeni microbieni are loc descompunerea ureei (sub acţiunea ureazei) în amoniac. Valorile pH-ului care depăşesc valoarea 7 au o importanţă analitică deoarece, în acest caz, eritrocitele şi leucocitele suferă o liză rapidă ceea ce explică rezultatele negative obţinute la sedimentul urinar în condiţiile unor rezultate pozitive pe strip. În mod patologic semnalăm persistenţa valorilor pH-ului acid sau alcalin independent de alimentaţie. Valori scăzute ale pH-ului urinar (urinei acide) se întâlnesc în: - inaniţie - diverse intoxicaţii - insuficienţă renală - cetoacidoză diabetică Valori crescute ale pH-ului urinar (urinei alcaline) se întâlnesc în: - vărsături abundente de diferite etiologii; - infecţii ale căilor urinare (uretrite, cistite, pielite, pielonefrite). - hipopotasemii severe - diverse intoxicaţii - febră de diverse etiologii

c) Leucocitele Principiu Leucocitele excretate în urină sunt aproape exclusiv granulocite ce prezintă o activitate esterazică detectată prin reacţia de pe strip. Zona reactivă conţine un ester indoxilic care este clivat de către esteraza granulocitară. Indoxilul liber reacţionează apoi cu o sare de diazoniu formând un derivat diazo colorat violet. Acest test detectează activitatea esterazei granulocitare şi histiocitare (histiocitele sunt de asemenea produse în urma unui proces inflamator iar la examinarea microscopică nu se pot diferenţia de leucocite pe preparate native necolorate). Ca urmare, sunt detectate nu numai celulele intacte ci şi cele lizate.

O O N

NH

OH HO

Esteraza leucocitara

+

SO2

N

SO2

Indoxil

Ester indoxilic

OH + N H Indoxil

NH

H

H

N

O

OH N+

R1-

R2 Sare de diazoniu

N

N

N

H Derivat azo (violet)

R2

R1

Surse de eroare - dacă urina este intens colorată, această coloraţie poate masca culoarea obţinută în urma reacţiei de pe strip - excreţia de proteine peste 500 mg/dl şi a glucozei peste 2 g/dl poate bloca colorarea zonei reactive zonei reactive. Aceleaşi efecte le au şi unele medicamente istrate în doze mari (gentamicina, cefalexinul). - unele medicamente pot da reacţii fals pozitive: meropenemul, imipenemul, acidul clavulanic. Semnificaţii clinice: Leucocituria reprezintă un indicator important al proceselor inflamatorii renale şi ale tractului urinar: infecţii bacteriene (cistite, uretrite, pielonefrite acute şi cronice), infecţii abacteriene cauzate de virusuri şi levuri, infecţii parazitare, glomerulopatii, intoxicaţii. De asemenea, prezenţa leucocitelor în urină poate fi cauzată şi de o contaminare cu secreţii din căile genitale, dar în marea majoritate a cazurilor, pozitivarea testului pentru leucocite semnifică prezenţa unei infecţii bacteriene de tract urinar. Uneori, în cazul inflamaţiilor cronice, se observă o puternică reacţie leucocitară în absenţa bacteriilor, cunoscută sub numele de „leucociturie abacteriană”. Această situaţie este observată adesea ca simptom unic în pielonefritele cronice, tuberculoză, diverse tumori. d) Nitriţii Principiu Nitriţii sunt detectaţi pe baza principiului testului Griess: orice nitrat prezent în urină e transformat prin reducere de către bacterii într-un nitrit: Nitrat → reducere bacteriană → Nitrit Amina aromatică a sulfanilamidei reacţionează cu nitritul în prezenţa unui tampon acid formând o sare de diazoniu care se cuplează cu 3-hidroxi-1,2,3,4tetrahidrobenzo-(h)-chinolină formând un derivat azo de culoare roşie. Intensitatea culorii este direct proporţională cu concentraţia nitriţilor dar fără nici o legătură cu severitatea infecţiei.

H2N SO2

NH3++ NO2-

H+

Nitrat

Sulfanilamida

N+ N+2H2O

H2N SO2 Sare de diazoniu

H

OH H2N SO2

+

N

N+

H2N SO2

N+ N

OH

N Sare de diazoniu

H

N H

Component de cuplare

Derivat azo (rosu)

Surse de eroare - rezultatele fals pozitive se datorează: poliuriei care spală căile urinare, alimentaţiei parenterale, dietei carnale, timpului îndelungat scurs până la efectuarea testului (peste 4 ore), utilizarea de recipiente nesterile (în această situaţie nu se interpretează testul pentru nitriţi). - rezultatele fals negative se datorează: contaminării bacteriene a urinei, tratament cu substanţe ce conţin fenazopiroclor. Semnificaţii clinice Reacţia pentru nitriţi este specifică pentru prezenţa bacteriuriei; reacţia este independentă de pH. Un singur test negativ nu exclude o infecţie de tract urinar deoarece numărul bacteriilor şi conţinutul de nitraţi poate varia. Absenţa culorii la teste repetate nu exclude o infecţie deoarece nu toate microorganismele formează nitriţi. În mod normal, urina nu conţine nitriţi. istrarea de tratamente ce au în componenţa lor nitriţi nu se concretizează prin excreţia de nitriţi. Orice nitrit excretat urinar este de natură exclusiv bacteriană. În prezenţa unui tratament antibiotic sau a chimioterapiei, metabolismul enzimatic şi populaţia microbiană sunt inhibate, deci vom avea un test negativ. Din această cauză, orice tratament antimicrobian trebuie întrerupt cu cel puţin 3 zile înainte de efectuarea testului. e) Proteinele (albuminele) Principiu Reacţia se bazează pe aşa numita „eroare proteică a indicatorilor de pH”. Zona reactivă conţine un amestec tampon şi un indicator care îşi schimbă culoarea de la galben la verde în prezenţa proteinelor, independent de pH.

Cl

Cl O

OH

Cl

Cl Br

SO3

Br

Br

-

Br galben 3'3",5'5"tetraclorofenol3,4,5,6-tetrabromsulfonftaleina (forma neutra)

Cl

Proteine +

-H

Cl

O

O-

Cl

Cl Br

SO3-

Br

Br

Br verde Anionul acestui compus

Surse de eroare - rezultate fals pozitive sunt obţinute în următoarele condiţii: istrare de polivinilpirolidona (un substitut de sânge), prezenţa unor reziduuri de dezinfectanţi ce conţin grupări cuaternare de amoniu sau clorhexidină, medicaţie ce conţine fenazopiridină - medicamente ca şi chinina, chinidina, clorochina, sulfonamidele, penicilina nu interacţionează cu reacţia de pe strip. Semnificaţii clinice Indicatorul este foarte sensibil la albuminele cu masă moleculară mică excretate în cazul afectării renale. Sensibilitatea la alte proteine este scăzută (proteina Bence-Jones, γ-globuline, peptone, mucoproteine) Urina normală conţine cantităţi extrem de mici de proteine (50-100 mg/24 ore sau 10-30 mg/dl pentru prima urină de dimineaţă), ce nu pot fi evidenţiate prin reacţiile de recunoaştere obişnuite. În mod patologic urina poate conţine însă cantităţi mai mari sau mai mici de substanţe proteice: ele constituie aşa numita proteinurie. Proteinuria este frecvent un semn de boală renală dar este nespecifică. Prezenţa ei nu demonstrează o nefropatie dar nici absenţa ei nu o exclude. Depistarea unei proteinurii necesită un diagnostic diferenţial. Proteinuria benignă. La unele persoane sănătoase, fără afectare renală se poate observa uneori o proteinurie ce apare mai frecvent în jurul vârstei de 30 ani. Cauzele cele mai incriminate sunt: stresul fizic şi emoţional, ortostatismul prelungit, lordoza. Proteinuriile asociate hipotermiei, supraîncălzirii organismului, sarcinii sau folosirii medicamentelor vasoconstrictoare sunt, de asemenea, considerate benigne. Proteinuria extrarenală. Proteinele pot apărea în urină în majoritatea situaţiilor cu tablou acut, cum ar fi: colicile, crizele epileptice, infarctele, accidentul vascular cerebral, traumatisme craniene, postoperator. Aceste proteinurii dispar imediat ce cauza extrarenală a fost eliminată. Proteinuria de cauză renală. O creştere a permeabilităţii capilarelor glomerulare datorită modificărilor patologice de la acest nivel conduce la dezvoltarea proteinuriei renale. Această proteinurie este persistentă şi este observată pe tot parcursul zilei şi a nopţii. Cele mai pronunţate proteinurii sunt observate în nefroze. În glomerulonefrite excreţia proteică este de obicei situată în jurul valorii de 200-300 mg/dl şi însoţită de alte câteva simptome, fiind acompaniată aproape constant de microhematurie.

Proteinuria de origine tubulară se datorează leziunilor celulelor tubulare şi/sau tulburărilor de absorbţie tubulară a proteinelor din filtratul glomerular. Acest tip de proteinurie se întâlneşte în cazul pielonefritelor, nefritelor, chistelor renale, rinichiului polichistic. Excreţia intermitentă de proteine apare adesea în pielonefritele cronice. Proteinuria postrenală însoţeşte procesele inflamatorii de la nivelul vezicii urinare, prostatei şi hemoragiile tractului urinar. f) Glucoza Principiu Testul de punere în evidenţă a glucozei se bazează pe reacţia specifică cu glucozoxidază-peroxidază în care D-glucoza este oxidată enzimatic de către oxigenul atmosferic la δ-D-gluconolactonă. Apa oxigenată rezultată este utilizată într-o reacţie de culoare. Astfel sub acţiunea peroxidazei apa oxigenată de descompune în apă şi oxigen atomic care oxidează tetrametilbenzidina la un derivat colorat în verdealbastru. CH2OH

CH2OH

O OH

H

+O2

OH HO

H

OH Glucoza

H2N

GOD

O

H

O + H2O2

OH HO OH

Gluconolactona NH2 + H2O2

POD

H2O + Derivat colorat verde-albastru

3,3',5,5'-tetrametilbenzidina

Surse de eroare - datorită reacţiei enzimatice, interferentul major, vitamina C, a fost eliminat. - testul este independent de pH şi de prezenţa corpilor cetonici. - rezultate fals pozitive pot apărea la utilizarea dezinfectanţilor care conţin apă oxigenată Semnificaţii clinice Urina normală conţine o cantitate foarte mică de glucide (350-500 mg/24 ore sau 15 mg/dl în urina de dimineaţă), cantitate neidentificabilă prin metodele uzuale. Determinarea glucozei în urină are o valoare diagnostică mare pentru depistarea diabetului zaharat cât şi pentru posibilitatea de autocontrol a acesteia de către pacienţi. Pe de altă parte, absenţa glicozuriei nu exclude o alterare a metabolismului glucidic, în particular, nu exclude un diabet zaharat. De asemenea, glicozuria poate fi cauzată şi de alţi factori. Glicozuria apare atunci când reabsorbţia tubulară (tubul proximal) la nivel renal a glucozei este depăşită, la o valoare a glicemiei de peste150-180 mg/dl (prag renal de eliminare a glucozei). Glicozuria din diabetul zaharat. Majoritatea pacienţilor diabetici prezintă glicozurie, dependent de severitatea bolii şi de integritatea funcţiei renale. Determinarea glicozuriei postprandial este mai eficientă pentru depistarea diabetului decât cea efectuată folosind prima urină de dimineaţă.

Glicozuria renală (diabetul renal) reprezintă o tulburare congenitală benignă caracterizată prin prezenţa unei glicozurii, constante sau intermitente, în timp ce glicemia are valori normale sau scăzute. În această situaţie, reabsorbţia tubulară a glucozei este limitată, fapt care duce la pierderea de glucoză prin urină. g) Corpii cetonici Principiu Depistarea corpilor cetonici se bazează pe principiul reacţiei Legal. Acidul acetoacetic şi acetona reacţionează cu nitroprusiatul de sodiu şi glicina în mediu alcalin conducând la un compus violet. Reacţia este specifică doar pentru cei doi corpi cetonici; acidul β-hidroxibutiric nu reacţionează. Na2[Fe(CN)5NO]

+

CH3 - C - R

Nitroprusiat de sodiu

Na3[Fe(CN)5N = CH - C - R] + H2O

O Corp cetonic

OH O Complex colorat violet

Semnificaţii clinice Corpii cetonici (acidul acetoacetic, acidul β-hidroxibutiric şi acetona) sunt prezenţi în urină atunci când există o degradare a acizilor graşi datorită unui aport insuficient de energie sub formă de glucoză. Predominanţa lipolizei conduce la creşterea nivelului acizilor graşi liberi în ser urmată de degradarea lor la nivel hepatic până la acetil-Coenzima A, formă sub care pot fi utilizaţi în continuare în alte procese metabolice. Acest exces va fi convertit în acid acetoacetic ce va fi transformat parţial în acid β-hidroxibutiric şi doar o mică parte în acetonă. Cetonuria din diabetul zaharat. Prezenţa corpilor cetonici în urină este semnalată atunci când diabetul zaharat este decompensat. Starea comatoasă şi precomatoasă sunt întotdeauna acompaniate de cetoacidoză, cu excepţia comei hiperosmolare. Deficitul relativ sau absolut de insulină determină reducerea utilizării glucozei de către ţesutul adipos şi celula musculară, având ca rezultat intensificarea lipolizei. Corpii cetonici rezultaţi împreună cu alte modificări fiziopatologice (deshidratare, pierdere de electroliţi) au ca şi consecinţă instalarea comei. Cetonuria de cauză nediabetică. Există şi alte situaţii în care apar corpii cetonici în urină: inaniţie, vărsături incoercibile la copii mici, febră în special atunci când însoţeşte o boală infecţioasă, vărsăturile din primele luni de sarcină, boli metabolice congenitale. h) Urobilinogenul Principiu Fluoroboratul de p-metoxibenzendiazoniu, o sare de diazoniu stabilă, formează un compus azo de culoare roşie în prezenţa urobilinogenului în mediu acid.

H3C

O Sare de diazoniu

Surse de eroare:

N+ N

BF4- + Urobilinogen

Mediu acid

Compus azo (rosu)

rezultate fals negative se întâlnesc în următoarele condiţii: timpul îndelungat scurs de la recoltare până la efectuarea testului şi expunerea probei la lumină determină oxidarea urobilinogenului; terapia cu hexametilentetramină, conservarea probei de urină cu formol. - rezultatele fals pozitive se pot datora medicaţiei care colorează urina în roşu sau prezintă o culoare roşie în mediu acid. - testul este specific, nefiind supus interferenţelor care apar în cazul reacţiei Ehrlich Semnificaţii clinice Urobilinogenul se formează prin reducerea de către bacteriile intestinale a bilirubinei care este secretată în intestin prin bilă. Acesta aste reabsorbit şi ajunge la ficat dar o mică parte se excretă prin urină. Supraîncărcarea capacităţii funcţionale hepatice. Când sunt prezente cantităţi mari de bilirubină, şi de asemenea şi urobilinogen, ca rezultat al degradării excesive a hemoglobinei, capacitatea funcţională hepatică poate fi depăşită, chiar dacă ficatul prelucrează de 2-3 ori mai mult urobilinogen decât în mod normal. Urobilinogenul neprelucrat ajunge în torentul sangvin şi în final este excretat renal. Cauzele supraîncărcării capacităţii funcţionale hepatice sunt: anemii hemolitice, anemie pernicioasă, hemoliză intravasculară ca şi consecinţă a unor intoxicaţii, boli infecţioare sau accidente transfuzionale, policitemie. Alterarea capacităţii funcţionale hepatice. Bolile hepatice au drept consecinţă alterarea capacităţii funcţionale a ficatului. Urobilinogenul ce intră prin vena portă nu este complet metabolizat şi se elimină ca atare la nivel renal. Această alterare se întâlneşte în următoarele situaţii: hepatite virale, hepatite cronice, ciroză hepatică, intoxicaţii cu lezarea parenchimului hepatic, tumori hepatice. Scurtcircuitul hepatic. În unele situaţii patologice (de exemplu, în ciroza hepatică cu hipertensiune portală, tromboză de venă portă, ocluzia venei hepatice) fluxul sangvin la nivelul venei porte este redus iar o parte din urobilinogen trece direct în sânge fiind excretat renal. Absenţa urobilinogenului din urină. Urobilinogenul este absent în urină în situaţia producţiei insuficientă de bilă de către celulele hepatice, alterarea capacităţii de secreţie a bilei în intestin şi absenţa reducerii bilirubinei la nivel intestinal. Cauze: obstrucţia completă a ductului biliar comun în absenţa infecţiei de tract biliar, stoparea completă a producţiei de bilă de către ficat (hepatite virale severe, intoxicaţii cu afectare hepatică severă), absenţa florei intestinale (fiziologică la nou-născuţi şi întâlnită rar după un tratament antibioterapic intensiv). -

i) Bilirubina Principiu Reacţia se bazează pe cuplarea bilirubinei cu o sare stabilă de diazoniu (2,6diclorobenzendiazoniu difluoroborat) în mediu acid cu formarea unui derivat azo de culoare violet. Cl N+ N Cl Sare de diazoniu

Surse de eroare

BF4- + Bilirubina

Mediu acid

Compus azo (violet)

sensibilitatea este alterată de cantităţi mari de acid ascorbic sau nitriţii din urină. - rezultate fals negative se întâlnesc în următoarele condiţii: timpul îndelungat scurs de la recoltare până la efectuarea testului şi expunerea probei la lumină determină oxidarea bilirubinei. - rezultatele fals pozitive se pot datora medicaţiei care colorează urina în roşu sau prezintă o culoare roşie în mediu acid (de exemplu, fenazopiridina). Semnificaţii clinice Ca rezultat al conjugării (esterificării) cu acid glucuronic, bilirubina devine hidrosolubilă şi astfel susceptibilă de a fi excretată renal. Bilirubina prezentă în urină este întotdeauna bilirubină conjugată (directă). În toate procesele patologice în care avem o creştere a concentraţiei bilirubinei conjugate în plasmă, avem şi nivele considerabile ale bilirubinei urinare. Bilirubina conjugată este prezentă în cantităţi mari în plasmă în următoarele situaţii: creşterea presiunii intracanaliculare datorită obstrucţiei intra- sau extrahepatice, inflamaţie sau fibroză periportală, necroză hepatică. -

j) Hematiile (eritrocitele) Principiu: Testul se bazează pe activitatea de tip peroxidazic al hemoglobinei şi mioglobinei care catalizează oxidarea unei substanţe indicator (3,3’,5,5’tetrametilbenzidină) de către un hidroperoxid organic (2,5-dimetilhexan-2,5hidroperoxid) conducând la un compus verde-albastru. Există două scale pentru determinarea hemoglobinei şi a eritrocitelor libere. Sensibilitatea testului este de 5 eritrocite/µl ceea ce corespunde la 0,015 mg hemoglobină/dl urină. Această sensibilitate mare este dată de adăugarea unui activator în amestecul de reacţie. + H2N

OOH

NH2 + Hemoglobina

OOH 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina

2,5-dimetilhexan 2,5-dihidroperoxid

+ OH

-

Compus verde-albastru

OH

Surse de eroare prezenţa vitaminei C nu interferă cu reacţia de pe strip. o concentraţie a nitriţilor de peste 2,2 mmol/L (10 mg/dl) (valori foarte rar întâlnite în infecţiile de tract urinar) scade sensibilitatea reacţiei. nu se recomandă conservarea urinei cu formol deoarece conduce la rezultate fals negative rezultate fals pozitive se pot obţine dacă urina conţine urme de detergenţi oxidanţi proteinuria peste 5 g/L (500 mg/dl) poate atenua reacţia de culoare a hemoglobinei. Semnificaţii clinice

Hematuria, excreţia eritrocitelor în urină, este întâlnită în multe situaţii patologice şi din acest motiv este necesară clarificarea originii sângerării. În această situaţie, cele mai multe date sunt oferite de examinarea morfologiei hematiilor din sedimentul urinar. Cauzele hematuriei: - calculii renali. Prezenţa lor provoacă dureri colicative renale acute însoţite adesea de hematurie. - tumori ale tractului urinar. Microhematuria de cauză neprecizată ca manifestare unică de boală este adesea de origine tumorală, deoarece majoritatea tumorilor sunt asimptomatice o perioadă lungă de timp. - glomerulonefritele. În acest caz hematuria adesea microscopică, este însoţită de proteinurie şi hipertensiune arterială. Dismorfismul eritrocitar are, în acest caz, un rol diagnostic important. - pielonefritele în care hematuria este prezentă doar la o treime din pacienţi. Metode clasice utilizate la examenul biochimic al urinei Unele laboratoare utilizează încă unele metode de determinare a câtorva parametrii biochimici ai urinei a) Densitatea urinară Densitatea urinei se determină cu urodensimetrul folosind un eşantion din urina colectată în 24 de ore. Urodensimetrul este un densimetru etalonat pentru determinarea densităţii de lichide cuprinse între 1,000-1,060 g/cm 3 la 15°C. De aceea, în cazul în care determinarea densităţii urinei se face la altă temperatură şi urina conţine glucoză este necesară corectarea ei. Corectarea se face folosind tabelul Buchardat. Mod de lucru Într-un cilindru gradat de 50 ml se aduc aproximativ 40 ml urină evitând formarea spumei; dacă spuma totuşi s-a format, ea se îndepărtează cu o hârtie de filtru. Se cufundă apoi urodensimetrul în cilindrul cu urină, iar când acesta nu mai oscilează se citeşte densitatea corespunzătoare diviziunii de pe tija aflată la suprafaţa urinei, având grijă ca urodensimetrul să nu fie lipit de pereţii cilindrului. b) pH-ul urinar Determinarea pH-ului cu hârtie indicator Reactivi: - pachete cu benzi de hârtie şi o scala de culori corespunzătoare. Mod de lucru Se introduce în urina proaspăt emisă, timp de 1-2 secunde o bandă de hârtie indicator universal. După 30 de secunde se stabileşte valoarea pH-ului comparând culoarea hârtiei cu cea a scalei de culori care însoţeşte pachetul. c) Proteinele Recunoaşterea globală a proteinelor din urină Apariţia proteinelor în urină se evidenţiază prin precipitarea lor sub acţiunea unor agenţi de precipitare ca: acidul sulfosalicilic, picric, acetic etc. Mai folosit este primul pentru că: - este foarte sensibil, reuşind să deceleze cele mai fine urme de proteine prezente; - precipită toate tipurile de proteine, cu excepţia peptonelor; - reacţia are loc la rece.

Proba cu acid sulfosalicilic Principiu În prezenţa proteinelor existente în urină, acidul sulfosalicilic determină apariţia unei turbidităţi sau chiar a unui precipitat, în funcţie de proteinurie. Reactivi Acid sulfosalicilic 20%. Mod de lucru Într-o eprubetă se măsoară aproximativ 3 ml urină, centrifugată, peste care se toarnă 2-3 picături de acid sulfosalicilic. Se agită şi se urmăreşte apariţia turbidităţii pe un fond negru, în comparaţie cu o eprubetă care conţine numai urină. Rezultat - urina rămâne limpede: lipsesc proteinele în urină, rezultat negativ (-); - urina prezintă opalescenţă uşoară = urme de proteine (±): - opalescenţă evidentă = pozitiv (+); - opalescenţă intensă = pozitiv (++); - precipitat uşor = intens pozitiv (+++): - precipitat granular sau cazeinos abundent = intens pozitiv (++++). Cauze de eroare Unele medicamente, aflate în urină, pot da cu acidul sulfosalicilic o opalescenţă mai mult sau mai puţin intensă. Recunoaşterea albuminelor termosolubile (Bence-Jones) Mod de lucru Într-o eprubetă se încălzesc 10 ml urină la temperatura de 60°C. Prezenţa albuminei termosolubile se manifestă prin apariţia unui coagul sau a unei tulbureli, care dispare dacă ridicăm temperatura. Natura chimică a albuminelor tip BenceJones este diferită. Determinarea proteinelor din urină (Metoda Esbach) Reactivi Reactiv de precipitare: 10 grame acid picric şi 20 grame acid citric se dizolvă în apă şi se aduc la un volum final de 1000 ml. Mod de lucru În albuminometrul Esbach se toarnă urina filtrată până la semnul U şi reactiv până la semnul R. Se amestecă şi se lasă în repaus 24 de ore, după care se citeşte înălţimea precipitatului depus. Gradaţiile albuminometrului indică direct grame de proteine/1000 ml urină. Dacă urina are o densitate mai mare de 1,008, se va dilua cu apa de două ori, iar pentru densitatea de 1,020 se va dilua de 3 ori. Rezultatele obţinute se înmulţesc cu diluţia. În unele cazuri, albumina precipitată nu se depune la fundul tubului. Ea rămâne în suspensie. În aceste cazuri avem de-a face cu albumina neretractibilă descrisă de Bouchardat. d) Glucidele Recunoaşterea glucidelor reducătoare Toate glucidele eliminate au proprietăţi reducătoare faţă de anumiţi reactivi care conţin săruri de cupru, argint sau bismut, datorită prezenţei în molecula lor a unei funcţiuni carbonilice libere. Excepţie face zaharoza, care are funcţiunile carbonilice blocate, dar prin hidroliză eliberează produşi cu acţiune reducătoare. Reducerea reactivilor poate fi dată şi de alte substanţe cu caracter reducător conţinute în urina, motiv pentru care este normal să se indice existenţa corpilor reducători.

Metoda Botger-Nylander Principiu Azotatul bazic de bismut, în mediu alcalin, la cald este redus de către un glucid reducător la bismut metalic de culoare neagră: 100°C Bi(OH)2NO3 + NaOH Bi(OH)3 + NaNO3

2Bi(OH)3 + 3 H

C

(H

C

O OH )4

CH2

OH

2Bi + 3 COOH + 3H2O (H

C CH2

OH )4 OH

Reactivi 1. Reactiv Nylander: - Hidroxid de sodiu 100 g; - Sare Seignette (tartrat dublu de sodiu şi potasiu) 40 g; - Azotat bazic de bismut 20 g, - Apă distilată ad. 1000 ml. Mod de lucru Se măsoară într-o eprubetă un ml urină şi o picătură de reactiv Nylander. Se menţine eprubeta, în baia de apă la fierbere, timp 5 minute. Apariţia unui precipitat negru indică un rezultat pozitiv. Pot apărea rezultate fals pozitive datorită apariţiei unui precipitat negru de sulfură de bismut produs de aminoacizi cu sulf din albuminele urinare. În aceste cazuri se repetă proba cu un reactiv cu sulfat de cupru (Benedict). Reacţia este sensibilă şi are valoare diagnostică deosebită când rezultatul este negativ.

Metoda Benedict (semicantitativă) Principiu Monozaharidele, în mediu alcalin, la cald, reduc sărurile cuprice complexate la oxidul cupros roşu-cărămiziu. Complexarea ionilor de cupru în mediu alcalin (pentru a împiedica formarea hidroxidului cupric) se face cu citrat de sodiu. Reactivi Reactiv Benedict: - Citrat de sodiu 173 g - Carbonat de sodiu anhidru 100 g - Sulfat de cupru 17,3 g - Apă distilată ad 1000 ml Mod de lucru Într-o eprubetă se măsoară: un ml reactiv Benedict şi o picătură urină. Se menţine eprubeta în baia de apă la fierbere, timp de 5 minute. Rezultat Modul în care este interpretată reacţia este redat în tabelul următor: Culoarea Neschimbată

Citirea reacţiei negativ

Concentraţia glucidului (g/1000 ml) 0

Verde fără precipitat Verde cu precipitat Verde măsliniu Portocaliu Roşu-cărămiziu

+ + ++ +++ ++++

0,2-0,3 0,5 1,0 1,5 peste 2,0

Deoarece reacţia de reducere este dată şi de alte glucide în afară de glucoză, pentru a stabili exact natura glucidului identificat, se utilizează reacţia cu fenilhidrazină sau o reacţie enzimatică. e) Corpi cetonici Reacţii de recunoaştere La recunoaşterea lor se folosesc reacţiile de culoare pe care acidul acetilacetic şi acetona le dau cu: nitroprusiatul de sodiu, aldehida salicilică, clorura ferică. Redăm în continuare câteva modalităţi de recunoaştere a corpilor cetonici bazate pe reacţia de culoare cu nitroprusiatul de sodiu. Reacţia Legal-Imbert Principiu Corpii cetonici menţionaţi reacţionează cu reactivul Legal-Imbert în prezenţa amoniacului, dând naştere unui produs de culoare violetă. Reactivi 1. Reactiv Legal-Imbert (nitroprusiat de sodiu 5 g, acid acetic glacial 50 ml, completare cu apă distilată la 100 mI). Se conservă în sticle brune. 2. Amoniac concentrat 25%. Mod de lucru Într-o eprubetă se aduc 2-3 ml urină filtrată şi 4-6 picături de reactiv LegalImbert şi se omogenizează. Pe pereţii eprubetei se prelinge circa un ml de amoniac 25%, în aşa fel ca acesta să formeze un strat superior, apoi se lasă în repaus 15 minute. Urina normală nu dă nici o reacţie. În prezenţa corpilor cetonici apare un inel violet la limita de al celor două straturi de lichide. Reactivi sub forma solidă Deoarece reactivul Legal-Imbert, aflat sub formă de soluţie, se alterează cu timpul, poate fi înlocuit cu reactivi în stare solidă care, sub formă de pulbere sau de pastile, sunt mai stabili. a. Reactivul sub formă de pulbere. Se obţine prin amestecarea următoarelor substanţe în proporţiile indicate (nitroprusiat 0,5 g, sulfat de amoniu 10,0 g, carbonat de sodiu anhidru 10,0 g) Mod de lucru Pe o placă de porţelan se pune un vârf de spatulă de pulbere peste care se adaugă 2-3 picături de urină şi se amestecă cu o baghetă sau cu colţul unei lame de microscop. Dacă urina conţine corpi cetonici apare o culoare violetă mai mult sau mai puţin intensă. În absenţa corpilor cetonici culoarea violetă nu apare. b. Reactiv sub formă de pastilă. Se găseşte în comerţ, sub denumirea de "acetotest", însoţit de modul de lucru, care fiind foarte simplu, poate fi efectuat chiar de către bolnavul neinternat în spital. Mod de lucru Într-o eprubetă se introduc aproximativ 5 ml de urină proaspătă peste care se adaugă pastila şi se aşteaptă câteva minute. Prezenţa corpilor cetonici face ca

pastila să se coloreze în violet, cu nuanţe şi intensităţi de culoare dependente de cantitatea de corpi cetonici. Cauze de eroare La concentraţii mari şi creatinina dă, în aceleaşi condiţii, culoare violetă. Importanţa diagnostică a reacţiei În mod curent, în stările de acidocetoză, eliminarea corpilor cetonici în urină creşte apreciabil. Această situaţie se întâlneşte în afecţiuni care cresc cetogeneza hepatică sau scad utilizarea corpilor cetonici în ţesuturile extrahepatice (ţesut muscular, rinichi) şi anume: efort muscular intens, inaniţie sau regim alimentar dezechilibrat (bogat în lipide şi proteine, sărac în glucide); tulburări gastrointestinale acute sau cronice, în special la copii (dispepsie acută, toxicoză); vărsături accentuate de sarcină, diabet zaharat. f) Urobilinogenul În urina normală, urobilinogenul se află în cantităţi mici dar decelabile; lipseşte sau apare crescut în stări patologice. Recunoaşterea urobilinogenului cu reactiv Ehrlich Principiu Urobilinogenul se condensează cu p-dimetilaminobenzaldehida în mediu acid dând naştere unui produs de culoare roşie. Reactiv Ehrlich Se dizolvă 2 g p-dimetilaminobenzaldehida în 100 ml acid clorhidric 20 %. Mod de lucru Într-o eprubetă se aduc aproximativ 2 ml urină proaspătă (dar rece) şi 1-2 picături de reactiv Ehrlich; dacă nu apare imediat o coloraţie roşie se încălzeşte la flacără sau în baia de apă. Rezultate: Urobilinogenul normal: coloraţia roşie nu apare decât prin încălzire. Urobilinogenul crescut: coloraţia roşie apare chiar la rece (temperatura camerei). Urobilinogen absent: coloraţia roşie nu apare nici la cald. Urobilinogenul are valori crescute în icterul hemolitic şi parenchimatos (hepatic), tumori maligne hepatice, steatoza hepatică, abces hepatic şi lipseşte în icterele mecanice (prin obstrucţie). g) Pigmenţii sanguini din urină pot fi reprezentaţi de hemoglobina liberă şi cea conţinută în eritrocite. În primul caz, în sedimentul urinar nu sunt prezente hematii, în cel de-al doilea caz, în sedimentul urinar apar structuri hematice. Reacţii de recunoaştere Recunoaşterea pigmenţilor sanguini se poate face spectroscopic sau prin reacţii chimice. Spectral, hemoglobina se recunoaşte prin benzile caracteristice pe care le prezintă, iar chimic prin activitatea sa pseudoperoxidazică, ce o exercită asupra apei oxigenate. Metoda descrisă mai jos mai are aplicabilitate practică doar pentru examenul scaunului pentru decelarea hemoragiilor oculte Metoda Adler Principiu Hemoglobina descompune H202 cu eliberare de oxigen atomic, care oxidează benzidina la un compus de tip chinoidinic. Acesta, condensându-se cu o nouă moleculă de benzidină, formează albastrul de benzidină. Reactivi

benzidină pură; acid acetic glacial: apă oxigenată 3 g/100 ml (12 ml perhidrol/100 ml). Mod de lucru Într-o eprubetă se introduc câteva cristale de benzidină, 5-10 picături de acid acetic glacial şi se agită până la dizolvare completă. Apoi se adaugă 1-2 ml urină, câteva picături de apă oxigenată şi se agită pentru omogenizare. În prezenţa pigmenţilor sanguini apare o culoare verde care trece în albastru. -

-

3. Examenul microscopic al sedimentului urinar Mod de lucru: Într-o eprubetă de centrifugă se introduc aproximativ 10 ml de urină care se centrifugează 10 minute la 2000 rotaţii/minut. se aruncă supernatantul şi se efectuează un preparat nativ (între lamă şi lamelă) pe o lamă 76 x 26 mm se pune o picătură din sedimentul urinar se acoperă cu o lamelă 20 x 20 mm se examinează la microscop cu obiectivul 20X şi apoi cu 40X. Ocularele recomandate sunt cele de 10X Clasificarea sedimentului urinar: • sedimentul urinar organizat • sedimentul urinar neorganizat a) Sedimentul urinar organizat cuprinde:

1) Celulele sedimentului urinar Leucocitele sunt cele mai frecvent întâlnite elemente de sediment. Majoritatea sunt reprezentate de granulocitele neutrofile; mai rar, se întâlnesc şi alte tipuri de leucocite:eozinofile, monocite, macrofage, limfocite, histiocite. Valori normale: < 5 celule/câmp de putere mare (obiectiv 40X) Leucocitele se prezintă în urină sub formă de globule sferice granulate, cu un nucleu de formă şi mărime diferită. Pe preparatele necolorate nu se poate face distincţia între diferitele tipuri de leucocite dar pot fi identificate cu coloraţii specifice. Nu există întotdeauna o concordanţă între numărul de leucocite/câmp şi gravitatea leziunilor inflamatorii. Hematiile. În sedimentul proaspăt hematiile apar ca nişte discuri biconcave, cu diametrul mediu în jur de 6 µm; în urinile concentrate hematiile încep să se ratatineze. Valori normale: < 5 celule/câmp de putere mare (obiectiv 40X) În funcţie de aspectul morfologic al hematiilor, putem diferenţia o sângerare de origine glomerulară de una neglomerulară. - dacă avem de-a face cu o sângerare neglomerulară, hematiile vor fi eumorfe - dacă sângerarea este glomerulară hematiile eumorfe vor deveni dismorfe. Aceste modificări apar prin reversibilitatea sau ireversibilitatea răspunsului faţă de varietatea influenţelor pH-ului urinar, hipertonicităţii medularei renale sau prezenţa acizilor graşi, lizolecitinei, acizilor biliari şi eventual a barbituricelor şi salicilaţilor. Celulele epiteliale ale căilor urinare sunt de obicei absente sau rare într-un sediment normal. Aspectul acestor celule diferă mult de cel al ţesutului de origine. Datorită pierderii legăturilor tisulare, ele adoptă o formă rotundă şi prezintă diferite

tipuri de transformări degenerative deoarece celulele moarte nu pot rezista atacului osmotic al urinei. În funcţie de originea lor, există 3 tipuri de celule epiteliale 1. Celulele scuamoase care de obicei nu provin din tractul urinar ci de la nivelul tractului genital, şi rareori sunt semnificative . 2. Celulele tubulare renale provin de la nivelul tubilor renali şi apar în afecţiunile care interesează parenchimul renal. 3. Celulele tranziţionale (uroteliale) provin de la nivelul uroteliului care căptuşeşte tractul urinar de la bazinet până la prima porţiune a uretrei; apar în urină atunci când avem de-a face cu un proces inflamator urotelial. 2) Cilindrii urinari sunt formaţiuni cilindrice bine conturate, cu capetele rotunde sau rupte care se formează la nivelul tubului contort distal şi colector. Proteinele sangvine care trec prin membrana glomerulară lezată se coagulează şi se mulează pe tubii uriniferi. Proteina Tamm-Horsfall (o glicoproteină secretată de către braţul gros ascendent al ansei Henle) reprezintă substanţa fundamentală a cilindrilor. Tipuri de cilindri urinari: 1. Cilindrii hialini sunt formaţi în absenţa celulelor în lumenul tubilor şi conţin numai proteină Tamm-Horsfall, ceea ce la conferă un indice de refracţie scăzut. Aceşti cilindrii nu indică o afectare renală atunci când sunt prezenţi în număr mic. 2. Cilindri granuloşi au suprafaţa acoperită cu granulaţii care au forme şi mărimi diferite. Aceşti cilindri sunt consideraţi o formă de degenerare a cilindrilor celulari. 3. Cilindri ceroşi se numesc astfel deoarece au un aspect asemănător cu ceara topită. În condiţiile unui flux urinar scăzut, un cilindru va rămâne mai mult timp în interiorul tubilor, luând un aspect ceros. Prezenţa acestora indică întotdeauna o afectare tubulară de natură cronică, şi, spre deosebire de cilindri hialini şi granuloşi, au întotdeauna o semnificaţie patologică. 4. Cilindri celulari apar la pacienţii ce prezintă o scădere a perfuziei renale şi indică întotdeauna o afectare tubulară acută, dar nu indică extinderea sau reversibilitatea acestei afectări. b) Sedimentul urinar neorganizat cuprinde: 1) Cristalele. Urina este un mediu complex care influenţează procesul de cristalizare, aceeaşi substanţă putând cristaliza în diferite forme dependent de compoziţia urinii. Studiul cristalelor se efectuează atât în microscopie obişnuită cât şi în lumină polarizată. Cristalele se exprimă sub formă de: rare, prezente, frecvente, semnalându-se de asemenea prezenţa de macrocristalelor sau a microcristalelor. Principalele cristale întâlnite în sedinmentul urinar sunt: 1. Cristalele de acid uric. În microscopia optică obişnuită cristalele de acid uric se prezintă sub formă de „butoiaş” sau „lămâie” având o culoare galben-brună; în microscopia cu lumină polarizată aceste cristale sunt intens birefringente având o paletă largă de culori, de la albastru-verzui la roşu sau galben, în funcţie de grosimea lor. 2. Cristalele de oxalat de calciu sunt slab birefringente şi se prezintă sub două forme: dihidrat sau „plic de scrisoare” şi monohidrat sau „trunchi de copac”, 3. Cristalele de fosfat amoniaco-magnezian apar adesea în urinile vechi şi conservate necorespunzător datorită fermentaţiei amoniacale bacteriene. Prezenţa lui în urina proaspătă de dimineaţa semnifică o infecţie urinară. Este birefringent şi are un aspect de „capac de sicriu”.

2) Bacteriile şi levurile. Prezenţa lor semnifică o infecţie urinară şi în majoritatea cazurilor sunt însoţite şi de o reacţie leucocitară. Buletin de analiză Rezultatele examenului sumar de urină se înscriu într-un Buletin de analiză ca în modelul alăturat. Un buletin de analiză care dă relaţii normale privind examenul sumar de urină se prezintă astfel: Densitate................................. 1,015 g/ml pH................. ............................ 5 Nitriţi.......................................... absent Proteine................................... absent Glucoza................................... absent Corpi cetonici........................... absent Urobilinogen............................ normal Bilirubină.................................. absent Sediment: 1-2 hematii/câmp, 1-2 leucocite/câmp, rare epitelii plate de tip scuamos.