Tinción Sudan 5r1r5a

Universidad Veracruzana Facultad de Química Farmacéutica Biológica Laboratorio de Hematología

Práctica No. 22. “TINCIÓN DE SUDÁN NEGRO B” 1. Fundamento La tinción de Sudán Negro B o simplemente tinción de Sudán, es un colorante que tiñe diversos lípidos celulares. Las células hematopoyéticas contienen finamente dispersos lípidos en el citoplasma así como complejos de lípidos o como lipoproteínas, que se encuentran en la membrana celular y en la membrana de mitocondria así como de otros organelos. Estos lípidos no son identificables en los frotis teñidos con Wright. Sin embargo, cuando los lípidos contenidos en células que se encuentran en la sangre o en la médula ósea son teñidos con la solución que contiene Sudan Negro B, este colorante lipofilico deja el solvente porque el colorante es más soluble en los lípidos que en el solvente, provocando así la tinción correspondiente. En la examinación microscópica, el pigmento concentrado produce un color negro para aquellas reacciones positivas. El Sudán Negro B es un colorante de la serie diazóica que tiñe diversos, lípidos, incluyendo grasas neutras, esteroles

y en particular fosfolípidos. Los

vapores de formaldehído (fijador) fijan las grasas y fosfolípidos, los que al ar con el colorante toman un color negro-azul que contrasta con el colorante de Wright en la contratinción. Los lípidos teñidos se encuentran en los gránulos primarios y secundarios de los neutrófilos, así como en los gránulos lisosomicos de los monocitos. 2. Resolución preguntas guía 1.- ¿Qué utilidad tiene esta reacción citoquímica? La tinción de Sudán Negro B es útil para diferenciar una leucemia mieloide aguda de una leucemia linfoide aguda. 2.- ¿De qué depende que las células sean positivas o negativas a esta reacción?

Cortazar Murillo Elvis M., Vázquez García Vania G., Zárate Hernández Carlos.

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Las células positivas se tiñen con esta prueba debido a que contienen granulos ya sean primarios o secundarios en el citoplasma, estos granulos constan de una membrana lípidica que es teñida por el colorante, las células leucocitarias que contienen granulos se denominan granulocitos; si las células no contienen estos granulos no se apreciaría la tinción en la región del citoplasma, por lo que la reacción sería negativa. 3.- ¿Cuáles de los blastos son positivos y cuales son negativos a esta reacción? Los blastos que son positivos son los que pertenecen a la línea mieloide (mieloblastos), que pueden ser mieloblastos de neutrófilos, eosinofilos o basófilos. También los blastos de los monocitos se tiñen ligeramente con el Sudan Negro B. Los linfoblastos son negativos para esta tinción, ya que no contienen granulos. 3. Material, reactivos y equipo Material:     

Material necesario para la extracción de sangre. Portaobjetos. Puente de tinción. Pipetas Pasteur con bulbo de hule. Cámara de fijación.

Reactivos:  

Formaldehído al 37 %. Solución de Sudán Negro B. Se disuelven 300 mg de Sudán Negro B en



100 ml de etanol al 96 %. Solución tamponada. Se mezclan 16 g de fenol con 30 ml de alcohol etílico absoluto y se añaden a una solución de 0.3 g de Na 2HPO4 . H2O en 100 ml



de agua destilada. Solución colorante. Mezclar 60 ml de solución Sudán Negro B con 40 ml de

 

solución tamponada. Filtrar. Etanol 70 %. Colorante de Wright.

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

Solución buffer de fosfatos para tinción de Wright.

Equipo: 

Microscopio.

4. Técnica 1.- Hacer un frotis sanguíneo en la forma acostumbrada. 2.- Fijar con vapores de formaldehído en la cámara de fijación durante 10 min. Lavar y secar al aire. 3.- Teñir durante 60 min. con la solución colorante. 4.- Lavar con etanol al 70 % durante 2 o 3 min. Lavar y secar al aire. 5.- Contrateñir con colorante de Wright. 6.- Observar con objetivo de inmersión, clasificando las células como Sudán Negro B positivas o negativas. Las células Sudán Negro B presentan una coloración negra en su citoplasma. 5. Observaciones La muestra utilizada fue donada por el Instituto Estatal de Cancerología, provino de un paciente diagnosticado con leucemia mieloide aguda. En el laboratorio cada equipo realizó una determinación de las reacciones citoquímicas debido a que no se contaba con mucha muestra. Durante la tinción con el colorante se homogenizó con una boquilla, con el fin de incorporar el colorante en todo el frotis sanguíneo. En la observación microscópica (100 X) del frotis sanguíneo se encontraron células que presentaban una coloración negra intensa en el citoplasma (figura ).

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Figura . Observación microscópica de frotis sanguíneo con tinción de Sudan Negro B contrateñido con Wright, objetivo 100 x. Se observan dos blastos positivos para la tinción de Sudán Negro B. Nótese la coloración negra del citoplasma. 6. Resultados Universidad Veracruzana Facultad de Química Farmacéutica Biológica Laboratorio de Hematología Paciente: Paciente con Leucemia Mieloblástica Aguda. Sexo: Sin definir. Edad: Sin definir. Localidad: Xalapa, Ver. Fecha de recepción de la muestra: 3 de Octubre de 2014. Realización del examen: 3 de Octubre de 2014. Prueba

Resultado Blastos Leucocitarios

Valor de referencia Sin presencia de blastos.

Tinción de Sudán Negro

Tinción de Sudán Negro

Tinción de Sudán Negro

B.

B Positivos.

B Positivo: Granulocitos,

monocitos. Realizó: Elvis Marian Cortazar Murillo, Vania Gabriela Vázquez García, Carlos Zárate Hernández. Responsable: M.A.C. Elea Vallejo Solá.

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7. Conclusiones 7.1. Elvis Marian Cortazar Murillo Para diferenciar las leucemias linfoides agudas de las mieloides es de gran utilidad la tinción de Sudán Negro B, cuya característica es teñir de negro al citoplasma y hacer más efectiva la diferenciación. La muestra era de un paciente con leucemia mieloblástica por lo que se encontraron blastos en ella, se pudo observar bien la morfología del blasto apreciando los gránulos de éste, descartando que sea una leucemia linfoblástica pues ésta carece de gránulos. 7.2. Vania Gabriela Vázquez García A la muestra de sangre del paciente se le realizó la tinción de Sudán Negro B puesto que como tiene leucemia mieloblástica aguda se espera encontrar blastos leucocitarios siendo un éxito este hallazgo. Esta prueba es importante para poder diferenciar qué tipo de células están siendo afectadas en una, si bien este hallazgo fue fácil porque se conocía de la patología de la persona sería necesario educar más al ojo para poder diferenciar perfectamente ambas. 7.3. Carlos Zárate Hernández La tinción de Sudán Negro B realizada fue positiva para blastos de tipo mieloide debido a que el paciente tiene leucemia mieloblástica aguda, en este caso supimos que se trataba de este tipo de blasto debido al conocimiento de la muestra, sin embargo en la práctica profesional se debe tener un gran conocimiento para diferenciar distintas células. Las reacciones citoquímicas son muy importantes ya que permiten identificar algún trastorno que involucre una determinada línea celular. 8. Bibliografía -

Kawthalkar M. Shirish. 2012. Essentials of Hematology. 2nd. edition. JAYPEE. USA.

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Argentina. Turgeon Mary Louise. 2005. Clinical Hematology: Theory and Procedures. 4th. edition. Lippincott Williams & Wilkins. USA.

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