Numeración De Coliformes 1e2a5a

NUMERACIÓN DE COLIFORMES, DETERMINACIÓN DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) I.

OBJETIVOS 

Determinar el NMP de coliformes totales en muestras de alimentos.



Determinar la numeración de coliformes mediante el método de recuento en placa.



Determinar en NMP de coliformes fecales en muestras de alimentos.

II.

FUNDAMENTO TEÓRICO COLIFORMES Las coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comúnmente en las plantas, el suelo y los animales, incluyendo a los humanos. La presencia de bacterias coliformes en el suministro de agua es un indicador de que el suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de desechos en descomposición.

Generalmente,

las

bacterias

coliformes

se

encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo. Los coliformes se introducen en gran número al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayoría de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre. La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de contaminación del agua y los alimentos. Coliformes significa con forma de Coli, refiriéndose a la bacteria principal

del

grupo,

la

Escherichia

Coli,

descubierta

por

el

bacteriólogo alemán THEODOR VON ESCHERICH en 1860. Caracteres bioquímicos: El grupo agrupa a todas las bacterias entéricas que se caracterizan por tener las siguientes propiedades bioquímicas:  ser aerobias o anaerobias facultativas  ser bacilosGram negativos;

 no ser esporógenas  fermentar la lactosa a 35 °C en 48 horas, produciendo ácido láctico y gas. Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero también ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales. Los coliformes se introducen en gran número al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayoría de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre. III.

OBJETIVOS 

Determinar el NMP de coliformes totales en muestras de alimentos.



Determinar la numeración de coliformes mediante el método de recuento en placa.



Determinar en NMP de coliformes fecales en muestras de alimentos.

IV.

EQUIPOS Y MATERIALES: 1. Los requisitos necesarios para la preparación y dilución de la 2. 3. 4. 5.

muestra de alimentos. Incubadora de 35ºC – 37ºC Pipetas bacteriológicas de 1ml Aguja de incubación con alambre de nicrón o platino iridio. Caldo verde brillante bilis lactosa (CALDO BRILA) volúmenes de 1ml

en

tubos

de

150x15mm

conteniendo

tubos

de

fermentación invertidos (75x1mm). 6. agar violeta cristal-rojo neutro- bilis (VRBA) o agar ENDO o agar Mc CONKEY V.

PROCEDIMIENTO NUMERO MÁS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES 1. Preparar las muestras de alimento de acuerdo al procedimiento recomendado. 2. Pipetear 1ml de c/u de las diluciones del homogenizado de alimento en tubos de caldo verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA) utilizando tres tubos por dilución. 3. Incubar los tubos a 35ºC – 37ºC por 24- 48 horas

4. Anotar los tubos que muestren producción de gas (prueba presuntiva) 5. De cada tubo que contiene gas, aislar sobre placas con agar-violeta cristal-rojo neutro-bilis (VRBA) o agar ENDO. 6. Incubar los tubos a 35ºC – 37ºC por 24- 48 horas 7. Confirmar la presencia de bacterias coliformes por: a. la formación de colonias, rojo oscuro con diámetro mayor de 5mm en agar VRBA. b. La formación de colonias rojas rodeadas halo en agar ENDO. 8. Anotar el número de tubos confirmados. Referirse a la tabla del NMP para expresar el resultado. NUMERACIÓN

DE

COLIFORMES

DE

ORÍGEN FECAL I.

EQUIPOS

Y

1.

MATERIALES Asa de

2.

inoculación. Baño de agua, regulado

a

44

(+/- 0.1°C) Pipetas

3.

bacteriológicas de 5ml 4. Caldo verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA), volúmenes de 10ml en

tubos

de

150x15mm.

Conteniendo

tubos

de

fermentación

invertidos (75x10mm). 5. Caldo triptosa, volúmenes de 1ml en tubos de 150x15mm. 6. Reactivo de KOVACS. II.

PROCEDIMIENTO: 1. Seleccionar los tubos de caldo verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA) que muestren formación de gas en prueba presuntiva. 2. Inocular una azada de cada tubo gas positivo a un tubo de caldo BRILA y un tubo de caldo triptosado. 3. Incubar los tubos a 44 (+/- 0.1°C) 4. Después de 24 horas de incubación, efectuar la prueba de indol en los tubos con caldo triptosa. 5. Controlar la formación de gas en los tubos con caldo BRILA después de 24 y 48 horas de incubación. 6. Los cultivos que muestran producción de gas en caldo BRILA y formación del indol en caldo triptosa son positivos para coliformes fecales.

7. Referirse a la tabla de NMP para expresar el resultado. NUMERACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES POR EL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA I.

MATERIALES: 1. Los requisitos necesarios para la preparación y dilución de la 2. 3. 4. 5.

II.

muestra. Incubadora a 45-37°C. Pipetas bacteriológicas de 1ml. Baño de agua regulada a 44- 46°C, para temperar el agar. Agar Violeta Cristal Rojo Negro Bilis (VRBA)

PROCEDIMIENTO 1. Prepara la muestra por el procedimiento recomendado para la preparación de dilución de muestra. 2. Transferir 1ml de cada dilución de la muestra a una placa de Petri estéril. 3. Adicionar a cada placa de Petri, 10-15ml de agar violeta cristal rojo bilis temperado a 44- 46°C. 4. Mezclar el contenido de las placas mediante movimientos de vaivén y rotación de cada placa. Dejar solidificar la mezcla 5 a 10 minutos, luego distribuir un adicional de 10ml de medio de plaqueado como doble capa, cubriendo completamente la superficie de medio solidificado e que inhibirá la formación de colonias en la superficie. 5. Invertir e incubar las placas durante 24 horas a 35-37°C. únicamente las colonias rojo oscuro que midan 0.5mm o más de diámetro en la placa, que tengan entre 20 y 200 colonias, se consideran bacterias coliformes. Si es posible seleccionar para el recuento solamente aquellas placas no con más de 150 colonias de estas colonias. Multiplicar el número de colonias por dilución para obtener el número de bacterias coliformes por gramo o ml de muestra.

a) Calculados a partir de los datos de Man (1975) b) En cada nivel de dilución, inocular 1ml en cada uno de tres tubos de medio.

Para calcular en NMP de las diluciones mayores que las que se señalan multiplicar el NMP por el factor de dilución apropiado de 10,100,1000 , etc. Por ejemplo , si se han seleccionado tubos provenientes de las diluciones 10-2,10-3, 10-4, multiplicar por 10 , si de las diluciones 10-3, 10-4, 10-5 multiplicar por 100 . VI.

RESULTADOS NUMERO MÁS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES NEGATIVO: Color verde botella , translucido, no hay gas en la campana POSITIVO: Color

verde

olivo,

opaco

o

turbio, si hay presencia de gas en la campana.

Grupo 1

 2 = positivo  1 = positivo

Grupo 2  4 = hay gas positivo translucido  3 = gas positivo translucido  5y6 = no hay gas  En 1 ML. Hay 2100.  2100 coliformes, es una leche no contaminada, la calidad es bastante buena.

VII.

CONCLUSIONES 

Estas bacterias se elimina con tratamiento térmico a 60 – 65ºC aunque es muy bajo y se puede aumentar la temperatura.



Coliforme lactosa positiva ocurre la fermentación y se obtiene CO 2 es decir el medio de cultivo esta dentro y va a salir en forma de gases quiere decir que la reacción es positiva y si no ocurre nada la reacción es negativa.



Cuando hablamos de coliformes totales nos referimos a casi todas su familia como lactosa positivo se le denomina con el nombre de coliforme.

VIII.

RECOMENDACIONES  Se recomienda trabajar con 3 muestras consecutivas y con 

esos valores se encuentra el resultado. Tener buena limpieza en los baños especialmente ya que estos se dispersen rápidamente, produciendo diarrea, es la bacteria

 

con la que constantemente estamos tratando en todo sentido. Esterilizar el ambiente. Se necesario trabajar con MERCK es más HOMOGENEA en caldo caldo brilla.

IX.

CUESTIONARIO 1.-¿Por qué es importante este indicador microbiológico para evaluar la calidad microbiológica de productos alimenticios? La Microbiología de Alimentos es la rama de la Microbiología que se ocupa entre otros aspectos del estudio de los microorganismos que pueden afectar la calidad sanitaria de los alimentos y el agua. El área de la microbiología de los alimentos es basta y compleja, pues incluye además las características generales de estos microorganismos, su ecología, su resistencia al medioambiente, su capacidad para sobrevivir y desarrollarse en los alimentos, las consecuencias de este desarrollo y los factores que influyen en este proceso.

La Microbiología de Alimentos se relaciona con la microbiología médica,

la veterinaria,

la virología,

la parasitología,

la genética,

la bioquímica, la tecnología de los alimentos, la epidemiología. Es importante en el diseño y aplicación del sistema de análisis de peligro y puntos críticos de control, esencial para garantizar la inocuidad de los alimentos, en el estudio de brotes de enfermedades asociadas al consumo de alimentos, en el diseño y evaluación de técnicas modernas de análisis, en el estudio de los procesos que tiene lugar durante el deterioro de los alimentos y en la fabricación de aquellos que hacen uso de microorganismos. 2.-¿Qué importancia tiene para evaluar la calidad microbiológica del suelo y del agua? El agua no debe presentar ningún tipo de riesgo que pueda causar irritación química, intoxicación o infección microbiológica que sea perjudicial

a

la

salud

humana

(VARGAS,

1996).

Debido a estas condiciones, en el caso de los microorganismos patógenos no existe un límite inferior tolerable; por lo que el agua destinada al consumo, la preparación de alimentos y bebidas o la higiene personal no debe contener ningún agente patógeno para los seres humanos. Esto se puede conseguir seleccionando fuentes de agua de buena calidad, tratando y descontaminando eficazmente el agua contaminada con heces de seres humanos o de animales u otras sustancias y protegiéndola para que no haya contaminación durante la distribución al . (OMS, 1995).

Los microorganismos en general, son encontrados comúnmente en el agua, suelo y aire. La cantidad de ellos, presentes en cualquiera de estos medios, depende de una serie de factores tales como: humedad,

temperatura

y

nutrientes.

(CACERES,

1990).

El peligro más común y difundido, relativo al agua de consumo humano es el de su contaminación microbiana con aguas servidas y excretas del hombre y de los animales.Para controlar los peligros se aplican criterios (guías y estándares) para normar la calidad de las aguas; éstos establecen requisitos que deben satisfacer las aguas para que puedan ser destinadas al consumo humano sin que afecten

su salud. El cumplimiento de los requisitos de calidad sanitaria debe reducir en forma significativa los riesgos de contraer enfermedades infectocontagiosas

(INHEM,

CUBA,

1992).

Sin

embargo,

si

los

requisitos de calidad sanitaria no son los adecuados, carecerán de importancia para proteger y controlar la calidad del agua y su aplicación no cumplirá con los objetivos previstos. 3.-¿Qué indica la presencia de E.coli? E. coli ha venido utilizándose como índice de posible presencia de patógenos de procedencia entérica (entre ellos, Salmonela) en el agua y los alimentos. 4.-Utilizando ¿qué buenas prácticas de manufactura se podría evitar el aumento del NMP de coliformes totales?  Instalaciones físicas  Instalaciones sanitarias  Manejo de desechos  Caracterización de agua  Control de plagas Tener

en cuenta todos los requisitos para un buen

proceso

práctico en un laboratorio o empresa industrial. Esto con el fin de obtener

buenos resultados que no perjudiquen la salud de los

seres humanos y la institución tenga un buen prestigio higiénico.

I.

BIBLIOGRAFÍA 1.- Bourgeois C.M. Microbiología Alimentaria. Editorial Continental S.A.1995. 2.-Frazier ,W.C. Microbiología de los alimentos .Ed. Acribia . España 2000. 3.- Mossel.D.Microbiología de los alimentos. Ed. Acribia. España 2000. 4.-DIFCO Manual de medios de cultivo. Ed. Difco. 5.-MERCK. Manual de medios de cultivo Ed. Merck, Alemania. 6.-Ministerio de Salud DIGESA . Manual de Análisis Microbiológico de Alimentos. 7.-FAO-ONU- Manuales para el control de calidad de Alimentos para la agricultura y la Alimentación. Roma.

II.

ANEXOS

Tabla de NMP para expresar resultados. Dilució

Dilució

Dilució

NMP

n 10-1

n 10-2

n 10-3

por g.

0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

1 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 2 3 3 3

0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2

3 4 7 7 11 9 14 15 20 21 23 40 40 70 90 150 210 200 500 >1100

99%

1 1 1 1 2 1 3 3 0 5 4 10 10 20 20 30 50 <100 100 200

95%

23 28 35 36 44 80 82 85 77 80 177 230 290 370 520 660 820 1900 3300 6400

1 1 2 2 4 2 3 5 8 8 7 10 20 20 30 50 80 200 200 100

17 21 27 38 35 38 48 50 61 63 129 180 210 280 390 610 640 1400 2400 1800