Nghiên Cứu Xây Dựng Công Thức In Situ Gel Diclofenac Nhỏ Mắt 4n5b1b

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THANH HÀ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC IN SITU GEL DICLOFENAC NHỎ MẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THANH HÀ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC IN SITU GEL DICLOFENAC NHỎ MẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. DS. Vũ Ngọc Mai 2. DS. Đỗ Thị Kim Oanh Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế

HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin gửi tới: DS. Vũ Ngọc Mai DS. Đỗ Thị Kim Oanh là những người đã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Vũ Thị Thu Giang. Các cô đã dành nhiều thời gian và tâm huyết tận tình chỉ bảo, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Bào chế, bộ môn Vật lý- Hóa lý đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thanh Hà

MỤC LỤC Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ và đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 2 1.1.

Thông tin về dược chất natri diclofenac.................................................... 2

1.1.1.

Công thức cấu tạo. ............................................................................... 2

1.1.2.

Đặc tính lý hóa..................................................................................... 2

1.1.3.

Thông tin về độ ổn định của natri diclofenac. ....................................... 3

1.1.4.

Thông tin về tính thấm của natri diclofenac. ........................................ 3

1.1.5.

Thuốc nhỏ mắt chứa natri diclofenac ................................................... 4

1.2.

Thuốc nhỏ mắt .......................................................................................... 5

1.2.1.

Định nghĩa ........................................................................................... 5

1.2.2.

Sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt......................................................... 5

1.3.

Dung dịch in situ gel ................................................................................. 6

1.3.1.

Khái niệm ............................................................................................ 6

1.3.2.

Phân loại .............................................................................................. 6

1.3.3. Các hệ tạo gel in situ và một số nghiên cứu về dung dịch in situ gel dùng cho nhãn khoa .......................................................................................... 7 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15 2.1.

Nguyên liệu, thiết bị ................................................................................ 15

2.1.1.

Nguyên liệu ....................................................................................... 15

2.1.2.

Thiết bị .............................................................................................. 15

2.1.3.

Động vật thí nghiệm .......................................................................... 16

2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 16 2.3.1. Phương pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt in situ gel .............................. 16 2.3.2. Đánh giá một số đặc tính vật lý của dung dịch nhỏ mắt in situ gel ......... 17

2.3.3. Đánh giá một số đặc tính tạo gel của dung dịch nhỏ mắt in situ gel ....... 17 2.3.4. Phương pháp thử kết dính sinh học........................................................ 19 2.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro .............. 21 2.3.6. Phương pháp định lượng ....................................................................... 22 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................... 25 1.1.

Xây dựng đường chuẩn ........................................................................... 25

1.2.

Xác định công thức bào chế cơ bản ........................................................ 26

1.2.1.

Lựa chọn thành phần.......................................................................... 26

1.2.2.

Khảo sát tỉ lệ các thành phần.............................................................. 27

1.3.

Đánh giá một số đặc tính vật lý của dung dịch nhỏ mắt in situ gel......... 32

1.3.1.

Hình thức ........................................................................................... 32

1.3.2.

pH...................................................................................................... 32

1.4.

Đánh giá một số đặc tính tạo gel của dung dịch in situ gel..................... 33

1.4.1.

Nhiệt độ tạo gel.................................................................................. 33

1.4.2.

Khả năng tạo gel ................................................................................ 33

1.4.3.

Độ nhớt .............................................................................................. 35

1.4.4.

Khả năng chảy lỏng ........................................................................... 36

1.5.

Đánh giá khả năng kết dính sinh học của dung dịch in situ gel ............. 37

1.6.

Đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro .................................. 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................. 43

Phụ lục Tài liệu tham khảo

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PF127

Poloxamer P407

PF68

Poloxamer P188

NaDC

Natri diclofenac

DIG

Dung dịch in situ gel

Fa-x:y:z

Công thức Fa với tỷ lệ PF127, PF68, Carbopol lần lượt là x,y,z%

Fa-x:y

Công thức Fa với tỷ lệ PF127, PF68 lần lượt là x,y%

Fa-z

Công thức Fa với tỷ lệ Carbopol là z%

HPMC

Hydroxypropylmethyl cellulose

HPC

Hydroxypropyl cellulose

PVA

Polyvinyl alcol

NaCMC

Natri carboxymethyl cellulose

MC

Methyl cellulose

STF

Dung dịch nước mắt nhân tạo (Simulated Tear Fluid)

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Độ tan của NaDC trong nước

2

1.2

Phân loại các hệ tạo gel in situ

6

2.3

Nguyên liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm

15

3.4

Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ NaDC

25

3.5

Thành phần công thức lựa chọn tỷ lệ PF127: PF68

28

3.6

Nhiệt độ tạo gel, khả năng tạo gel và khả năng chảy lỏng của các công thức khảo sát tỷ lệ poloxamer

29

3.7

Thành phần công thức nghiên cứu

31

3.8

pH của các DIG khảo sát ở 25± 1oC

32

3.9

Kết quả đánh giá một số đặc tính tạo gel của DIG

34

3.10

Kết quả đo độ nhớt

35

3.11

Kết quả thử kết dính sinh học

37

3.12

Kết quả tỷ lệ dược chất giải phóng từ DIG trong 6 giờ

39

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình

Tên hình

Trang

1.1

Cấu trúc của poloxamer

7

1.2

Sơ đồ minh họa sự hình thành gel của PF127 khi tăng nhiệt độ

8

1.3

Cơ chế tạo gel của hệ nhạy cảm với pH

10

1.4

Cơ chế tạo gel do ion hóa

12

2.5

Mô hình thiết bị đo lực kết dính sinh học

19

2.6

Thiết bị thử kết dính sinh học tự chế tạo

20

3.7

Đồ thị biểu diễn dự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ NaDC và diện tích pic

25

3.8

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của PF127 và PF68 tới nhiệt độ tạo gel

28

3.9

Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ nhớt của các DIG có nồng độ poloxamer PF127:PF68 bằng 19:8% và 20:11% theo nhiệt độ

36

3.10

Đồ thị so sánh lực kết dính sinh học của các công thức có cùng nồng độ PF127:PF68 bằng 18:11% và 20:11%

38

3.11

Đồ thị so sánh tỷ lệ dược chất giải phóng của các DIG F7, F8 và F9 có cùng nồng độ PF127: PF68 bằng 19:10% và nồng độ Carbopol lần lượt là 0; 0,1; 0,2%

40

3.12

Đồ thị so sánh tỷ lệ dược chất giải phóng của các DIG F2, F8, F20 có cùng nồng độ Carbopol 0,1% và nồng độ PF127: PF68 lần lượt là 18:11; 19:10; 20:11%

41

1

ĐẶT VẤN ĐỀ Sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt quy ước thường rất thấp (chỉ khoảng từ 13%), do cơ chế bảo vệ của hệ thống nước mắt và cấu tạo phức tạp của mắt, dẫn đến hiệu quả điều trị không được như mong muốn. Nhiều hệ đưa thuốc đã được nghiên cứu để cải thiện vấn đề này như: thuốc mỡ, gel, hỗn dịch, màng nhãn khoa, hệ nano…Trong đó có dạng “gel có thể nhỏ giọt”, gọi là “in situ gel”, với ưu điểm dễ dàng nhỏ giọt khi sử dụng và chuyển thành gel nhớt trước giác mạc, tăng sinh khả dụng thông qua kéo dài thời gian lưu thuốc ở mắt. Đồng thời nó không gây khó chịu cho người sử dụng như thuốc mỡ, màng nhãn khoa; có độ ổn định vật lý cao hơn và đồng đều phân liều hơn hỗn dịch; phương pháp bào chế đơn giản hơn so với hệ nano. Natri diclofenac thuộc nhóm thuốc chống viêm giảm đau không steroid (NSAIDs), sử dụng cho mắt có tác dụng ngăn chặn co đồng tử xảy ra trong quá trình phẫu thuật lấy thủy tinh thể, giảm viêm và đau mắt trong tổn thương biểu mô giác mạc sau một số phẫu thuật can thiệp khác. Hiện nay trên thị trường mới chỉ có dạng dung dịch nhỏ mắt 0,1% (biệt dược Voltaren Ophtha), thuốc có thời gian tác dụng ngắn, người bệnh phải dùng ít nhất 4-5 lần một ngày. Xuất phát từ nhu cầu thực tế và góp phần khắc phục những hạn chế của các dạng thuốc nhỏ mắt thông thường chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng công thức in situ gel diclofenac nhỏ mắt” với mục tiêu: 1. Nghiên cứu, bào chế được dung dịch nhỏ mắt in situ gel chứa natri diclofenac. 2. Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố trong công thức bào chế đến các chỉ tiêu chất lượng của dung dịch in situ gel.

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1.

Thông tin về dược chất natri diclofenac

1.1.1. Công thức cấu tạo

Tên khoa học: Natri 2-[(2,6diclorophenyl)amino]benzen acetat. Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2. Khối lượng phân tử: 318,14 [4]

1.1.2. Đặc tính lý hóa. Tính chất vật lý. - Cảm quan: tinh thể hay bột kết tinh trắng hay hơi vàng, dễ hút ẩm [4]. - Độ tan: dễ tan trong methanol, tan trong ethanol 96o, hơi tan trong nước và trong acid acetic băng, khó tan trong aceton, thực tế không tan trong ete [4]. Độ tan của NaDC trong nước thay đổi theo nhiệt độ, dung môi và pH môi trường hòa tan [5], [19]. Độ tan trong nước của NaDC thay đổi theo pH môi trường, được thể hiện trong bảng 1.1. Bảng 1.1: Độ tan của NaDC trong nước. pH Độ tan (mg/mL) 1,2-3,0 <0,004 4,0 0,021 5,0 0,086 6,0 0,590 7,0 1,870 7,5 1,690 - Nhiệt độ nóng chảy: 283-285oC [4]. - Hệ số phân bố n-octanol/đệm phosphat pH 7,2: 13,4 [3]. - Dung dịch NaDC trong methanol và dung dịch đệm phosphat pH 7,2 có hấp phụ tử ngoại cực đại ở bước sóng lần lượt là 283 nm và 276 nm [24].

3

Tính chất hóa học: NaDC là dẫn chất của anilin, chứa nhóm amin bậc 2 nên dễ bị oxy hóa [3]. 1.1.3. Thông tin về độ ổn định của natri diclofenac. Natri diclofenac có nhóm chức amin dễ bị oxy hoá, có nhóm phenyl acetat dễ bị thuỷ phân đặc biệt dưới tác động của lực cơ học, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng. Tuy nhiên nếu tồn tại ở dạng rắn thì tương đối ổn định. Nóng chảy ở 280ºC, kèm theo sự phân huỷ [3]. Ahuja và các cộng sự đã đánh giá độ ổn định của các dung dịch nhỏ mắt trong nước của NaDC. Các công thức bào chế được bảo quản ở trong lọ thủy tinh màu và khô, tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm ở 15 ppm trong 20 phút. Kết quả cho thấy, sau bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 12 tháng hoặc lão hóa cấp tốc trong 6 tháng, dung dịch NaDC 0,1% trong nước ở pH 7,4 hàm lượng NaDC còn lại đạt trên 90%; dung dịch NaDC trong nước ở pH thấp có vẩn đục [9]. Sankar và cộng sự đã nghiên cứu độ ổn định của NaDC trong gel nhỏ mắt chứa NaDC, HPMC, NaCMC và MC, propylen glycol, benzalkonium clorid và đệm phosphat pH 7,2. Gel được khử trùng bằng nồi hấp ở 15 ppm, 121oC trong 20 phút; bảo quản ở điều kiện nhiệt độ khác nhau 25 -28oC. Kết quả cho thấy sau 6 tuần hàm lượng NaDC còn lại đạt 95% [38]. 1.1.4. Thông tin về tính thấm của natri diclofenac. Ahuja và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố trong công thức đến tính thấm của dung dịch nhỏ mắt NaDC trên giác mạc. Kết quả cho thấy: khi tăng pH từ 6,0 đến 8,0 khả năng thấm của NaDC giảm, khi nồng độ dược chất giảm từ 0,10 xuống 0,05% ảnh hưởng đến tính thấm không rõ ràng, khi nồng độ dược chất tăng từ 0,10 đến 0,15% tốc độ thấm giảm. Các chất bảo quản cũng ảnh hưởng đến mức độ thấm của NaDC: natri metabisulfit, dinatri edetat, methyl và propyl paraben có tác dụng làm tăng đáng kể tính thấm của NaDC, acid sorbic làm giảm trong khi benzalkonium clorid không ảnh hưởng đến tính thấm của NaDC. Các chất làm tăng độ nhớt cũng ảnh hưởng đến khả năng thấm của NaDC theo thứ tự sau: HPMC > MC > PVA > HPC trọng lượng phân tử thấp [8].

4

1.1.5. Thuốc nhỏ mắt chứa natri diclofenac Trên thị trường, thuốc nhỏ mắt chứa natri diclofenac mới chỉ có dạng dung dịch 0,1%. Trong đó, biệt dược Voltaren Ophtha (Novartis – Thụy Sĩ) đã báo cáo về các đặc điểm dược lực học, dược động học và liều dùng như sau [6]: 1.1.5.1.

Đặc điểm dược lực học

Diclofenac thuộc nhóm thuốc chống viêm giảm đau không steroid (NSAIDs), có tác dụng ức chế tổng hợp prostaglandin rõ rệt, tác dụng giảm đau chống viêm mạnh. Các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh diclofenac có khả năng ngăn chặn co đồng tử xảy ra trong quá trình lấy thủy tinh thể đục, có tác dụng làm giảm viêm và đau mắt trong tổn thương biểu mô giác mạc sau một số phẫu thuật can thiệp khác. Và không thấy dấu hiệu cho thấy diclofenac có tác dụng phụ ngăn cản quá trình lành vết thương. 1.1.5.2.

Đặc điểm dược động học

Thử nghiệm trên thỏ (đánh dấu bằng 14C) cho thấy diclofenac đạt nồng độ tối đa trong giác mạc và kết mạc vào thời điểm 30 phút sau khi nhỏ. Thuốc được thải trừ nhanh và hoàn toàn ra khỏi cơ thể sau 6 giờ. Ở người, khả năng diclofenac ngấm vào tiền phòng đã được xác nhận và không phát hiện thấy diclofenac trong huyết tương. 1.1.5.3.

Liều dùng

 Người lớn và người già: Phẫu thuật về mắt và biến chứng: trước phẫu thuật 3 giờ nhỏ 5 lần, 1 giọt/lần; sau phẫu thuật: ngay sau phẫu thuật nhỏ 1 giọt, lặp lại 3 lần trong ngày phẫu thuật, các ngày sau nhỏ 3-5 lần cho đến khi đạt hiệu quả. Điều trị giảm đau và khó chịu; viêm sau chấn thương: cứ 4-6 giờ nhỏ 1 giọt/lần. Đau do phẫu thuật: 1-2 giọt/1 giờ trước phẫu thuật, 1-2 giọt/15 phút sau phẫu thuật, trong 3 ngày sau: cứ 4-6 giờ nhỏ 1 giọt/lần cho tới khi đạt hiệu quả.  Trẻ em: chưa có nghiên cứu được công bố.

5

1.2.

Thuốc nhỏ mắt

1.2.1. Định nghĩa Thuốc nhỏ mắt là dung dịch nước, dung dịch dầu hoặc hỗn dịch vô khuẩn của một hay nhiều hoạt chất, dùng để nhỏ vào mắt. Chế phẩm cũng có thể được bào chế dưới dạng khô (bột, bột đông khô, viên nén) vô khuẩn, được hòa tan hoặc phân tán vào một chất lỏng vô khuẩn thích hợp khi dùng [4]. 1.2.2. Sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt. 1.2.2.1.

Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt.

Sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt thường rất thấp (chỉ từ 1-3%). Nguyên nhân do bên cạnh các yếu tố thông thường ảnh hưởng đến sinh khả dụng như: đặc tính lý hóa của dược chất, pH của chế phẩm, mức độ đẳng trương với dịch nước mắt,…, thì cấu tạo sinh lý đặc biệt gồm các lớp thân dầu và thân nước đan xen và cơ chế bảo vệ của hệ thống nước mắt là yếu tố quan trọng làm giảm sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt [16], [35]. 1.2.2.2.

Các biện pháp cải thiện sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt.

Một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt quy ước [1], [2]: - Kéo dài thời gian lưu thuốc ở vùng trước giác mạc: thêm chất kết dính sinh học, chất làm tăng độ nhớt, bào chế thuốc dưới dạng hỗn dịch, dạng gel, thuốc mỡ,... - Tăng tính thấm của giác mạc với dược chất: chất diện hoạt (Tween 80, Cremophor), tạo ra các tiền thuốc, tạo phức chelat với ion calci (natri edetat). - Hiện nay dạng dung dịch nhỏ mắt in situ gel với đặc điểm là tồn tại ở dạng dung dịch ở điều kiện bảo quản và chuyển sang dạng gel trong điều kiện sinh lý ở mắt, đang được nghiên cứu nhiều với kỳ vọng tăng sinh khả dụng của dung dịch thuốc nhỏ mắt quy ước và khắc phục được một số nhược điểm của những dạng bào chế khác dành cho nhãn khoa [7], [12] : DIG tạo gel nhớt trước giác mạc, hạn chế rửa trôi dược chất, kéo dài thời gian lưu thuốc ở mắt, tăng sinh khả dụng và hiệu lực điều trị, đồng thời giảm số lần sử dụng cho người bệnh so với dung dịch nhỏ mắt quy ước.

6

DIG là dung dịch dược chất, đảm bảo đồng đều phân liều hơn và hạn chế nhược điểm kém ổn định vật lý của hỗn dịch. DIG không làm mờ, giảm tầm nhìn và khó chịu như thuốc mỡ. DIG sử dụng nhỏ giọt như thuốc nhỏ mắt thông thường không gây khó khăn khi dùng như màng đặt nhãn khoa, khắc phục được nhược điểm giải phóng dược chất không hằng định của hệ màng đặt theo cơ chế mài mòn. DIG có phương pháp bào chế đơn giản, ổn định hơn các dạng bào chế mới như nhũ tương nano, hỗn dịch nano, liposom,… 1.3.

Dung dịch in situ gel

1.3.1. Khái niệm Dung dịch in situ gel là dung dịch cao phân tử của các polyme, có đặc tính chuyển thể sol-gel một cách thuận nghịch [2]. Sự tạo gel có thể được kích hoạt bởi các tác nhân như nhiệt độ, ion, pH, tác động của dung môi hay của tia UV [10], [11]. Dung dịch nhỏ mắt in situ gel có thể nhỏ giọt vào mắt như dung dịch và chuyển sang dạng gel nhớt đàn hồi dưới tác động của các điều kiện sinh lý ở mắt như: thay đổi nhiệt độ, pH và thay đổi thành phần điện giải [10], [11], [12]. 1.3.2. Phân loại Cơ chế tạo gel của dung dịch in situ gel được quyết định bởi loại polyme được sử dụng, mỗi loại polyme tạo gel dưới tác động của các yếu tố nhất định, được chia thành 3 nhóm như trong bảng 1.2. Bảng 1.2: Phân loại các hệ tạo gel in situ [34] STT

Tác nhân kích thích

1

Nhiệt độ

Polyme tạo gel Chitosan, Pluronics, tetronics, xyloglucans, hydroxypropylmethyl cellulose (HPMC) Chitosan, cellulose acetate phtalat (CAP),

2

pH

Carbopol, polymethacrilic acid (PMMA), polyethylen glycol (PEG),

3

Tương tác ion

Gelrite, gellan, acid hyaluronic, alginat.

7

1.3.3. Các hệ tạo gel in situ và một số nghiên cứu về dung dịch in situ gel dùng cho nhãn khoa 1.3.3.1.

Hệ tạo gel nhạy cảm với nhiệt độ

* Cơ chế Hệ in situ gel nhạy cảm với nhiệt độ bị kích hoạt bởi sự thay đổi nhiệt độ môi trường và là hệ được nghiên cứu nhiều nhất [36]. Sự chuyển thể sol - gel xảy ra chủ yếu do khả năng hòa tan khác nhau ở những nhiệt độ khác nhau của các polyme tạo gel. Ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ bắt đầu xảy ra sự chuyển thể sol-gel (LCST), liên kết hydro giữa các nhóm ưu nước ở trên bề mặt polyme và phân tử nước làm tăng sự hòa tan của các chuỗi polyme và hệ tồn tại ở dạng dung dịch. Khi nhiệt độ cao hơn LCST, các liên kết hydro bị phá vỡ, tương tác polyme - polyme và nước - nước chiếm ưu thế hơn, do các đại phân tử hòa tan bị khử nước đột ngột và chuyển sang cấu trúc kỵ nước hơn, dung dịch chuyển thành dạng gel [20], [32]. * Một số polyme thường dùng POLOXAMER Poloxamer (tên thương mại: Pluronics) là những chất hoạt động bề mặt không ion hóa tan được trong nước có cấu trúc gồm một chuỗi poly (propylen oxide) kỵ nước ở giữa và bao quanh bởi hai chuỗi poly (ethylen oxide) ưa nước (PEO-PPOPEO).

Hình 1.1: Cấu trúc của poloxamer [34]. Chúng có thể ở các dạng lỏng, nhão hay rắn tương ứng với khối lượng phân tử và tỷ lệ EO:PO lần lượt từ 1100-1400 và từ 1:9-8:2 [34], [37]. Trong đó, poloxamer P407 hay được sử dụng nhất trong công nghiệp bào chế. Nó tạo được gel trong suốt

8

và không màu. Các poloxamer nói chung được ghi nhận là dung nạp tốt và không gây hại đến giác mạc thỏ và chuột kể cả với nồng độ khá cao (25-30%) [15]. Ở các nồng độ 20% và cao hơn, dung dịch trong nước của nó có dạng lỏng ở nhiệt độ thấp (<15oC) và chuyển dần sang dạng gel bán rắn có độ nhớt cao khi tăng dần nhiệt độ. Ở nhiệt độ thấp, poloxamer ở dạng các tiểu đơn vị micell, có cấu trúc gồm phần kỵ nước (PO) ở trung tâm, bao quanh bởi các chuỗi ưa nước (EO). Liên kết hydro giữa EO và phân tử nước làm tăng sự hòa tan của polyme, các micell tồn tại ở dạng tự do trong dung dịch. Khi nhiệt độ tăng lên, liên kết hydro bị phá hủy, liên kết polyme-polyme giữa các micell tăng lên, chúng tập hợp lại với nhau và tạo thành các mạng lưới liên kết ngang, làm tăng độ nhớt (hình 1.2) [21].

Hình 1.2. Sơ đồ minh họa sự hình thành gel của PF127 khi tăng nhiệt độ [18]. Nghiên cứu về DIG sử dụng poloxamer: Rathapon Asasutjari và cộng sự đã nghiên cứu công thức dung dịch nhỏ mắt in situ gel natri diclofenac sử dụng tá dược tạo gel là poloxamer P407, P188 và Carbopol 940 làm tăng độ nhớt. Nghiên cứu chỉ ra rằng công thức có nồng độ 3 polyme lần lượt là 20:11:0,1% có nhiệt đô tạo gel 32,6 ± 1,1oC và thử nghiệm in vivo trên thỏ thu được kết quả: nồng độ NaDC tối đa trong thủy dịch (Cmax) khi nhỏ DIG cao hơn 2,2 lần khi nhỏ dung dịch nhỏ mắt. Dung dịch nhỏ mắt sau 6 giờ không xác định được nồng độ của NaDC trong thủy dịch, in situ gel duy trì nồng độ NaDC trong thủy dịch ít nhất 12 giờ [10]. Yong qian và các cộng sự đã phát triển công thức dung dịch nhỏ mắt in situ gel của methazolamid, sử dụng kết hợp 2 poloxamer PF127 và PF68. Chọn ra được công thức tối ưu chứa 21% PF127 và 10% PF68, tỷ lệ dược chất giải phóng sau 1

9

giờ là 44,90%, sau 6 giờ là 86,63%. So sánh tác dụng làm giảm áp lực nội nhãn với AZOPT® (hỗn dịch nhỏ mắt brinzolamid 1%) cho thấy, trong 1,5 giờ đầu tiên, tác dụng của AZOPT® tốt hơn so với công thức nghiên cứu, sau đó, tác dụng của công thức nghiên cứu lại tốt hơn và kéo dài đến 12 giờ sau khi nhỏ thuốc, trong khi tác dụng của AZOPT® chỉ trong hơn 8 giờ [31]. Dẫn chất của cellulose: MC và HPMC Cellulose là một polysaccarid không tan trong nước. Một số dẫn chất như MC và HPMC tạo ra bằng cách alkyl hóa cellulose có đặc tính tạo gel in situ ở nồng độ thấp (1-10%). Dung dịch MC chuyển thành dạng gel đục trong khoảng từ 40-50oC, HPMC trong khoảng từ 75-90oC. Nhiệt độ chuyển pha này có thể thấp hơn nhờ những thay đổi về vật lý hay hóa học. Ví dụ, NaCl làm giảm nhiệt độ tạo gel của dung dịch MC xuống từ 32-34oC. Tương tự, khi giảm số nhóm thế hydroxy propyl của HPMC, nhiệt độ tạo gel của nó giảm còn khoảng 40oC [26]. Nghiên cứu về DIG sử dụng MC: Bhowmik M. và các cộng sự đã nghiên cứu sự tạo gel và giải phóng thuốc in vitro của DIG ketorolac tromethamin nhạy cảm nhiệt chứa MC. Kết quả chỉ ra rằng dung dịch in situ gel 1% MC và 5-7% NaCl có nhiệt độ tạo gel dưới 37oC và tỷ lệ giải phóng thuốc trên 5 giờ đạt 100% [11]. XYLOGLUCAN Xyloglucan là một polyme tự nhiên có nguồn gốc từ hạt me. Nó có cấu trúc gồm một chuỗi β-(1-4)-glucose với nhánh α -(1-6)-xylose được thay thế một phần bằng β -(1-2)-galactoxylose. Xyloglucan ít khi thể hiện đặc tính chuyển pha. Khi ít nhất 35% galactose bị thủy phân bởi β-galactosidase thì đặc tính tạo gel in situ mới xuất hiện. Nhiệt độ chuyển thể sol-gel của xyloglucan giảm từ 40oC xuống 5oC tương ứng với tỷ lệ galactose bị thủy phân tăng từ 35-58% [7]. Nghiên cứu về DIG sử dụng xyloglucan: Burgalassi S. và các cộng sự đã đánh giá nồng độ timolol trong nước mắt, giác mạc, cơ mống mi mắt, thủy dịch, huyết tương và tác dụng làm giảm áp lực nội nhãn của công thức chứa 2% xyloglucan. So sánh dược động học với thuốc nhỏ mắt chứa

10

timolol Droptimol® và Timoptic® XE (DIG sử dụng gellan làm tác nhân tạo gel). Thấy rằng công thức sử dụng xyloglucan có kết quả tốt hơn so với Droptimol® (diện tích dưới đường cong AUC gấp 1,8 lần và nồng độ thuốc cao nhất trong thủy dịch Cmax gấp 1,61 lần) và tương đương với Timoptic® XE [13]. Miyazaki và các cộng sự đã nghiên cứu công thức dung dịch nhỏ mắt in situ gel của pilocarpin hydrochlorid sử dụng tá dược tạo gel xyloglucan. Kết quả cho thấy công thức chứa 2% xyloglucan duy trì gel ở mắt trong hơn 6 giờ khi nhỏ vào mắt thỏ [25]. 1.3.3.2. *

Hệ tạo gel do thay đổi pH

Cơ chế Các polyme nhạy cảm với pH chuyển từ dạng dung dịch sang dạng gel do pH

làm thay đổi mức độ ion hóa và độ tan trong nước của chúng. Tất cả các polyme nhạy cảm với pH đều có các nhóm ion (acid hay base) có thể cho hoặc nhận điện tử khi pH môi trường thay đổi. Khi pH môi trường tăng, sự trương nở của các polyme tăng lên nếu trong phân tử polyme có các nhóm có tính acid yếu, và giảm đi khi có các nhóm có tính base yếu [33].

Hình 1.3: Cơ chế tạo gel của hệ nhạy cảm với pH [34]. *

Một số polyme thường dùng CHITOSAN Chitosan là một polyme cation, có bản chất là polysaccarid, sản phẩm của

phản ứng deacetyl hoá một phần chitin. Chitosan có độc tính thấp, tương tác sinh học tốt và có khả năng phân hủy sinh học. Chitosan ít tan trong nước, ethanol 95%

11

và dung môi hữu cơ khác, tan nhanh trong các dung dịch acid (acid acetic). Vì các nhóm amin của polyme bị proton hoá tạo dạng muối RNH3+ tan trong nước. Độ tan của chitosan phụ thuộc vào mức độ deacetyl hoá và chịu ảnh hưởng lớn của việc thêm các chất điện ly vào dung dịch. Ở pH nhỏ hơn 6,2 chitosan tồn tại trong nước dưới dạng dung dịch. Ở pH lớn hơn 6,2 xảy ra sự trung hòa làm chitosan chuyển thành dạng gel ngậm nước giống như tủa [28]. Nghiên cứu về DIG sử dụng chitosan: Varshosaz và các cộng sự đã nghiên cứu DIG ciprofloxacin sử dụng các chitosan có phân tử lượng khác nhau kết hợp với poloxamer. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng với cùng nồng độ PF127 15%, khi tăng nồng độ chitosan từ 0,1-0,3% hoặc khối lượng phân tử chitosan tăng từ thấp đến cao, tỷ lệ dược chất giải phóng in vitro giảm. DIG chứa 15% PF127 và 0,1% chitosan phân tử lượng thấp có đường kính vùng ức chế Pseudomonas aueroginosa (48 mm) và Staphylococcus aureus (48 mm) lớn hơn so với dung dịch nhỏ mắt ciprofloxacin quy ước (32 và 31 mm) [40]. CARBOPOL Carbopol là một poly(acid acrylic) phân tử lượng lớn được sử dụng rộng rãi trong nhãn khoa để tăng thời gian lưu của thuốc trước giác mạc. Carbopol 934 là một polyme tổng hợp gồm 62% nhóm carboxyl, với khối lượng phân tử lớn được tạo bởi các đơn vị lặp lại acid acrylic liên kết với allyl sucrose hoặc allyl ether của pentaerythritol. Carbopol là một polyme có độ nhớt phụ thuộc vào pH, nó ở dạng dung dịch trong môi trường acid nhưng tạo gel nhớt trong môi trường pH kiềm. Carbopol tương đối bền, không bị ảnh hưởng bởi sự biến đổi của nhiệt độ, chất oxy hoá, có thể kháng lại sự phát triển của vi khuẩn. Ở nồng độ gel 0,5%, Carbopol 934P có độ nhớt 29400 – 39400 [28]. Nghiên cứu về DIG sử dụng Carbopol: Wu C, Qi H, Chen W nghiên cứu bào chế DIG puerarin sử dụng polyme tạo gel là Carbopol 980 và HPMC với nồng độ 0,1 và 0,4%, tạo gel ở điều kiện sinh lý, làm tăng độ nhớt, giải phóng dược chất trong 8 giờ, thời gian thuốc đạt nồng độ tối

12

đa trong thủy dịch Tmax gấp 1,76 lần và diện tích dưới đường cong AUC0-8 giờ gấp 2,17 lần so với dạng dung dịch quy ước [41]. Malik và cộng sự đã nghiên cứu bào chế DIG gatifloxacin chứa Carbopol 940 và HPMC làm tác nhân tạo gel nhạy cảm pH. DIG được tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm ở 121oC, 15psi trong 15 phút. Kết quả thử độ vô khuẩn trong môi trường thioglycolat và thạch casein đậu tương cho thấy sau 7 ngày DIG không bị nhiễm vi sinh vật. Các DIG có khả năng duy trì giải phóng dược chất in vitro, sau 8 giờ có trên 84% gatifloxacin được giải phóng [23]. 1.3.3.3. *

Hệ tạo gel do ion hóa.

Cơ chế Hệ tạo gel do ion hóa bị kích hoạt bởi sự có mặt của các ion có trong dịch

nước mắt như Na+, Ca2+, Mg2+. Các polyme được sử dụng là các polyme anion, như: natri alginat, Gelrite, tamarind, gellan. Sự tạo gel xảy ra do tương tác ion giữa các ion của polyme và các ion hóa trị 2 của nước mắt. Khi các polyme anion tiếp xúc với các cation, chúng chuyển sang dạng gel có độ nhớt cao.

Hình 1.4: Cơ chế tạo gel do ion hóa [34]. *

Một số polyme thường dùng

ALGINAT Cấu tạo hóa học của alginat gồm 2 phần tử β-D-mannuronic (M) và α – L – guluronic acid (G) liên kết với nhau bằng liên kết 1- 4 glucozid. Do bị thủy phân

13

một phần bởi acid, alginat có cả 2 thành phần: acid mannuronic, acid guluronic. Alginat với lượng acid guluronic cao sẽ cải thiện đặc tính tạo gel và giảm được lượng polyme sử dụng. Tương tác giữa phần tử G và các ion Ca2+ làm cho alginat tạo gel có cấu trúc 3 chiều bền vững. Các đặc tính của gel tạo thành như là độ bền và độ xốp phụ thuộc vào tỷ lệ G:M, loại ion liên kết, nồng độ và độ nhớt của dung dịch alginat ban đầu [26]. Nghiên cứu về DIG sử dụng alginat: Liu và các cộng sự đã nghiên cứu DIG gatifloxacin sử dụng alginat là polyme tạo gel. Kết quả chỉ ra rằng công thức gatifloxacin chứa 1% alginat và 2% HPMC E50Lv có khả năng kéo dài giải phóng dược chất: tỷ lệ dược chất giải phóng in vitro sau 0,5 giờ là 17,2%; sau 6 giờ là 80,0% trong khi dung dịch nhỏ mắt gatifloxacin đối chiếu tỷ lệ dược chất giải phóng đạt hơn 90,0% chỉ sau chưa tới 0,5 giờ [22].  Bên cạnh dành cho nhãn khoa thì các DIG còn được nghiên cứu cho đường uống, đường tiêm hay cho mũi, âm đạo và trực tràng: - Yuan và các cộng sự đã phát triển công thức dung dịch in situ gel đặt trực tràng của nimesulid, sử dụng poloxamer P407. Kết quả nghiên cứu dược động học trên trực tràng thỏ cho thấy, công thức nimesulid 2% chứa 18% PF127, 0,5% natri alginat và 1,2% PEG 4000 có thời gian thuốc đạt nồng độ tối đa trong huyết tương Tmax=131,33 phút, nhanh hơn so với thuốc đạn thông thường (chứa 2% nimesulid và 98% glyceryl monostearat) (Tmax=274,18 phút). Và nồng độ thuốc cao nhất trong huyết tương cũng cao hơn (26,69 và 16,21 µg/ mL) [42]. - Chaudhary và Verma đã nghiên cứu công thức dung dịch in situ gel chứa acyclovir để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn virus herpes đường miệng, sử dụng PF127 và Carbopol 934, HPMC làm tá dược tạo gel. Kết quả nghiên cứu khả năng thấm in vitro của dược chất cho thấy, tất cả các công thức khảo sát đều có % dược chất giải phóng tại các thời điểm 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 180 phút lớn hơn so với dạng kem thương mại (công thức chứa 6g PF127 và 0,15g HPMC K100M trong khoảng 42g chế phẩm có khoảng 35, 67, 90, 98% dược chất giải phóng tại các thời

14

điểm 30, 60, 90, 180 phút, so với dạng kem thương mại có % dược chất giải phóng lần lượt là 21, 47, 69, 84%) [14]. - Nerella và các cộng sự đã nghiên cứu dung dịch in situ gel kết dính sinh học đường mũi của natri montelukast. Kết quả đánh giá tính thấm in vitro của dược chất qua niêm mạc mũi cừu cho thấy các công thức chứa 20% PF127 và 20% PF127 kết hợp với 2% MC duy trì giải phóng thuốc trong 12 giờ, tương ứng có 83,75 và 88,33% dược chất giải phóng sau 12 giờ [27]. Mặc dù trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về dung dịch in situ gel, nhưng trong nước các nghiên cứu vẫn rất hạn chế. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm xây dựng và đánh giá công thức DIG natri diclofenac, trong đó sử dụng poloxamer PF127 và PF68 là tác nhân tạo gel nhạy cảm nhiệt và Carbopol là polyme kết dính sinh học.

15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.

Nguyên liệu, thiết bị

2.1.1. Nguyên liệu Bảng 2.3: Nguyên liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Tên nguyên liệu Natri diclofenac Poloxamer P407 Poloxamer P188 Carbopol 934 Chitosan Kali dihydrophosphat Dinatri hydrophosphat Acid phosphoric Natri phosphat Natri hydroxyd Natri clorid Calci clorid Natri hydrocarbonat Acid acetic Methanol Nước cất

Nguồn gốc Trung Quốc BASF (Đức) BASF (Đức) Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung quốc Baker (Mỹ) Việt Nam

Tiêu chuẩn chất lượng Nhà sản xuất Nhà sản xuất Nhà sản xuất Nhà sản xuất Nhà sản xuất Tinh khiết phân tích Tinh khiết phân tích Tinh khiết phân tích Tinh khiết phân tích Tinh khiết phân tích Tinh khiết phân tích Tinh khiết phân tích Tinh khiết phân tích Tinh khiết phân tích Dùng cho HPLC DĐVN IV

2.1.2. Thiết bị +

Máy đo pH Eutech Instrument pH 510.

+

Thiết bị lọc nén Sartorius SM 16249.

+

Màng lọc cellulose acetat kích thước 0,2 µm; 0,45 µm.

+

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Aligent 1260 Infinite (Mỹ).

+

Hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research (Mỹ).

+

Bể siêu âm Ultrasonic LC_60H.

+

Nhớt kế Brookfield SA® (Mỹ).

+

Thiết bị thử kết dính sinh học: chế tạo từ cân Roberval.

+

Tủ lạnh.

+

Máy lọc nước PURELAB Classic UV, ELGA (Anh).

16

+

Cân phân tích, cân kỹ thuật, các dụng cụ thủy tinh khác,…

2.1.3. Động vật thí nghiệm Thỏ trắng trưởng thành khỏe mạnh, có trọng lượng 2,0- 2,5 kg, được nuôi dưỡng trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, có kiểm soát. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Lựa chọn và xác định tỉ lệ các thành phần để xây dựng công thức bào chế cơ bản của DIG. - Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố trong công thức bào chế đến các chỉ tiêu chất lượng của dung dịch in situ gel: đặc tính vật lý, đặc tính tạo gel, khả năng kết dính sinh học và khả năng giải phóng dược chất in vitro. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt in situ gel DIG được bào chế bằng phương pháp lạnh theo các bước sau (áp dụng cho 100g DIG):  Đối với công thức sử dụng tá dược Carbopol Bước 1: Pha 100 mL dung dịch đệm phosphat pH 6,0, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm. Bước 2: Chuẩn bị dung dịch polyme. - Cho từ từ Carbopol 934 vào khoảng 60mL dung dịch đệm, để qua đêm cho trương nở hoàn toàn. - Cho tiếp từ từ PF127 và PF68 vào, khuấy từ liên tục trong 1 giờ, tốc độ khoảng 100 vòng/ phút. Để ít nhất 24 giờ trong tủ lạnh (4oC) cho tan hoàn toàn. - Tiệt khuẩn dung dịch bằng nhiệt ẩm ở 121oC trong 20 phút, để nguội và làm lạnh đến 4oC. Bước 3: Chuẩn bị dung dịch dược chất. Hòa tan hoàn toàn dược chất vào khoảng 10mL dung dịch đệm, lọc tiệt khuẩn bằng màng lọc cellulose acetat 0,2 µm. Bước 4: Phối hợp 2 dung dịch trên, bổ sung dung dịch đệm đã lọc tiệt khuẩn đủ khối lượng.

17

Bước 5: Đóng gói, dán nhãn, hoàn chỉnh sản phẩm.  Đối với công thức sử dụng tá dược chitosan. Bước 1: Pha 100 mL dung dịch đệm phosphat pH 7,4, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm. Bước 2: Chuẩn bị dung dịch polyme. - Hòa tan hoàn toàn chitosan vào 5 mL dung dịch acid acetic 2%. - Cho từ từ PF127 và PF68 vào khoảng 60mL dung dịch đệm, khuấy từ liên tục trong 1 giờ, tốc độ khoảng 100 vòng/ phút. Để ít nhất 24 giờ trong tủ lạnh cho tan hoàn toàn. - Phối hợp từ từ 2 dung dịch trên, khuấy từ liên tục trong 1 giờ cho đồng nhất. - Tiệt khuẩn dung dịch bằng nhiệt ẩm ở 121oC trong 20 phút, để nguội và làm lạnh đến 4oC. Bước 3: Chuẩn bị dung dịch dược chất. Hòa tan hoàn toàn dược chất vào khoảng 5mL dung dịch đệm, lọc tiệt khuẩn bằng màng lọc cellulose acetat 0,2 µm. Bước 4: Phối hợp 2 dung dịch trên, bổ sung dung dịch đệm đã lọc tiệt khuẩn đủ khối lượng. Bước 5: Đóng gói, dán nhãn, hoàn chỉnh thành phẩm. 2.3.2. Đánh giá một số đặc tính vật lý của dung dịch nhỏ mắt in situ gel 2.3.2.1. Hình thức Màu sắc, độ trong của các DIG được xác định bằng mắt thường trên nền đen và trắng. 2.3.2.2. pH Sử dụng máy đo pH, tiến hành đo ở nhiệt độ 25±1oC, đo 3 lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. 2.3.3. Đánh giá một số đặc tính tạo gel của dung dịch nhỏ mắt in situ gel 2.3.3.1. Đánh giá khả năng chảy lỏng

18

Khả năng chảy lỏng của DIG được đánh giá bằng cách úp ngược ống nghiệm có chiều cao 14 cm có chứa 2 mL mẫu và quan sát bằng mắt thường. Tính thời gian t từ khi bắt đầu úp ống nghiệm đến khi DIG trong ống chảy đến miệng ống. Khả năng chảy lỏng được đánh giá theo 4 mức: −

Không chảy

+

Kém: t > 6 giây

++

Trung bình: 3 < t < 6 giây

+++

Tốt: t < 3 giây Tiến hành ở các nhiệt độ: 4±1ºC (nhiệt độ bảo quản), 25±1oC (nhiệt độ

phòng), 35±1oC (nhiệt độ trước giác mạc). 2.3.3.2. Đo nhiệt độ tạo gel Cho 10mL DIG và một thanh khuấy từ vào cốc có mỏ trong suốt dung tích 100mL, đặt trong một cốc có mỏ dung tích 500mL chứa 100mL nước được làm nóng đến 50oC. Nhúng một nhiệt kế vào trong DIG và khuấy từ với tốc độ khoảng 100 vòng/phút. Nhiệt độ mà ở đó thanh khuấy từ dừng lại được xác định là nhiệt độ tạo gel của DIG. Mỗi mẫu làm 3 lần lấy kết quả trung bình. Kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. 2.3.3.3. Đánh giá khả năng tạo gel Nhỏ 0,1 mL DIG vào 2 mL nước mắt nhân tạo chứa trong một ống nghiệm được điều nhiệt 35± 1oC. Theo dõi thời gian tạo gel và thời gian gel tan hết. Dung dịch nước mắt nhân tạo (STF) được pha theo công thức: 0,67g NaCl, 0,2g NaHCO3, 0,008g CaCl2.2H2O và nước cất vừa đủ 1000mL. Khả năng tạo gel của DIG được đánh giá theo 4 mức: −

Không tạo gel.

+

Tạo gel sau vài giây và tan sau vài phút.

++

Tạo gel ngay lập tức và tan sau thời gian từ 10-20 phút.

+++

Tạo gel ngay lập tức và duy trì được > 20 phút.

2.3.3.4. Độ nhớt

19

Sử dụng nhớt kế Brookfield. Sử dụng đầu đo S2 với tốc độ quay 30 vòng/phút khi đo mẫu ở 4±1ºC, 25±1oC và đầu đo S4 với tốc độ quay 20 vòng/ phút khi đo mẫu ở 35±1oC. Đo 3 lần và lấy kết quả trung bình. Chỉ kết quả đo với độ tin cậy ≥ 10% mới có giá trị. Độ nhớt ở 35± 1oC được đo sau khi pha loãng bởi STF với tỷ lệ DIG:STF bằng 40:7 (tt/tt) [10]. Kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. 2.3.4. Phương pháp thử kết dính sinh học Nhìn chung các thiết bị đánh giá lực kết dính sinh học thường có cấu tạo giống như mô hình thể hiện ở hình 2.5 [18]. Trong điều kiện chưa có thiết bị đánh giá nên chúng tôi đã tự chế thiết bị đánh giá khả năng kết dính sinh học dựa theo mô hình tham khảo từ cân Roberval có độ nhạy 0,01g. Hình ảnh chụp thiết bị tự chế tạo được thể hiện trong hình 2.6.

Hình 2.5. Mô hình thiết bị đo lực kết dính sinh học [18]

20

Hình 2.6: Thiết bị thử kết dính sinh học tự chế tạo. Trong đó: A: trục cân bằng. B: quả nặng hoặc đĩa petri chứa nước được nhỏ xuống từ buret F. C: vật hình trụ có đường kính 1cm để gắn giác mạc mắt thỏ. D: mẫu DIG. E: giác mạc mắt thỏ. G: lọ thủy tinh nhỏ chứa đầy dung dịch nước mắt nhân tạo, phía trên gắn giác mạc mắt thỏ. Lọ được đặt trong một cốc nước điều nhiệt ở 35±1oC. Cách xử lý giác mạc mắt thỏ: giác mạc mắt thỏ sau khi bóc tách được rửa sạch và bảo quản bằng dung dịch nước mắt nhân tạo, sử dụng trong vòng 3 giờ sau khi bóc tách. Tiến hành đo lực kết dính sinh học được tiến hành như sau: lắp đặt các bộ phận như hình mô tả, chỉnh cho đĩa cân thăng bằng, cho một lượng DIG thử kết dính vào vị trí D (khoảng 0,1mL). Giác mạc gắn với khối trụ C nhanh chóng được tiếp xúc với DIG trước khi nó bị gel hóa. Ngay lúc đó một quả cân khối lượng 5g được đặt lên đĩa cân bên trái. Sau 2 phút, lấy quả cân ra, điều chỉnh nước từ buret chảy xuống đĩa cân B với tốc độ hằng định 1mL/phút cho đến khi 2 giác mạc tách

21

nhau ra (kim cân lệch khỏi vị trí cân bằng) thì khóa buret. Cân khối lượng nước đã chảy xuống và tính lực kết dính sinh học theo công thức:

F=

,

×

(N/cm2)

Trong đó: m: khối lượng nước chảy xuống từ buret. S: diện tích của khối trụ (S= 0,785 cm2). Thay mới cả 2 giác mạc sau mỗi lần đo. 2.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro Thiết bị: Sử dụng hệ thống đánh giá đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research. Ngăn chứa mẫu được cải tiến để chứa được 1g mẫu DIG lỏng, ngăn nhận chứa môi trường khuếch tán, màng giải phóng được đặt giữa hai ngăn. Điều kiện tiến hành: -

Màng giải phóng: giác mạc mắt thỏ đã được xử lý bằng môi trường

khuếch tán. -

Môi trường khuếch tán: dung dịch nước mắt nhân tạo.

-

Thể tích môi trường khuếch tán: V= 7mL.

-

Nhiệt độ: 35±1oC.

-

Diện tích bề mặt khuếch tán: S= 1,76 cm2.

-

Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút.

-

Lượng mẫu đem thử: 1,0 g DIG (chứa 1mg NaDC).

Lấy mẫu: Lấy mẫu trong 6 giờ, tại các thời điểm 1, 2, 3, 4, 5, 6 giờ. Mỗi lần lấy 1mL rồi bổ sung ngay 1mL môi trường khuếch tán mới có nhiệt độ 35±1oC. Lượng dược chất giải phóng từ DIG được xác định bằng phương pháp được trình bày ở mục 2.3.6. Cách tính tỷ lệ dược chất giải phóng tại các thời điểm. - Nồng độ dược chất trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t:

22

Ct =

× Cc× 100

Trong đó: Ct: nồng độ dược chất trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t (µg/mL). Cc: nồng độ mẫu chuẩn (µg/mL). St: diện tích pic của mẫu giải phóng (mAU.giây). Sc: diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.giây). - Tổng lượng dược chất đã giải phóng từ DIG tại thời điểm t (lần lấy mẫu thứ n): n 1

Q t = V .Ct  v. Ci i 1

Trong đó: Qt: tổng lượng dược chất đã giải phóng tại thời điểm t (µg). V: thể tích môi trường khuếch tán (mL), V= 7mL. v: thể tích mỗi lần lấy mẫu giải phóng (mL), v= 1mL. Ct: nồng độ dược chất trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t (µg/mL). Ci: nồng độ dược chất trong môi trường khuếch tán tại thời điểm i (µg/mL). - Phần trăm dược chất đã giải phóng từ DIG tại thời điểm t:

Xt =

× 100

Trong đó: Xt: phần trăm dược chất giải phóng tại thời điểm t (%). Qt: lượng dược chất đã giải phóng tại thời điểm t (mg). M: khối lượng dược chất có trong mẫu DIG (mg). 2.3.6. Phương pháp định lượng Dược chất có trong DIG, dược chất giải phóng từ DIG được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao- HPLC. Điều kiện.

23

- Pha tĩnh: Cột Eclipse XDB-C8 5µm, kích thước 4,6mm× 150,0mm. - Pha động: hỗn hợp methanol và dung dịch đệm phosphat pH 2,5 với tỷ lệ 75/25, lọc qua màng cellulose acetat 0,45µm, siêu âm đuổi bọt khí trong 15 phút. - Tốc độ dòng pha động: 1mL/phút. - Thể tích tiêm mẫu: 20µL. - Detector UV bước sóng 276nm. Mẫu chuẩn: Cân chính xác một lượng dược chất khoảng 100mg, hòa tan hoàn toàn bằng nước cất trong bình định mức 100mL, bổ sung vừa đủ thể tích, thu được dung dịch gốc nồng độ 1mg/mL. Tiếp tục pha loãng dung dịch gốc 50 lần bằng nước cất để thu được mẫu chuẩn có nồng độ khoảng 20µg/mL. Lọc qua màng lọc 0,45µm. Mẫu thử Định lượng dược chất có trong mẫu DIG: pha loãng DIG 50 lần bằng nước cất, lọc qua màng lọc 0,45µm. Định lượng dược chất giải phóng in vitro: 1mL mẫu lấy được từ môi trường khuếch tán trực tiếp đem đi phân tích. Công thức tính 

Nồng độ dược chất trong mẫu thử được tính theo công thức sau:

Ct =

×

Trong đó: Ct : Nồng độ dược chất trong mẫu DIG (mg/mL) mc: Khối lượng dược chất cân ban đầu để pha mẫu chuẩn (mg). St: Diện tích pic chính của mẫu DIG (mAU.giây) Sc: Diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.giây) 

Phần trăm dược chất giải phóng từ DIG được tính toán như trình bày ở mục 2.3.5.



Phần trăm dược chất chứa trong mẫu DIG được tính theo công thức:

24

=

×

Trong đó: H: phần trăm dược chất trong mẫu DIG (%). Ct: nồng độ dược chất trong mẫu DIG (mg/mL). Co: nồng độ lý thuyết của dược chất trong DIG bào chế (mg/mL), Co= 1 mg/mL

25

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1.1.

Xây dựng đường chuẩn Cân chính xác khoảng 100mg NaDC hòa tan trong bình định mức 100 mL với

nước, bổ sung vừa đủ thể tích thu được dung dịch gốc nồng độ 1 mg/mL. Pha loãng dung dịch gốc với nước thu được các dung dịch chuẩn NaDC với các nồng độ: 5µg/mL, 10µg/mL, 20µg/mL, 50µg/mL, 80µg/mL, 100µg/mL, 120 µg/mL. Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo điều kiện đã nêu ở mục 2.3.6, thu được kết quả diện tích pic như bảng 3.4.

Diện tích pic (mAU.giây)

Bảng 3.4: Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ NaDC. STT

Nồng độ (µg/mL)

Diện tích pic (mAU.giây)

1

5

67,7

2

10

147,7

3

20

314,2

4

50

781,7

5

80

1279,7

6

100

1589,9

7

120

1919,0

2500 y = 16.074x - 12.655 R² = 0.9999

2000 1500 1000 500 0 0

20

40

60

80

100

120

140

Nồng độ NaDC (µg/mL) Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ NaDC và diện tích pic.

26

Nhận xét: Vì hệ số tương quan R2 lớn hơn 0,99 nên trong khoảng nồng độ từ 5µg/mL đến 120µg/mL có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ NaDC và diện tích pic. Vì vậy có thể sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC nêu trên để tiến hành định lượng NaDC trong DIG và trong môi trường giải phóng. 1.2.

Xác định công thức bào chế cơ bản

1.2.1. Lựa chọn thành phần Thành phần của DIG nhỏ mắt dự kiến bao gồm: -

Dược chất: NaDC

-

Các polyme tạo gel: poloxamer PF127, PF68.

-

Các polyme kết dính sinh học: Carbopol, chitosan.

-

Hệ đệm pH, chất đẳng trương, chất sát khuẩn, … Với mục đích xây dựng công thức DIG và đánh giá ảnh hưởng của thành phần

công thức tới sự hình thành gel và một số đặc tính của gel như nhiệt độ tạo gel, khả năng tạo gel, độ bền gel, giải phóng DC qua màng,…nên trong đề tài chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu ở các thành phần: các polyme tạo gel, polyme kết dính sinh học và pH hệ đệm. 1.2.1.1.

Polyme tạo gel

Với mục đích tạo được DIG nhạy cảm với nhiệt độ, polyme được lựa chọn là poloxamer. Nó có ưu điểm là phương pháp bào chế đơn giản, tạo được dung dịch trong suốt, không gây kích ứng với mắt kể cả ở nồng độ cao [21]. Hai loại poloxamer sử dụng là PF127 và PF68. 1.2.1.2.

Polyme kết dính sinh học

Theo các kết quả nghiên cứu trước đây, poloxamer có khả năng kết dính sinh học kém, do đó một số polyme được thêm vào nhằm tăng khả năng kết dính sinh học như: Carbopol [30], chitosan [40]. Qua kết quả khảo sát sơ bộ chúng tôi đã tiến hành pha chế các DIG khác nhau chứa các nồng độ khác nhau của PF127, PF68 và chitosan, sử dụng hệ đệm phosphat pH 7,4; 6,0; 5,5 và nước cất theo quy trình bào chế như mục 2.3.1. Kết quả cho thấy các mẫu tạo ra đều không đạt yêu cầu về độ trong, độ đồng nhất, có

27

xuất hiện các dải keo trắng hay đám keo tụ của chitosan. Có thể do pH của DIG lớn hơn pKa của chitosan, lúc này chitosan ở dạng keo ngậm nước giống như tủa. Do đó các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi chỉ nghiên cứu với tá dược Carbopol. 1.2.1.3.

pH hệ đệm phosphat

Một số nghiên cứu đều sử dụng hệ đệm phosphat pH 5,5 cho DIG có tá dược Carbopol. Qua khảo sát sơ bộ với công thức có nồng độ PF127:PF68:Carbopol lần lượt là 20:10:0,1% tính theo khối lượng, sử dụng các đệm phosphat pH lần lượt là 5,5; 6,0 và 7,4. Kết quả cho thấy, các mẫu sử dụng đệm pH 6,0 và 7,4 dược chất đều tan hết, pH 5,5 dược chất không tan hết. Nguyên nhân do độ tan của NaDC thay đổi theo pH môi trường, độ tan của NaDC giảm khi pH môi trường giảm [5], [19]. Khi sử dụng pH 7,4 Carbopol trương nở tạo gel, mẫu thu được chảy lỏng rất kém ở điều kiện nhiệt độ phòng, không phù hợp cho việc nhỏ giọt thuốc khi sử dụng. Chỉ có mẫu sử dụng đệm pH 6,0 tạo được dạng dung dịch chảy lỏng tự do ở nhiệt độ phòng và dược chất tan hoàn toàn. Do đó hệ đệm phosphat pH 6,0 được sử dụng. 1.2.2. Khảo sát tỉ lệ các thành phần Nồng độ dược chất trong DIG bào chế là 0,1% kl/kl, tương tự như nồng độ chế phẩm dung dịch nhỏ mắt NaDC thương mại và các nghiên cứu trước đây về DIG NaDC [10]. 1.2.2.1.

Polyme tạo gel

Tiến hành khảo sát lựa chọn tỉ lệ PF127 và PF68 nhằm bào chế được DIG dựa trên các tiêu chí:  Có thể chảy lỏng dễ dàng ở nhiệt độ phòng 25±1oC và điều kiện bảo quản 4±1oC.  Tạo dạng gel ở nhiệt độ 35±1oC.  Gel tạo được bền trong một thời gian nhất định trong dung dịch nước mắt nhân tạo. Theo các nghiên cứu trước đây, lượng Carbopol trong công thức không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng rất ít tới nhiệt độ tạo gel của DIG [10], nên khi lựa chọn tỷ

28

lệ hai loại poloxamer để DIG có nhiệt độ và khả năng tạo thích hợp, chúng tôi bào chế các công thức không có Carbopol. Thực hiện theo phương pháp được mô tả ở mục 2.3.1, các DIG khảo sát đều chứa 0,1% dược chất, hệ đệm phosphat pH 6,0 và không có Carbopol. Mỗi công thức bào chế với lượng 100g. Các công thức khảo sát được trình bày ở bảng 3.5. Bảng 3.5: Thành phần công thức khảo sát lựa chọn tỷ lệ PF127: PF68. PF PF Công 127 68 thức %kl/kl

Công thức

PF 127

PF 68

%kl/kl

Công thức

PF 127

PF 68

%kl/kl

PF 127

Công thức

PF 68

%kl/kl

CT1

16

0

CT6

16

8

CT 11

16

10

CT 16

16

11

CT2

18

0

CT7

18

8

CT 12

18

10

CT 17

18

11

CT3

19

0

CT8

19

8

CT 13

19

10

CT 18

19

11

CT4

20

0

CT9

20

8

CT 14

20

10

CT 19

20

11

CT5

22

0

CT 10

22

8

CT 15

22

10

CT 20

22

11

Đo nhiệt độ tạo gel, khả năng tạo gel và khả năng chảy lỏng của DIG theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.3. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.8. nhiệt độ tạo gel (oC) 45

PF68-0% PF68-8%

40

PF68-10%

35

PF68-11%

30 25 20 % PF127

15 16

18

19

20

22

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của PF127 và PF68 tới nhiệt độ tạo gel

29

Bảng 3.6: Nhiệt độ tạo gel, khả năng tạo gel và khả năng chảy lỏng của các công thức khảo sát tỷ lệ poloxamer. Khả năng chảy lỏng

Nhiệt độ tạo gel (oC)

4±1 C

25±1 C

35±1 C

CT1

36,4± 0,3

+++

25,1± 0,1

+++

+ −

−

CT2

+++ −

CT3

23,3± 0,4

+++

−

−

+

CT4

21,5± 0,1

+++

−

−

+

CT5

19,2± 0,3

+++

−

−

CT6

39,1±0,1

+++

+++

++

+ −

CT7

36,0±0,5

+++

+++

CT8

34,0±0,4

+++

++

+ −

++

CT9

32,1±0,3

+++

++

−

+++

CT10

26,2±0,3

+++

−

−

CT11

41,0±0,1

+++

+++

+++

+++ −

CT12

37,5±0,1

+++

+++

CT13

34,4±0,2

+++

+++

+ −

+++

CT14

32,5±0,3

+++

+++

−

+++

CT15

27,9±0,1

+++

+

−

+++

CT16

40,5±0,6

+++

+++

−

CT17

34,8±0,1

+++

+++

+++ −

++

CT18

33,4±0,2

+++

+++

−

++

CT19

32,0±0,1

+++

++

−

+++

CT20 Chú thích:

25,4±0,5

+++

−

−

+++

o

o

o

Khả năng tạo gel +

−

−

Khả năng chảy lỏng (thời gian chảy t): “− ” không chảy; “+” kém (t > 6 giây); “++” trung bình (3 < t < 6 giây); “+++” tốt (t < 3 giây). Khả năng tạo gel: “− ” không tạo gel; “+” tạo gel sau vài giây và tan sau vài phút; “++” tạo gel ngay lập tức và tan sau thời gian từ 10-20 phút; “+++” tạo gel ngay lập tức và duy trì được > 20 phút.

30

Nhận xét: * Ảnh hưởng của PF127 và PF68 đến nhiệt độ tạo gel Khi nồng độ PF68 không thay đổi, tăng nồng độ PF127 từ 16, 18, 19, 20, 22% nhiệt độ tạo gel giảm dần. Do ở nhiệt độ thấp, poloxamer ở dạng các tiểu đơn vị micell, khi nhiệt độ tăng lên, các micell nở ra và tạo thành các mạng lưới liên kết ngang, làm tăng độ nhớt [21]. Nồng độ PF127 tăng làm tăng cả về số lượng và tần suất vướng mắc vào mạng lưới gel của các micell, làm cho nhiệt độ tạo gel giảm. Khi nồng độ PF127 không đổi, tăng nồng độ PF68 từ 0, 8, 10% nhiệt độ tạo gel tăng dần, nhưng sau đó khi nồng độ PF68 tăng lên đến 11% nhiệt độ tạo gel lại giảm. Do khi tăng nồng độ PF68 từ 0-10% làm thay đổi tỷ lệ các nhóm ưa nước và kỵ nước của phân tử poloxamer (PEO:PPO), tỷ lệ EO:PO tăng lên, tăng cường liên kết hydro giữa poloxamer và nước, dẫn đến tăng nhiệt độ tạo gel. Nhưng khi PF68 tăng thêm nữa, không chỉ thay đổi tỷ lệ EO:PO mà các micell PF68 còn tham gia vào cấu trúc gel, làm giảm nhiệt độ tạo gel. Với tỷ lệ PF127 từ 18-20% và tỷ lệ PF68 từ 8-11% thì DIG có nhiệt độ tạo gel gần 35oC. Kết quả này tương tự như kết quả mà Yong Quian và các cộng sự đã đưa ra khi nghiên cứu DIG nhỏ mắt methazolamid sử dụng PF127 và PF68 làm tác nhân tạo gel nhạy cảm nhiệt [31]. Tuy nhiên nghiên cứu của Asasutjarit và các cộng sự khi đánh giá và tối ưu hóa công thức DIG nhỏ mắt natri diclofenac, khảo sát với nồng độ PF127 bằng 14, 20, 26%, nồng độ PF68 bằng 0, 8, 11, 14%, đã chỉ ra rằng: - Nhiệt độ tạo gel giảm khi nồng độ PF127 tăng. - Nhiệt độ tạo gel tăng khi nồng độ PF68 tăng, tác giả giải thích do khi tăng nồng độ PF 68 làm tỷ lệ EO:PO tăng dẫn tới tăng nhiệt độ tạo gel [10]. Khác với kết quả khảo sát cho thấy nhiệt độ tạo gel chỉ tăng khi nồng độ PF68 tăng từ 0-10%, sau đó giảm. *

Về hình thức, khả năng chảy lỏng và khả năng tạo gel

31

Tất cả các công thức đều có thể chất trong suốt, không màu và ở dạng dung dịch ở nhiệt độ 4±1oC. Các công thức CT1, CT6, CT7, CT11, CT12, CT16 không tạo gel ở cả 3 nhiệt độ khảo sát. Các công thức CT2, CT3, CT4, CT5, CT10, CT20 tạo gel và CT15 chảy lỏng rất kém ở nhiệt độ phòng. Chỉ có các công thức CT8, CT9, CT13, CT14, CT 17, CT18, CT19 chảy lỏng từ trung bình đến tốt ở các nhiệt độ 4±1oC và 25±1oC; ở 35oC có dạng gel đồng thời có khả năng tạo gel trong STF trong thời gian >10 phút. Các DIG này có tỷ lệ PF127 từ 18-20% , tỷ lệ PF68 từ 811% và có nhiệt độ tạo gel gần 35oC. Vì vậy các công thức này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 1.2.2.2.

Lượng Carbopol

Do Carbopol có tính acid, làm giảm pH của DIG ngay cả khi đã sử dụng hệ đệm. pH giảm thấp làm tăng kích ứng với mắt, do vậy lượng Carbopol được sử dụng từ 0-0,2% . Với các thành phần và tỷ lệ như trên, tiến hành bào chế các công thức DIG được trình bày trong bảng 3.7 theo quy trình như ở mục 2.3.1. Mỗi công thức bào chế với lượng 100g, nồng độ NaDC 0,1% kl/kl và dung dịch đệm phosphat pH 6,0 vừa đủ 100%. Bảng 3.7: Thành phần các công thức nghiên cứu. Công thức

F1

F2

F3

F4

F5

F6

F7

PF127

%kl/kl

18

18

18

19

19

19

19

PF68

%kl/kl

11

11

11

8

8

8

10

Carbopol

%kl/kl

0

0,1

0,2

0

0,1

0,2

0

F8

F9

F10

F11

F12

F13

F14

Công thức PF127

%kl/kl

19

19

19

19

19

20

20

PF68

%kl/kl

10

10

11

11

11

8

8

Carbopol

%kl/kl

0,1

0,2

0

0,1

0,2

0

0,1

F15

F16

F17

F18

F19

F20

F21

Công thức PF127

%kl/kl

20

20

20

20

20

20

20

PF68

%kl/kl

8

10

10

10

11

11

11

Carbopol

%kl/kl

0,2

0

0,1

0,2

0

0,1

0,2

32

1.3.

Đánh giá một số đặc tính vật lý của dung dịch nhỏ mắt in situ gel

1.3.1. Hình thức: Các mẫu thu được có thể chất đồng nhất. Các mẫu không chứa Carbopol đều trong suốt, không màu. Các mẫu chứa Carbopol không trong suốt: mẫu có nồng độ Carbopol 0,1% hơi đục hoặc gần như trong suốt; các mẫu có nồng độ Carbopol 0,2% hơi đục. Nhận xét: Mặc dù độ tan của NaDC trong dung dịch đệm phosphat pH 6,0 là 0,59 mg/mL, nhỏ hơn nồng độ 0,1% (tương ứng với 1mg/mL) sử dụng, nhưng dược chất đều tan hết trong tất cả các công thức khảo sát, có thể là nhờ khả năng làm tăng độ tan của poloxamer [17], [19]. Các DIG chứa carbopol đục có thể là do pH của chúng nhỏ hơn pKa của Carbopol (6,0±0,5) [41]. Ở môi trường có pH nhỏ hơn pKa, Carbopol tạo thành dung dịch đục [17]. 1.3.2. pH Đo pH của các công thức được tiến hành như mục 2.3.2.2, kết quả thu được trình bày ở bảng 3.8. Bảng 3.8: pH của các DIG khảo sát ở 25±1oC. Công thức

pH

Công thức

pH

Công thức

pH

F1

6,49±0,21

F8

5,45±0,11

F15

4,70±0,20

F2

5,51±0,13

F9

4,66±0,26

F16

6,47±0,15

F3

4,78±0,28

F10

6,50±0,05

F17

5,41±0,12

F4

6,30±0,15

F11

5,52±0,04

F18

4,77±0,07

F5

5,48±0,23

F12

4,82±0,10

F19

6,45±0,06

F6

4,69±0,10

F13

6,56±0,22

F20

5,39±0,13

6,26±0,01 F7 Nhận xét:

F14

5,54±0,09

F21

4,81±0,08

pH của các DIG từ 4,66 đến 6,56; nằm trong khoảng pH giới hạn của thuốc dùng cho nhãn khoa từ 3,5 đến 8,5 [39].

33

Các DIG không chứa Carbopol có pH từ 6,26 đến 6,56. Các DIG chứa 0,1% Carbopol có pH từ 5,39 đến 5,54. Các DIG chứa 0,2% Carbopol có pH từ 4,66 đến 4,82. Khi nồng độ Carbopol tăng dần từ 0-0,1-0,2%, pH của DIG giảm dần, nguyên nhân do Carbopol có tính acid [10], [17]. 1.4.

Đánh giá một số đặc tính tạo gel của dung dịch in situ gel DIG có ưu điểm là có thể sử dụng đơn giản bằng cách nhỏ giọt như thuốc nhỏ

mắt dung dịch, vừa kéo dài thời gian lưu ở mắt do chuyển thành dạng gel ở trước giác mạc, do đó việc đánh giá đặc tính tạo gel của DIG rất quan trọng. Đặc tính tạo gel của DIG được đánh giá thông qua: khả năng chảy lỏng, nhiệt độ tạo gel, khả năng tạo gel, độ nhớt. Tiến hành như mục 2.3.3, kết quả được trình bày ở bảng 3.9 và bảng 3.10. 1.4.1. Nhiệt độ tạo gel Nhận xét: Carbopol nhìn chung không ảnh hưởng tới nhiệt độ tạo gel của DIG, các công thức cùng tỷ lệ PF127: PF68, nhiệt độ tạo gel của DIG khi có 0; 0,1; 0,2% Carbopol không chênh lệch nhiều (chênh lệch nhiệt độ tạo gel nhiều nhất là 0,4oC của DIG F1 và F3). Nồng độ 2 loại poloxamer quyết định nhiệt độ tạo gel của DIG. Khi tăng nồng độ PF127 làm giảm nhiệt độ tạo gel của DIG. Khi tăng nồng độ PF68, nhiệt độ tạo gel tăng, nhưng khi tăng PF68 vượt quá 10%, nhiệt độ tạo gel lại giảm. 1.4.2. Khả năng tạo gel Nhận xét: Các DIG có nồng độ poloxamer PF127:PF68 bằng 18:11% và 19:8% từ F1 đến F6 có khả năng tạo gel kém hơn các DIG từ F7 đến F21 (nồng độ poloxamer là 19:10%, 19:11%, 20:8%, 20:10%, 20:11%). Do các DIG này có nhiệt độ tạo gel cao hơn các DIG còn lại, nên khi nhỏ vào STF, gel sẽ hình thành chậm hơn. Với cùng tỷ lệ poloxamer, khả năng tạo gel của công thức chứa 0,2% > 0,1%>0% Carbopol. Với các DIG F1, F2, F3 có tỷ lệ poloxamer PF127:PF68 là 18:11% và Carbopol lần lượt là 0-0,1-0,2% thì F1 tạo gel chậm hơn và tan nhanh

34

trong vài phút, F2, F3 tạo gel ngay lập tức và gel F3 duy trì được lâu hơn F2. DIG tạo thành gel càng bền vững trong môi trường thí nghiệm khi nồng độ Carbopol càng cao, có thể là do nước mắt nhân tạo pH 7,4 làm ion hóa các nhóm carboxyl trong phân tử Carbopol, giữa chúng xuất hiện lực đẩy làm mở rộng cấu trúc phân tử và tạo mạng lưới không gian 3 chiều vững chắc . Công thức F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 F13 F14 F15 F16 F17 F18 F19 F20 F21 Chú thích:

Bảng 3.9: Kết quả đánh giá một số đặc tính tạo gel của DIG Khả năng chảy lỏng Khả năng Nhiệt độ tạo gel (oC) o tạo gel 4±1 C 25±1oC 35±1 oC − 34,8±0,3 ++ +++ +++ − 34,5±0,1 ++ +++ +++ − 34,4±0,4 ++ +++ +++ − 34,0±0,5 ++ +++ +++ − 34,0±0,4 ++ +++ +++ − 33,9±1,0 ++ +++ +++ − 34,4±0,1 +++ +++ +++ − 34,5±0,2 +++ +++ +++ − 34,3±0,7 +++ +++ ++ − 33,4±0,5 +++ +++ +++ − 33,3±0,1 +++ +++ +++ − 33,2±0,3 +++ +++ ++ − 32,1±0,1 ++ +++ ++ − 32,0±0,3 +++ +++ ++ − 31,8±0,4 +++ +++ ++ − 32,5±0,1 +++ +++ +++ − 32,1±0,3 +++ +++ +++ − 32,1±0,7 +++ +++ ++ − 32,0±0,2 +++ +++ ++ − 31,9±0,1 +++ +++ ++ − 32,2±0,3 +++ +++ ++

Khả năng chảy lỏng (thời gian chảy t): “− ” không chảy; “+” kém (t > 6 giây); “++” trung bình (3 < t < 6 giây); “+++” tốt (t < 3 giây). Khả năng tạo gel: “−” không tạo gel; “+” tạo gel sau vài giây và tan sau vài phút;

35

“ ++” tạo gel ngay lập tức và tan sau thời gian từ 10-20 phút; “+++” tạo gel ngay lập tức và duy trì được > 20 phút. 1.4.3. Độ nhớt Độ nhớt của DIG ở các nhiệt độ là một trong những yếu tố phản ánh trạng thái của DIG ở các nhiệt độ đó. DIG có độ nhớt thấp có thể dễ dàng nhỏ giọt, khi DIG chuyển thành dạng gel, độ nhớt của nó tăng lên. DIG nên có độ nhớt từ 51000 trước khi tạo và sau khi tạo gel ở mắt, độ nhớt từ 50- 50000 [29]. Bảng 3.10: Kết quả đo độ nhớt. Công thức F1

Độ nhớt ở 4±1oC () 147,0±5,5

Độ nhớt ở 25±1oC () 216,2±6,6

Độ nhớt ở 35±1oC () 6687,2±40,6

F2

280,1±10,3

450,4±12,0

11365,5±100,2

F3

375,3±13,3

685,6±21,5

15074,6±88,3

F4

113,5±4,0

190,7±5,5

6478,7±60,0

F5

228,1±6,9

391,2±12,4

11021,1±50,5

F6

300,7±9,8

598,8±15,6

14500,1±90,4

F7

142,5±4,7

208,9±5,1

6679,4±20,4

F8

250,9±4,6

402,5±11,0

11398,4±45,8

F9

360,8±12,4

600,3±12,8

15103,4±77,9

F10

155,0±3,3

269,7±6,9

6803,5±49,0

F11

293,0±10,4

531,3±14,5

12354,2±56,7

F12

501,9±15,8

820,8±20,7

17327,6±78,6

F13

130,4±5,7

300,5±7,7

6585,2±33,5

F14

287,4±9,5

617,6±15,4

10870,0±45,7

F15

450,5±8,8

995,2±20.6

15056,5±67,5

F16

160,4±7,7

247,7±6,4

6760,0±17,9

F17

300,5±8,9

483,2±13,6

12680,6±90,8

F18

484,9±14,5

759,8±20,8

16944,4±100,9

F19

174,4±5,6

253,2±4,3

7100,3±41,5

F20

337,4±10,9

514,8±16,6

13645,7±89,0

F21

499,5±12,4

784,2±17,5

17675,3±120,9

36

17675.3

F21-20:11:0,2 13645.7

F20-20:11:0,1

35±1 °C 25±1 °C

7100.3

F19-20:11:0

4±1 °C 14500.1

F6-19:8:0,2 11021.1

F5-19:8:0,1 6478.7

F4-19:8:0

độ nhớt () 0

5000

10000

15000

20000

Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ nhớt của các DIG có nồng độ poloxamer PF127:PF68 bằng 19:8% và 20:11% theo nhiệt độ. Nhận xét: Độ nhớt của DIG tăng tỷ lệ với nhiệt độ, tổng lượng poloxamer và lượng Carbopol sử dụng. Độ nhớt ở 35±1oC cao hơn rất nhiều so với ở 4±1oC và 25±1oC, do lúc này DIG đã chuyển sang dạng gel. Lượng poloxamer càng cao độ nhớt của DIG càng tăng, ví dụ ở 4±1oC độ nhớt của F4-19:8< F7-19:10< F19-20:11 (113< 142< 174 ). Carbopol làm tăng rõ rệt độ nhớt của DIG, với cùng nồng độ PF127 và PF68, độ nhớt của các DIG chứa 0,2 và 0,1% Carbopol lần lượt gấp khoảng 3 và 2 lần so với DIG không chứa Carbopol. Ở 35oC, độ nhớt của các DIG nằm trong khoảng từ 6478,7- 17675,3, nẳm trong khoảng độ nhớt thích hợp sau khi tạo gel của DIG (50-50000 ). 1.4.4. Khả năng chảy lỏng Nhận xét: Nhìn chung khả năng chảy lỏng của các DIG phụ thuộc vào độ nhớt của nó. Tất cả các DIG đều chảy lỏng tự do ở 4±1oC, không chảy lỏng ở 35±1oC. Ở 25±1oC, các công thức DIG F13, F14, F15 và F19, F20, F21 tương ứng với nồng độ

37

poloxamer PF127:PF68 là 20:8% và 20:11%; các DIG F12-19:11:0,2 và F1820:10:0,2 chỉ chảy lỏng ở mức trung bình, các DIG còn lại đều chảy lỏng tốt. Tóm lại, các DIG với nồng độ poloxamer PF127:PF68 là 18:11% và 19:8% đáp ứng yêu cầu về khả năng chảy lỏng ở 25± 1oC, nhưng khả năng tạo gel kém (gel tạo thành trong dung dịch STF chậm và duy trì trong thời gian < 20 phút). Các DIG có nồng độ poloxamer PF127:PF68 là 20:11% và 20:8% có khả năng tạo gel ngay lập tức và bền trong STF nhưng lại có nhiệt độ tạo gel thấp (khoảng 32oC) và kém linh động ở 25±1oC. Tương tự như thế với các DIG có nồng 3 polyme là 19:10:0,2%; 19:11:0,2% và 20:10:0,2%. Các DIG F7, F8, F10, F11, F16, F17 có nồng độ poloxamer PF127:PF68 là 19:10%; 19:11% và 20:10% với nồng độ Carbopol từ 0-0,1% vừa chảy lỏng tốt ở 25±1oC vừa tạo gel bền trong STF, có nhiệt độ tạo gel gần 35oC phù hợp để dùng nhỏ giọt ở điều kiện phòng và tạo được gel trước giác mạc. 1.5.

Đánh giá khả năng kết dính sinh học của dung dịch in situ gel Khả năng kết dính sinh học của DIG được đánh giá theo phương pháp ở mục

2.3.4. Kết quả được trình bày ở bảng 3.11 và hình 3.10. Bảng 3.11: Kết quả thử kết dính sinh học. Công thức

Lực kết dính sinh học (10-3 N/cm2)

Công thức

Lực kết dính sinh học (10-3 N/cm2)

Công thức

Lực kết dính sinh học (10-3 N/cm2)

F1

11,25

F8

19,12

F15

20,12

F2

14,62

F9

19,37

F16

16,25

F3

15,62

F10

15,50

F17

20,99

F4

12,87

F11

19,25

F18

24,37

F5

17,62

F12

19,50

F19

17,87

F6

18,87

F13

13,87

F20

23,49

F7

15,25

F14

18,62

F21

25,74

38

Nhận xét: Nhìn chung lực kết dính sinh học tỷ lệ thuận với khả năng tạo gel của DIG. Do DIG có khả năng tạo gel tốt hơn sẽ tạo gel nhanh hơn và bền vững hơn khi bị pha loãng bởi STF trên giác mạc, cấu trúc gel vững chắc tăng khả năng kết dính của gel. Với cùng nồng độ Carbopol 0,1%, DIG có nồng độ poloxamer PF127:PF68 là 18:11%, có khả năng kết dính sinh học kém nhất (14,62.10-3N/cm2), DIG có nồng độ poloxamer 20:11% có khả năng kết dính sinh học cao nhất (23,49.10-3N/cm2). 30

Lực kết dính sinh học (10-3 N/cm2)

25.74

25

23.49

20

17.87 14.62

15

15.62

11.25 10 5 0 F1-18:11:0

F2-18:11:0,1 F3-18:11:0,2 F19-20:11:0 F20-20:11:0,1 F21-20:11:0,2

Hình 3.10: Đồ thị so sánh lực kết dính sinh học của các công thức có cùng nồng độ PF127:PF68 bằng 18:11% và 20:11% Với cùng nồng độ poloxamer, khi nồng độ Carbopol tăng thì lực kết dính sinh học tăng. Ví dụ với cùng nồng độ poloxamer PF127:PF68 là 20:11%, khi Carbopol tăng từ 0-0,1-0,2% lực kết dính sinh học tăng từ 17,87-23,49-25,74.10-3-N/cm2. Nguyên nhân là do Carbopol làm tăng độ nhớt của DIG, làm tăng khả năng bám dính của gel với niêm mạc. 1.6.

Đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro Các mẫu DIG được đánh giá khả năng giải phóng dược chất qua màng theo

phương pháp được mô tả ở mục 2.3.5. Định lượng dược chất giải phóng bằng

39

phương pháp HPLC trình bày ở mục 2.3.5 và 2.3.6. Kết quả tỷ lệ dược chất giải phóng được trình bày trong bảng 3.12. Bảng 3.12: Kết quả tỷ lệ dược chất giải phóng từ DIG trong 6 giờ. Tỷ lệ dược chất giải phóng tại các thời điểm (%) Công thức 1 giờ

2 giờ

3 giờ

4 giờ

5 giờ

6 giờ

F1

3,00

4,05

4,43

4,96

5,07

5,20

F2

20,51

35,43

46,30

55,40

63,00

70,42

F3

21,04

36,99

48,23

57,08

65,41

71,21

F4

2,70

3,60

3,91

4,48

4,85

5,06

F5

18,10

31,55

42,28

50,00

56,66

61,32

F6

19,00

32,65

43,00

51,09

57,34

63,70

F7

2,75

3,72

4,01

4,52

4,90

5,10

F8

18,04

32,45

42,50

52,10

57,71

63,00

F9

19,78

33,90

44,50

53,78

60,49

65,40

F10

2,50

3,50

3,80

4,35

4,80

4,97

F11

16,33

30,05

39,17

48,25

53,53

58,00

F12

17,64

31,00

41,01

49,62

55,86

59,77

F13

2,03

2,75

3,28

4,00

4,50

4,71

F14

12,25

25,17

36,17

43,68

48,54

50,42

F15

12,78

26,28

36,19

45,68

50,07

52,32

F16

2,20

3,09

3,41

4,25

4,60

4,87

F17

13,20

27,66

36,07

44,35

50,88

53,07

F18

14,24

29,08

40,09

47,98

52,65

56,53

F19

1,50

2,33

2,90

3,70

4,12

4,53

F20

10,05

23,22

33,42

43,12

47,04

50,04

F21

10,56

23,23

35,74

44,35

48,00

51,30

40

Nhận xét: Tỷ lệ dược chất giải phóng in vitro của 21 mẫu DIG tăng theo thời gian thử giải phóng. Tỷ lệ dược chất giải phóng tại các thời điểm của mẫu F3-18:11:0,2 là cao nhất, F19-20:11:0 thấp nhất, % dược chất giải phóng sau 6 giờ lần lượt là 71,21 và 4,53%. Ảnh hưởng của Carbopol.

*

% dược chất giải phóng

70 60 50 40

F7-0 F8-0,1

30

F9-0,2

20 10 0 0

1

2

3

4

5 6 thời gian (giờ)

Hình 3.11: Đồ thị so sánh tỷ lệ dược chất giải phóng của các DIG F7, F8 và F9 có cùng nồng độ PF127: PF68 bằng 19:10% và nồng độ Carbopol lần lượt là 0; 0,1; 0,2%. Các công thức không chứa Carbopol tỷ lệ dược chất giải phóng rất thấp sau 6 giờ (từ 4,53- 5,2% dược chất giải phóng). Các công thức có Carbopol tỷ lệ dược chất giải phóng được cải thiện rõ rệt, sau 6 giờ có tới 50,04-71,21% dược chất giải phóng. Cho thấy Carbopol ảnh hưởng nhiều tới khả năng giải phóng dược chất qua màng. Do Carbopol làm giảm pH của DIG so với DIG không có Carbopol, pH giảm làm giảm mức độ ion hóa của NaDC, làm tăng tỷ lệ NaDC thấm qua giác mạc mắt thỏ [8].

41

Với cùng tỷ lệ PF127:PF68, DIG chứa 0,2% Carbopol có tỷ lệ dược chất giải phóng qua màng cao hơn DIG chỉ chứa 0,1% Carbopol, nhưng cũng không khác biệt đáng kể. Nguyên nhân do mặc dù tỷ lệ dược chất không ion hóa tăng nhưng khi tăng nồng độ Carbopol từ 0,1-0,2%, độ nhớt tăng, gel tạo thành vững chắc hơn, hạn chế phần nào sự giải phóng dược chất qua màng. * Ảnh hưởng của poloxamer 80 % dược chất giải phóng

70 60 50 40 30

F2-18:11

20

F8-19:10 F20-20:11

10 0 0

1

2

3

4

5 6 thời gian (giờ)

Hình 3.12: Đồ thị so sánh tỷ lệ dược chất giải phóng của các DIG F2, F8, F20 có cùng nồng độ Carbopol 0,1% và nồng độ PF127: PF68 lần lượt là 18:11; 19:10; 20:11%. Với các DIG có cùng tỷ lệ Carbopol, tỷ lệ dược chất giải phóng phụ thuộc vào nồng độ PF127:PF68. Với cùng tỷ lệ Carbopol 0,1%, công thức F20 có tỷ lệ dược chất giải phóng sau mỗi giờ nhỏ hơn so với công thức F2 (% dược chất giải phóng sau 6 giờ tương ứng là 50,04 và 70,42%). Vì F20-20:11 có nồng độ poloxamer cao hơn, khả năng tạo gel lớn hơn F2-18:11, do đó F20 tạo được gel có cấu trúc vững chắc hơn, hạn chế khả năng khuếch tán của dược chất trong gel. * Dựa trên các kết quả khảo sát về các đặc tính tạo gel, khả năng kết dính sinh học và khả năng giải phóng dược chất in vitro, thấy rằng:

42

- Trong 21 công thức khảo sát, 6 DIG có đặc tính tạo gel phù hợp là F719:10:0, F8-19:10:0,1, F10-19:11:0, F11-19:11:0,1, F16-20:10:0 và F17-20:10:0,1. - DIG nào có nồng độ Carbopol càng cao, khả năng kết dính sinh học và giải phóng dược chất in vitro càng tốt. Với cùng nồng độ Carbopol, DIG có khả năng tạo gel càng cao, khả băng kết dính sinh học càng tốt nhưng % dược chất giải phóng in vitro lại giảm. - Trong 6 DIG có đặc tính tạo gel phù hợp trên, DIG F17 có lực kết dính tốt nhất (20,99.10-3N/cm2) > F8 và F11 có lực kết dính sinh học gần bằng nhau (19,12 và 19,25.10-3N/cm2) > F7, F10 và F16 chênh lệch không nhiều (15,25; 15,50 và 16,25.10-3N/cm2). - Các DIG không chứa Carbopol F7, F10, F16 có tỷ lệ dược chất giải phóng in vitro sau 6 giờ thấp (5,10; 4,97 và 4,87%). Tỷ lệ dược chất giải phóng sau 6 giờ của F8 (63,00%) > F11 (58,00%) > F17 (53,07%). Với mong muốn lựa chọn DIG có đặc tính tạo gel phù hợp, khả năng kết dính sinh học và giải phóng dược chất in vitro tốt nhất, đồng thời lượng poloxamer sử dụng là ít nhất, chúng tôi đã lựa chọn công thức F8-19:10:0,1. Với nồng độ PF127, PF68, Carbopol lần lượt là 19, 10, 0,1% kl/kl, có nhiệt độ tạo gel 34,5±0,2oC, tạo gel ngay lập tức và duy trì hơn 20 phút trong nước mắt nhân tạo, lực kết dính sinh học 19,12.10-3 N/cm2 và sau 6 giờ có 63% dược chất giải phóng in vitro.

43

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT A: KẾT LUẬN Với mục tiêu đã đề ra, sau quá trình thực nghiệm, đề tài đã đạt được những kết quả sau : 1. Bào chế được DIG với các thành phần (công thức cho 100g DIG): Natri diclofenac

0,1g

PF127

19g

PF68

10g

Carbopol 934

0,1g

Đệm phosphat pH 6,0

Vừa đủ 100g

2. Đánh giá được ảnh hưởng của các yếu tố trong công thức bào chế tới các chỉ tiêu chất lượng của dung dịch in situ gel - Đặc tính tạo gel:  Nhiệt độ tạo gel: tăng nồng độ PF127 làm giảm nhiệt độ tạo gel, tăng nồng độ PF68 (đến 10% kl/kl) làm tăng nhiệt độ tạo gel, sau đó, tăng nồng độ PF68 làm giảm nhiệt độ tạo gel của DIG.  Nồng độ Carbopol càng cao thì khả năng tạo gel của DIG càng cao và khả năng chảy lỏng của DIG càng kém - Khả năng kết dính sinh học:  Carbopol làm tăng kết dính sinh học của DIG.  Khả năng kết dính sinh học của DIG liên quan chặt chẽ với khả năng tạo gel của DIG, khả năng kết dính sinh học tăng khi khả năng tạo gel tăng. DIG với nồng độ PF127:PF68 nào tạo được gel ngay lập tức và bền trong dung dịch nước mắt nhân tạo thì có khả năng kết dính sinh học tốt hơn so với các DIG tạo gel chậm và gel nhanh tan. - Khả năng giải phóng dược chất in vitro:  Tăng nồng độ Carbopol làm tăng khả năng giải phóng dược chất in vitro.

44

 DIG với nồng độ PF127:PF68 nào có nhiệt độ tạo gel càng nhỏ và tạo được gel càng đặc thì khả năng giải phóng dược chất in vitro càng kém.

B: ĐỀ XUẤT 1. Tiếp tục hoàn thiện công thức bào chế DIG natri diclofenac. 2. Lựa chọn phương pháp tiệt khuẩn thích hợp cho dung dịch nhỏ mắt in situ gel natri diclofenac: tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm, lọc vô khuẩn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1.

Bộ môn Bào Chế (2004), Sinh dược học Bào Chế, Nhà xuất bản Y học, tr. 52-66.

2.

Bộ môn Bào Chế (2006), Kỹ thuật bào chế và sinh dược học các dạng thuốc - tập 1, Nhà xuất bản Y học, tr. 46,180-271.

3.

Bộ môn Hóa Dược (2007), Hóa Dược- tập 1, Nhà xuất bản Y học, tr. 110111.

4.

Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, tr 222-225, PL-221.

5.

Huỳnh Văn Hóa, et al. (2002), "Kết hợp thiết kế tối ưu hóa công thức với thẩm định trước quy trình sản xuất", Tạp chí Dược học, 12, pp. 20-23.

6.

Vidal Việt Nam 2009, tr. 727-727.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 7.

Agrawal A. K., et al. (2012), "In situ gel systems as 'smart' carriers for sustained ocular drug delivery", Expert Opin Drug Deliv, 9(4), pp. 383-402.

8.

Ahuja M., et al. (2006), "Effect of formulation factors on in-vitro permeation of diclofenac from experimental and marketed aqueous eye drops through excised goat cornea", Yakugaku Zasshi, 126(12), pp. 1369-1375.

9.

Ahuja M., et al. (2009), "Stability studies on aqueous and oily ophthalmic solutions of diclofenac", Yakugaku Zasshi, 129(4), pp. 495-502.

10.

Asasutjarit

R.,

et

al.

(2011),

"Optimization

and

evaluation

of

thermoresponsive diclofenac sodium ophthalmic in situ gels", Int J Pharm, 411(1-2), pp. 128-135.

11.

Bhowmik M., et al. (2011), "Effect of salts on gelation and drug release profiles of methylcellulose-based ophthalmic thermo-reversible in situ gels", Pharm Dev Technol, 16(4), pp. 385-391.

12.

Bourlais C. L., et al. (1998), "Ophthalmic drug delivery systems--recent advances", Prog Retin Eye Res, 17(1), pp. 33-58.

13.

Burgalassi S., et al. (2000), "Xyloglucan as a novel vehicle for timolol: pharmacokinetics and pressure lowering activity in rabbits", J Ocul Pharmacol Ther, 16(6), pp. 497-509.

14.

Chaudhary B. and Verma S. (2014), "Preparation and evaluation of novel in situ gels containing acyclovir for the treatment of oral herpes simplex virus infections", The Scientific World Journal, 2014, p. 7.

15.

Chen-Chow P.-C. and Frank S. G. (1981), "In vitro release of lidocaine from pluronic F-127 gels", International Journal of Pharmaceutics, 8(2), pp. 8899.

16.

Chien Y. W. (1992), Novel drug delivery systems 2nd Edition, Marcel Dekker Inc, pp 269-300.

17.

Dumortier G., et al. (2006), "A review of poloxamer 407 pharmaceutical and pharmacological characteristics", Pharm Res, 23(12), pp. 2709-2728.

18.

Escobar-Chavez J. J., et al. (2006), "Applications of thermo-reversible pluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations", J Pharm Pharm Sci, 9(3), pp. 339-358.

19.

Herzfeldt and Kümmel (1983), "Dissociation constants, solubilities and dissolution rates of some selected nonsteroidal antiinflammatories", Drug Development and Industrial Pharmacy, 9(5), pp. 767-793.

20.

Jeong B., et al. (2002), "Thermosensitive sol-gel reversible hydrogels", Adv Drug Deliv Rev, 54(1), pp. 37-51.

21.

Klouda L. and Mikos A. G. (2008), "Thermoresponsive hydrogels in biomedical applications", Eur J Pharm Biopharm, 68(1), pp. 34-45.

22.

Liu Z., et al. (2006), "Study of an alginate/HPMC-based in situ gelling ophthalmic delivery system for gatifloxacin", Int J Pharm, 315(1-2), pp. 1217.

23.

Malik P. and Satyananda S. (2014), "pH-induced in situ gelling system of an anti-infective drug for sustained ocular delivery", Journal of Applied Pharmaceutical Science, 4(1), pp. 101-104.

24.

Merck & Co. I. (2001), The Merck index 13th, p542.

25.

Miyazaki S., et al. (2001), "In situ gelling xyloglucan formulations for sustained release ocular delivery of pilocarpine hydrochloride", Int J Pharm, 229(1-2), pp. 29-36.

26.

Nanjawade B. K., et al. (2007), "In situ-forming hydrogels for sustained ophthalmic drug delivery", J Control Release, 122(2), pp. 119-134.

27.

Nerella A., et al. (2014), "Formulation and evaluation of in-situ mucoadhesive nasal gel of montelukast sodium", Der Pharmacia Sinica, 5(2), pp. 1-8.

28.

Nirmal H., et al. (2010), "In-Situ gel: New trends in Controlled and Sustained Drug Delivery System", International Journal of PharmTech Research, 2(2), pp. 1398-1408.

29.

Preetha J. P., et al. (2010), "Formulation and evaluation of in situ ophthalmic gels of Diclofenac sodium", Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2(3), pp. 528-535.

30.

Qia H., et al. (2007), "Development of a poloxamer analogs/carbopol-based in situ gelling and mucoadhesive ophthalmic delivery system for puerarin", international Journal of Pharmaceutics, 337(1-2), pp. 178-187.

31.

Qian Y., et al. (2010), "Preparation and evaluation of in situ gelling ophthalmic drug delivery system for methazolamide", Drug Dev Ind Pharm, 36(11), pp. 1340-1347.

32.

Qiu Y. and Park K. (2001), "Environment-sensitive hydrogels for drug delivery", Adv Drug Deliv Rev, 53(3), pp. 321-339.

33.

Rajas N. J., et al. (2011), "In Situ Ophthalmic Gels: A developing Trend", International Journal of Pharmaceutical Sciences Review & Research, 7(1).

34.

Rajoria G. and Gupta A. (2012), "In-Situ Gelling System: A Novel Approach for Ocular Drug Delivery", American Journal of Pharmtech Research, 2(4).

35.

Reddy I. K. (1996), Ocular Therapeutics and Drug Delivery 2nd Edition, Lancaster- Basel, pp 3-22, 216- 224, 377- 539.

36.

Ron E. S. and Bromberg L. E. (1998), "Temperature-responsive gels and thermogelling polymer matrices for protein and peptide delivery", Adv Drug Deliv Rev, 31(3), pp. 197-221.

37.

Ruel-Gariepy E. and Leroux J. C. (2004), "In situ-forming hydrogels--review of temperature-sensitive systems", Eur J Pharm Biopharm, 58(2), pp. 409426.

38.

Sankar V., et al. (2005), "Formulation and stability evaluation of diclofenac sodium ophthalmic gels", Indian journal of pharmaceutical sciences, 67(4), pp. 473-476.

39.

The United States Pharmacopedial Convention (2007), 2008 USP 31/NF 26, pp 618-620.

40.

Varshosaz

J.,

et

al.

(2008),

"Deg

of

a

thermosensitive

chitosan/poloxamer in situ gel for ocular delivery of ciprofloxacin", The Open Drug Delivery Journal 2(1), pp. 61-70. 41.

Wu C., et al. (2007), "Preparation and evaluation of a Carbopol/HPMCbased in situ gelling ophthalmic system for puerarin", Yakugaku Zasshi, 127(1), pp. 183-191.

42.

Yuan Y., et al. (2012), "Thermosensitive and mucoadhesive in situ gel based on poloxamer as new carrier for rectal istration of nimesulide", International journal of pharmaceutics, 430(1), pp. 114-119.