Helicobacter Point 2el3p

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS (Universidad del Perú, Decana de América) FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MEDICA LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA

“VALIDEZ DIAGNÓSTICA DE LAS TINCIONES HEMATOXILINA-EOSINA, GIEMSA Y TRIPLE DE EL-ZIMAITY EN LA IDENTIFICACIÓN HISTOLÓGICA DE HELICOBACTER PYLORI EN BIOPSIAS GÁSTRICAS”. HOSPITAL CENTRAL DE LA FUERZA AÉREA DEL PERÚ (HCFAP) ABRIL - AGOSTO DE 1 999

AUTORES : Bach. RODRIGUEZ ZAMORA, CHRISTIAN

Bach. ROMERO VALVERDE, CARLOS

INTRODUCCION

INTRODUCCION La infección por Helicobacter pylori (H. pylori) desempeña un papel fundamental en el desarrollo de diversas enfermedades digestivas (gastritis, úlcera péptica y cáncer), por lo que su identificación representa un tema relevante.

Antecedentes : • • • • • • •

1893, Bizzozero 1906, Kreintz y col (cáncer gástrico) 1938, Doenges 1940, Friedberg y Barrón (úlcera gástrica) 1954, Palmer 1975, Steer y Colin Jones (coloración gram) 1983, Warren y Marshall *

* “ Segundo International Workshop in Campylobacter infection”

Helicobacter pylori Aspectos generales: • Microorganismo gramnegativo , microaerófilo , ligeramente curvado y espirilar, mide de 0.5-1 um x 2.5- 4 um. • Muy móvil (3 a 7 flagelos), con una notable capacidad de producir enzimas, en particular la ureasa (más abundante). • Reservorio natural: estomago humano. • Mecanismos de transmisión posible: oral-oral (poco frecuente) y fecal oral (vía principal)

• En la actualidad, se sabe que más de la mitad de la población mundial está infectada con este microorganismo.

• En nuestro medio se ha reportado que el 50% de los niños de bajo nivel socio económico y al menos el 75% de adultos están infectados con esta bacteria. • Los métodos diagnósticos de la infección por H.pylori se dividen tradicionalmente en invasivos y no invasivos. Los primeros se basan en la demostración “directa” del microorganismo mediante el estudio de muestras obtenidas por biopsia gástrica. Son, por tanto, técnicas que

DISTRIBUCION A NIVEL MUNDIAL

precisan una endoscopia y, por ello , resultan agresivas para el paciente. Los métodos indirectos se basan en el estudio y la detección de ciertas características de la bacteria (test de aliento, serología y técnicas de biología molecular).

Histología La histología es un método invasivo importante que tiene la gran ventaja frente a los demás métodos de proporcionar simultáneamente información precisa sobre sobre los cambios morfológicos de la mucosa gástrica y en la identificación de H. pylori. Para ello se utilizan técnicas de tinción, unas son simples y por lo tanto fáciles de realizar y otras son más complejos . Ninguna de las tinciones es específica para H. pylori, pero si permiten identificarlo reconociendo sus características y localización.

Warthin Starry • Disponible desde 1920 para la coloración de espiroquetas en secciones histolólgicas. • Esta técnica se basa en la impregnación de las sales de plata (AgNO3) en un pH ácido, y su posterior revelado sobre la superficie de la bacteria, que resultan más engrosados y de negro. • Es una técnica muy buena para visualizar H. pylori, pero es relativamente complicada de realizar, es laboriosa y tiene un elevado costo por el tipo de reactivos utilizados.

Giemsa • Es útil para la demostración de muchos microorganismos patógenos, no solamente en los frotis, sino también en los cortes de tejido. • Esta tinción especial emplea como colorante fundamental una mezcla de derivados tiacínicos catiónicos (Azur A, Azur B y azul de metileno) y de eosina colorante de carácter aniónico . • Se basa en la disociación de la sales de eosinato, donde la eosina es liberada y colorea estructuras acidófilas (citoplasma) y los derivados del azur colorean las estructuras de carácter basófilo como por ejemplo el RNA y DNA presentes en protoplasma de la bacteria (H.pylori) ,visualizándose de color azul.

Hematoxilina-eosina • Es la técnica más utilizada para el diagnóstico de las muestras incluídas en parafina. • Consta de una fase inicial en el que se colorean los núcleos celulares con la hematoxilina y una fase ulterior de contraste citoplasmático y de los componentes extracelulares con la eosina. Con esta tinción H. pylori es ligeramente basófilo. • Su principal ventaja consiste en que permite el diagnóstico y la graduación de la lesión histológica asociada. Además es una técnica fácil de realizar y que no añade costos y tiempo al procesamiento habitual de las biopsias gástricas.

Triple de EL-Zimaity • Desarrollada por El-Zimaity y cols. En 1998. Es una técnica de tinción triple , basada en la utilización de la Carbol fucsina, alcian blue y H-E. • La coloración bacteriana con carbol-fucsina requiere un paso previo de oxidación con peróxido de hidrógeno, formando grupos aldehidos con los carbohidratos de la pared bacteriana, los que forman bases de Schiff con las aminas terciarias del colorante. • El alcian blue de pH 2.5 permite colorear mucopolisacaridos ácidos sulfatados presentes en el mucus de una metaplasia intestinal a nivel gástrico.

• La tinción de H-E, nos permite realizar una descripción histológica de la morfología gástrica.

• Se han propuesto otras muchas técnicas con diferentes resultados , como la tinción de Brown-Hops, Diff Quick, Waysson, entre otras. • Constituyéndose en un constante reto para el profesional del laboratorio de procedimientos histológicos (histotecnólogo) la validación de las técnicas especiales de coloración, existentes y disponibles para escoger entre las más convenientes dentro de los criterios costo beneficio.

Objetivo • Determinar la validez diagnóstica (sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y negativos) de las tinciones Hematoxilina-eosina, Giemsa y Triple de EL-Zimaity en la identificación de H.pylori en biopsias gástricas, comparándolas con la tinción de plata de Warthin Starry como prueba de oro.

MATERIAL Y METODOS

DISEÑO DE INVESTIGACION: Estudio retroprospectivo , transversal y analitico .

POBLACION: Biopsias gástricas incluídas en parafina (tacos), de 133 casos previamente evaluados con H-E, obtenidos del archivo de patología del Hospital Central FAP, entre Abril y Agosto de 1 999.

CRITERIOS DE INCLUSION: • Biopsias gástricas con diagnóstico histopatológico e identificación de H. pylori. • Biopsias gástricas con datos de edad y sexo.

CRITERIOS DE EXCLUSION: • Casos con dos o más inclusiones de biopsia gástrica. • Biopsias gástricas mal procesadas(respecto a la fijación) • Inclusiones con escasa cantidad de tejido.

PROCEDIMIENTO OPERATIVO : • Recolección • Coloración

• Codificación al azahar • Lectura

RECOLECCIÓN: Se seleccionaron consecutivamente 133 biopsias gástricas incluídas en parafina, de las cuales se obtuvieron secciones histológicas seriadas de 3 um. , para cada una de las tinciones (Giemsa, Triple de ElZimaity y Warthin Starry) y se rotularon con el código de rutina respectivo

COLORACION: Se ensayaron previamente cada uno de los protocolos de tinción con láminas positivas a H. pylori (estandarización) estableciéndose los tiempos adecuados de tinción y en algunos casos la proporción de reactivos a emplear.

PROCEDIMIENTOS DE TINCIÓN GIEMSA 1. Desparafinar los cortes en xilol por 5’

2. Hidratar desde alcohol absoluto (5’), alcohol corriente(5’ c/u) hasta agua destilada. 3. Cubrir con la solución de trabajo de Giemsa por 15’. 4. Enjuagar en agua destilada 5. Diferenciar en ácido acético 1o/oo y enjuagar inmediatamente en agua destilada*. 6. Deshidratar a medio ambiente o en estufa a 60 oC.

7. Sumergir en xilol y montar en bálsamo de Canadá. * Estandarización: No se utilizó por que decolora a la bacteria.

TRIPLE DE EL-ZIMAITY (Carból fucsina/Alcian blue/Hematoxilina-eosina) 1. Desparafinar e hidratar en agua destilada . 2. Oxidar con peróxido de hidrógeno al 15% por 30’. 3. Lavar en agua corriente y luego colorear con Carból fucsina recien preparada por 2’. 4. Lavar en agua corriente por 2’. 5. Colorear con Alcian blue al 3% en ácido acético pH 2.5 ; por 3’. 6. Lavar en agua corriente. 7. Teñir con hematoxilina de Gill’s por 5’.*

8. Lavar en agua corriente 9. Lavar en agua amoniacal 0.25%.

10. Teñir con eosina por 3’. 11. Lavar en agua corriente 12. Deshidratar con alcohol absoluto, aclarar en xilol y luego montar.

*Estandarización: • En el paso 2, de la técnica original se utilizó peróxido de hidrógeno al 30% . • En el paso 3, llevamos a 3’ el tiempo de coloración • En el paso 5, la solución Alcian blue se le midió el pH con papel indicador y el tiempo de coloración fue de 2’. • En el paso 7, se utilizó Hematoxilina de Harris, obteniéndose similares resultados . • En el paso 9, se utilizó agua carbonatada al 1%.

WARTHIN STARRY 1 Desparafinar en xilol e hidratar hasta agua destilada. 2. Lavar en solución tampón.

3. Impregnar en solución de plata al 1% (recien preparada) durante 1 h. a 60 oC. 4. Desarrollar (revelar) las secciones en solución de trabajo por 3’ a 60 oC.* 5. Lavar en solución tampón.* 6. Deshidratar, aclarar y montar * Estandarización:

• En el paso 4, el tiempo de revelado se redujo a la mitad. • En el paso 5, se utilizó agua destilada a 37 oC.

CODIFICACION AL AZAHAR. Las láminas teñidas con Giemsa y Triple de El-Zimaity se codificaron al azahar con las letras A y B respectivamente, seguida por tres dígitos entre 001 y 133. Las láminas teñidas con Warthin Starry mantuvieron sus códigos con los que fueron originalmente rotuladas. LECTURA. Las lámionas teñidas con Giemsa, Triple de El - Zimaity y Warthin Starry fueron leídas en ese orden por un médico patólogo (lectura a ciegas) . La lectura microcópica se realizó a 100 y 400 aumentos, reportándose la presencia de ésta bacteria como H. pylori positivo (Hp +) y su ausencia, como H. pylori negativo (Hp-).

ANALISIS ESTADISTICO PRUEBA DE ORO PRESENTE

AUSENTE

+

a (verdadero +)

b (falso +)

-

c (falso -)

d (verdadero

a+c

b+ d

TEST

S : a / a+c

VPP : a / a + b

E : d / b +d

VPN : d / d+ c

-)

RESULTADOS

TABLA 2 : PORCENTAJE DE CASOS CASOS POSITIVOS IDENTIFICADOS CON LAS CUATRO TINCIONES HISTOLOGICAS. HCFAP ABRIL-AGOSTO 1999. TINCION HISTOLOGICA

POSITIVOS (CASOS)

PORCENTAJE (%)

WARTHIN STARRY

95

71.43

GIEMSA

93

69.92

TRIPLE DE ELZIMAITY

77

57.89

HEMATOXILINA EOSINA

67

50.38

N° DE CASOS

GRAFICO N°1 : NUMERO DE CASOS POSITIVOS Y NEGATIVOS A H. PYLORI SEGÚN LAS CUATRO TINCIONES HISTOLOGICAS. HCFAP. ABRIL-AGOSTO DE 1999. 100

95

93 77

67

56

50 0

38

Warthin Starry

66

40

Giemsa

Triple de ELZimaity

Hematoxilina Eosina

TINCIONES HISTOLOGICAS

Positivo

Negativo

GRAFICO N° 2: PORCENTAJE DE CASOS POSITIVOS Y NEGATIVOS A H. PYLORI SEGUN LA TINCION DE WARTHIN STARRY. HCFAP. ABRIL-AGOSTO 1999

71.43% (n=95)

28.57% (n=38) Casos positivos

Casos negativos

GRAFICO N° 3 : PORCENTAJE DE CASOS POSITIVOS Y NEGATIVOS A H. PYLORI SEGÚN LA TINCION GIEMSA. HCFAP ABRIL-AGOSTO 1999

30.08% (n=40)

Casos positivos

69.92% (n=93)

Casos negativos

GRAFICO N° 4: PORCENTAJE DE CASOS POSITIVOS Y NEGATIVOS A H. PYLORI SEGÚN LA TINCIÓN TRIPLE DE EL-ZIMAITY. HCFAP. ABRIL-AGOSTO 1999.

42.11% 57.89%

Casos positivos

Casos negativos

GRAFICO N° 5: PORCENTAJE DE CASOS POSITIVOS Y NEGATIVOS A H. PYLORI SEGÚN LA TINCIÓN DE HEMATOXILINA -EOSINA. HCFAP ABRIL-AGOSTO 1999

49.62%

Casos positivos

50.38%

Casos negativos

TABLA 3 : VALIDEZ DIAGNOSTICA DE LAS TINCIONES HISTOLOGICAS EN ESTUDIO. HCFAP ABRIL-AGOSTO 1999

TINCION HISTOLOGICA

VALIDEZ DIAGNOSTICA S(%)

E (%)

VPP(%)

VPN (%)

WARTHIN STARRY

97.89

100%

100

95

GIEMSA

96.84

97.36

98.92

92.5

TRIPLE DE EL ZIMAITY

81.0

97.36

98.71

67.27

HEMATOXILIN A EOSINA

68.42

94.73

97.10

54.54

GRAFICO N° 6: NUMERO DE CASOS POSITIVOS Y NEGATIVOS A H. PYLORI EN LAS PATOLOGIAS GASTRICAS HALLADAS. HCFAP ABRIL-AGOSTO 1999. 50 41

N° DE CASOS

50

40 30

22 16

20 10

1

1

1

GCAtf

MI

ACG

1

0 GC

GCA

DIAGNOSTICO HISTOPATOLOGICO

POSITIVO

NEGATIVO

TC

GRAFICO N° 7: PORCENTAJE DE LAS PATOLOGIAS GASTRICAS POSITIVAS A H. PYLORI. HCFAP ABRIL-AGOSTO 1999.

GASTRITIS CRONICA ACTIVA 53%

GASTRITIS CRONICA 43% TUMOR CARCINOIDE 1% ADENOCARCINOMA GASTRICO 1%

GASTRITIS CRONICA ATROFICA 1% METAPLASIA INTESTINAL 1%

ANEXO 14: DISTRIBUCIÓN ETAREA DE LOS CASOS POSITIVOS A INFECCIÓN POR H. PYLORI. HCFAP ABRILAGOSTO 1999.

N° DE CASOS

20

18

17

16

14

14

15

12

10

5

2

2

0 (10-19)

(20-29)

(30-39)

(40-49)

(50-59)

EDAD

(60-69)

(70-79)

(80-89)

DISCUSION

WARTHIN STARRY VALIDEZ DIAGNOSTICA : SENSIBILIDAD

97.89 %

ESPECIFICIDAD

100 %

VALOR PRED. POSITIVO VALOR PRED. NEGATIVO

100 % 95 %

WARTHIN STARRY V A L ID E Z D IA G N O S T IC A E S T U D IO S D E R E F E R E N C IA

E %

9 5 .7

9 3 .6

-

-

H IS T O L O G I A (W -S )

96

100

-

-

C U L T IV O

CUT LER AF Y COL (E E U U , 1 9 9 5 )

9 3 .1

99

9 9 .4

8 8 .7

CONCOR. DE TEST

N UESTRO

9 7 .8 9

100

100

95

H IS T O L O G I A (W -S )

KO LTS B E Y COL (E E U U , 1 9 9 3 ) MONTGOMERY EA Y COL (E E U U , 1 9 8 8 )

VPP %

VPN %

PRU EB A D E ORO

S %

GIEMSA VALIDEZ DIAGNOSTICA : SENSIBILIDAD

96.84 %

ESPECIFICIDAD

97.36 %

VALOR PRED. POSITIVO VALOR PRED. NEGATIVO

98.92 % 92.5 %

GIEMSA V A L ID E Z D IA G N O S T IC A E S T U D IO S D E R E F E R E N C IA S A L IN A S MENDEZ (P E R U , 2 0 0 0 ) T H IJ S J C Y COL (E E U U , 1 9 9 6 ) KASSA T SEG A Y G EBR E (K E N Y A , 1 9 9 6 ) N UESTRO

VPP %

S %

E %

9 8 .5 3

100

9 8 .5 3

8 7 .5

H IS T O L O G I A (G IE M S A )

96

9 8 .8

9 9 .2

9 4 .5

CONCOR. DE TEST

100

97

99

100

C U L T IV O

9 2 .5

H IS T O L O G I A (W -S )

9 6 .8 4 9 7 .3 6 9 8 .9 2

VPN %

PRU EB A D E ORO

TRIPLE DE EL-ZIMAITY VALIDEZ DIAGNOSTICA: SENSIBILIDAD

81.0 %

ESPECIFICIDAD

97.36 %

VALOR PRED. POSITIVO VALOR PRED. NEGATIVO

98.71 % 67.27 %

EL - ZIMAITY • EL-ZIMAITY y COL (EE UU 1998); refieren una sensibilidad de 91%; especificidad de 100% y valores predictivos positivo y negativo del 100 y 85.7 %, comparándolo con los test de ureasa y cultivo (GOLD STANDARD).

HEMATOXILINA - EOSINA VALIDEZ DIAGNOSTICA : SENSIBILIDAD

68.42 %

ESPECIFICIDAD

94.73 %

VALOR PRED. POSITIVO VALOR PRED. NEGATIVO

97.1 % 54.54 %

HEMATOXILINA - EOSINA E S T U D IO S D E R E F E R E N C IA FALLO N E CO L (C A N A D A 1 9 9 7 ) MONTGOMERY EA Y COL (E E U U , 1 9 8 8 ) S A L IN A S MENDEZ (P E R U , 2 0 0 0 ) N UESTRO

V A L ID E Z D IA G N O S T IC A VPN %

PRU EB A D E ORO

S %

E %

VPP %

93

87

-

-

C U L T IV O

67

100

-

-

C U L T IV O

9 0 .4 4 7 8 .5 7 9 7 .6 2 4 5 .8 5

H IS T O L O G I A (G IE M S A )

6 8 .4 2 9 4 .7 3

H IS T O L O G I A (W -S )

9 7 .1

5 4 .5 4

CONCLUSIONES

CONCLUSIONES: • La tinción de Warthin Starry es una técnica relativamente laboriosa, que nos proporcionó una excelente visualización del microrganismo en el mucus gástrico, lo cual sumado a su validez diagnóstica (S: 97.89%; E: 100%; VPP: 100% y VPN: 95%), justifica su empleo como prueba de oro en el diagnóstico de H. pylori en biopsias gástricas. • La tinción de Giemsa reprenta una técnica simple y facil de realizar, cuya validez diagnóstica (S: 96.84%; E: 97.36%; VPP:98.92% y VPN:92.5%). comparable a la de Warthin Starry, hacen de ésta técnica una alternativa confiable para identificar H. pylori en biopsias gástricas.

• La tinción Triple de El-Zimaity , según los resultados obtenidos en éste estudio, es bastante específica (97.36%), pero no muy sensible (81%), lo cual le resta utilidad como posible tinción especial para la identificación de H. pylori. • La tinción de H-E, en este estudio, mostró una sensibilidad y valor predictivo negativo muy bajos (S: 68.9% y VPN: 54.54%) con respecto a las otras tinciones. Por lo tanto, tendría úna validez diagnóstica baja en la identificación de H. pylori. • La infección por H.pylori diagnósticada por el método de tinción histológica (W-S) presenta una alta frecuencia (71.43%) en la población estudiada, siendo la primera década de vida (10-19) la más afectada de todas.

• La presencia de H.pylori tuvo como patología más frecuente a la gastritis crónica con 96.80% del total de casos positivos, hallazgo histológico al que etiológica y epidemiológicamente se asocia.

RECOMENDACIONES

RECOMENDACIONES: 1. Para el método de tinción de Warthin Starry, sugerimos que los reactivos sean recien preparados. El tampón acetato de sodio-ácido acético,puede prepararse con días de anticipación, y almacenarse en refrigeración a 4 oC. Otra pauta importante, es la de evitar la sequedad de la lámina entre la impregnación y el revelado, ya que puede causar precipitaciones que dificulten la identificación de H. pylori en el tejido. 2. Con respecto al método de tinción Giemsa, sugerimos no exponer las láminas previamente coloreadas a un exceso de lavado en agua corriente, ni a una deshidratación en alcoholes, ya que el tejido

y a su vez la bacteria tienden a decolorarse. 3. Para el método de tinción Triple de El-Zimaity, , sugerimos que se evite su paso por el agua acidulada (coloración H-E) . 4. En presente trabajo empleamos Alcian blue alcohol soluble cuya desventaja fue el decolorar el tejido y a su vez la bacteria, por lo tanto sugerimos el empleo de Alcian blue soluble en agua. 5. Para la lectura deberían emplearse los objetivos de inmersión (100 x) para confirmar aquellos casos en que las bacterias sean difíciles de identificar .

6. Dejamos abierta la posibilidad de utilizar en estudios posteriores, todas las biopsias gástricas de un mismo paciente, incluídas en parafina, con la finalidad de aumentar la probabilidad de encontrar H. pylori.