Informe4-glicosidoscardiotonicos 4n5r6o

Universidad Nacional De Colombia Facultad De Ciencias EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE GLICÓSIDOS CARDIOTÓNICOS OBJETIVOS

1. Detectar y analizar la presencia de glicósidos cardiotónicos en hojas de Digitalis sp y Solanum mammosum . 2. Aprender a evaluar reacciones de identificación de glicósidos cardiotónicos. 3. Comparar resultados de las diferentes clases de reacciones de detección de glicósidos cardiotónicos de una muestra de Digitalis sp vs muestra problema solanum mammosum. 4. Determinar por medio de cromatografía de capa delgada la presencia de glicósidos antracénicos en un extracto de Digitalis sp Vs Solanum mammosum. MARCO TEÓRICO

Algunos compuestos esteroidales ejercen un efecto poderoso sobre el músculo cardiaco y son conocidos con el nombre de heterósidos o glicósidos cardiotónicos, muchas de estas sustancias han sido aisladas de especies vegetales, muchas otras se encuentran en secreciones de algunos sapos o bufos. Los glicósidos cardiotónicos son sustancias constituidas de una porción esteroide, una porción glicosídica y un anillo de gama-lactona, alfa ,ß- insaturada o delta-lactona-alfa, ß-insaturada. Los usos medicinales de algunas de las plantas que contienen estos compuestos ya eran conocidos por los egipcios desde el año 1500 a.c., los romanos usaban Escillamaritima como diurético, tónico cardiaco, emético y veneno para ratas. En la actualidad la fuente natural de glicósidos cardíacos está constituida por Digitalis purpurea que ejerce una acción sobre el músculo cardiaco (miocardio) de un corazón enfermo y Digitalis lanata que se absorben a nivel intestinal más rápido que los glicósidos cardíacos de D. purpúrea. Los glicósidos cardiotónicos contienen en su molécula uno o más desoxiazúcares solos o con monosacáridos normales unidos siempre al C3 por sustitución del grupo hidroxilo.Por hidrólisis enzimática o ácida se generan los azúcares libres, una aglicona o genina esteroidal que puede ser del tipo cardenólido o bufadienólido.Los cardenólidos son esteroides de 23 átomos de C y poseen una lactona de 5 y insaturada en C17 y un grupo OH en C14. Los bufadienólidos son esteroides de 24 átomos de C y poseen una lactona de 6 con doble insaturación, insaturada en C17 y un grupo OH en C14 [1].

Aglicona de Cardenólido

Aglicona de Bufadienólido

Los glicósidos cardiotónicos pueden ser detectados por pruebas sencillas como la prueba de Lieberman-Buchard para compuestos esteroidales, reacción de Keller-Killiani para detectar lactonas, pruebas para desoxiazúcares y CCD empleando reveladores específicos. Digitalis purpurea es una especie de planta herbácea bienal de la familia de las scrophulariaceas. El órgano de la planta utilizado por sus virtudes medicinales son las hojas, La cantidad de principios activos que contienen las hojas varía mucho durante todo el día. durante la tarde se acumula la máxima cantidad, luego empieza a decrecer, porque la propia planta destruye los principios activos formados. Al amanecer, las hojas carecen total o casi totalmente de ellos. Como principales componentes están en las hojas los glicósidos A y B y la gitalina, además de una saponina, la digitonina. Por la glucólisis enzimática de los glicósidos A y B se forman la digitoxina y gitoxina. La digitoxina es el más poderoso componente y sumamente venenoso.Estos tres glicósidos por hidrólisis en medio ácido forman igual hidrato de carbono pero distintas agliconas: digitoxigenina, gitoxigenina y gitaligenina [2]. Solanum mammosum es una planta anual perenne de la familia Solanaceae y un pariente cercano del tomate, es una especie poco común que se encuentra cerca de viviendas y en sitios muy alterados, zonas norcentral y atlántica. Arbusto de hasta 1,20 cm de alto, herbáceo o semileñoso de tallo espinoso. Entre sus Componentes químicos encontramos Catequinas, taninos catequínicos, alcaloides, fenoles simples, flavanonas, heterósidos cianogénicos, saponinas y triterpenos.La fruta tiene diversos usos, tanto ornamentales como medicinales. Es reputado su uso medicinal en el tratamiento del pie de atleta y la sinusitis. También es usada como relajante, para tratar la irritabilidad y como detergente. Los principios activos glicoalcaloides esteroideos (solasodina) se utilizan en la síntesis de esteroides de utilidad como pesticidas naturales (acción potenciada también por los taninos presentes y los alcaloides) [3]. METODOLOGÍA

Pruebas de detección

Reacción de Lieberman-Burchard

Reacción de Kedde o Raymond

Ensayo para la Digitoxosa o Prueba de Xantidrol

Prueba de Keller-Killiani RESULTADOS

Fig.1. Montaje de la extracción de izquierda a derecha: Extracto de hojas de Digitalis sp y extracto de la muestra problema Solanum mammosum con éter de petróleo. a)Fase orgánica b)Fase acuosa.

Fig.2. Montaje correspondiente a la segunda extracción realizada, de izquierda a derecha: Extracto de hojas de Digitalis sp y extracto de la muestra problema Solanum mammosum (utilizando Cloroformo:Metanol (90:10). a)Fase acuosa b)Fase orgánica.

Fig. 3. Resultados obtenidos de las pruebas realizadas al extracto de Digitalis sp, de izquierda a derecha: a) Muestra blanco, b) Reacción de Lieberman-Burchard, c) Reacción de Kedde o Raymond, d)Ensayo para digitoxosa o prueba de xantidrol y e) Prueba de Keller-Killiani (desoxiazúcares).

Fig. 4. Resultados obtenidos de las pruebas realizadas al extracto de la muestra problema Solanum mammosum, de izquierda a derecha: a) Muestra blanco, b) Reacción de Lieberman-Burchard, c) Reacción de Kedde o Raymond, d)Ensayo para digitoxosa o prueba de xantidrol y e) Prueba de Keller-Killiani (desoxiazúcares).

Fig. 5. Resultados obtenidos en la prueba de cromatografía en capa delgada. De izquierda a derecha, placa revelada con Vainillina en horno de calentamiento y placa revelada con reactivo de Kedde, para A:Solanum mammosum, B: Digitalis sp. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Ya que, por regla general los heterósidos (glicósidos) son solubles en agua, en la primera parte de la práctica, se adicionaron 50 mL de agua a cada una de las muestras, esto con el fin de lograr que se solubilizen en su totalidad generando la homogeneidad de las mismas permitiendo realizar posteriormente una correcta extracción de los compuestos de interés. Después, se realizó la extracción del material vegetal con Éter de petróleo, siendo este el mejor agente para la extracción directa de la grasa en cada una de las muestras por su carácter apolar, el éter de petróleo en el disolvente disminuye la solubilidad de las sustancias no grasas, de esta manera logra extraer la mayoría de sustancias grasas, es por esta razón que en este paso nos interesa la recolección es de la fase acuosa mas no de la orgánica, porque se supone que en esta última se encuentran los compuestos grasos que no son de nuestro interés; esta fase orgánica podría contener esteroles, alcoholes de alto peso molecular, ceras, glicéridos o terpenos en cambio, la fase acuosa podría llegar a contener taninos, alcaloides y glucósidos que son objetivo de estudio en la práctica. Por esta razón se desecha la fase orgánica y se sigue trabajando con la fase acuosa. Inmediatamente, obtenida la fase acuosa se le agregan 50 ml de Acetato de Plomo con el fin de generar la precipitación de las clorofilas presentes en cada una de las muestras obteniendo una solución acuosa libre de clorofilas. La elección de un disolvente de extracción en general, depende de la solubilidad, volatilidad y toxicidad del compuesto a extraer en este caso los glucósidos cardiotónicos, son apolares es decir solubles en solventes orgánicos, en este punto se ha tomado como disolvente de extracción el Cloroformo:metanol (9:1) con el fin de lograr extraer los componentes de interés en este caso la mayoría de glucósidos presentes en las muestras; en esta parte finalmente se trabaja con la fase orgánica, ya que esta contiene los glucósidos, lactonas y azúcares, la indicada para llevar a cabo todas y cada una de las pruebas de detección de glicósidos; por su parte la fase acuosa se desecha y se sigue trabajando con la orgánica. Esta última fase se lleva a concentración, logrando obtener aproximadamente 5 ml correspondientes para el desarrollo de las pruebas de detección de glucósidos. Así, se repartieron para la reacción de Lieberman-Burchard, la de Kedde, prueba de xantidrol y prueba de Keller-Killiani (1 ml de muestra para cada prueba) y 1 ml para CCD. Luego, se llevaron a sequedad los cuatro tubos con la muestra para llevar a cabo las pruebas de detección y se deja 1 ml restante para realizar CCD. Por una parte, Digitalis sp contiene heterósidos cardiotónicos (0,30%) derivados de la digitoxigenina (digitoxina y otros), y de la gitoxigenina y gitaloxigenina (gitoxina, etc.) flavonoides, saponósidos [4]. Después de realizar las pruebas, logramos obtener los resultados (Fig. 3), la cual nos indica y según lo reportado en la literatura; que para la

reacción de Lieberman-Burchard, un color rojo-naranja pardo indica la presencia de núcleo triterpénico y un color azul-verde que cambia con el tiempo indica presencia de núcleo esteroide con lo que podemos deducir que Digitalis sp presenta esta última situación (Fig.3b). Para la Reacción de Kedde o Raymond los glucósidos y agliconas dan color azul o rojo-violeta indicando que la prueba es positiva, lo que podemos observar es que para Digitalis sp obtenemos un resultado positivo, es decir que presenta lactonas en su composición, ya que el color resultante es un rojo-violeta (Fig. 3c). Para la tercera prueba indicada como prueba de xantidrol, que nos da a conocer los desoxiazúcares presentes en el extracto vegetal tenemos que para el caso de Digitalis sp es positivo pues la prueba toma una coloración roja muy intensa (Fig. 3d). Finalmente para la prueba de Keller-Killiani buscamos principalmente comprobar la presencia de desoxiazúcares en la detección general de heterósidos esteroides que indica que los glicósidos presentes en la muestra pueden presentar coloración roja o verde dependiendo el tipo de planta, para este caso logramos deducir que Digitalis sp da positivo para dicha prueba, ya que, da una coloración verde (Fig. 3d) que se desarrolla en la superficie de los dos reactivos esparciéndose gradualmente a la capa superior del ácido acético reconociendo generalmente la posible presencia de D-glucosa, L-Rhamnosa y desoxiazúcares como componentes ligados en la planta [5]. Para Solanum mammosum logramos encontrar en la literatura información sobre sus componentes y/o principios activos, entre los cuales se encuentran los heterósidos cianogénicos, los cuales son un tipo de glicósidos pero no precisamente cardiotónicos y según las pruebas realizadas se determina que no contiene glicósidos cardiotónicos de tipo esteroidal debido a que en la primera reacción de Lieberman- Burchard, por ejemplo no se observa un cambio con respecto a la muestra blanco (Fig. 4a-4b). La reacción de Kedde nos mostró para esta planta un leve cambio en su coloración, pues el color observado es rojo-anaranjado leve indicando posiblemente la presencia de lactonas (Fig. 4c), sin embargo según la literatura Solanum mammosum no contiene este tipo de compuestos, lo que permite analizar que hay podido ocurrir un error durante el desarrollo de esta prueba o que se haya contaminado dicha prueba. Para la tercera prueba de xantidrol nos da un resultado negativo, ya que no se observa un cambio de color significante con respecto a la muestra blanco (Fig.4a.4d). En la última prueba realizada correspondiente a Keller-Killiani también se obtuvo un resultado negativo, ya que se observa una coloración naranja intensa pero en realidad se le llega a atribuir posiblemente a las trazas de cloruro férrico que son de color anaranjado mas no por la presencia de algún tipo de glicósido cardiotónico (Fig. 4e). Lo que permite concluir finalmente que en general Solanum mammosum no contiene glicósidos cardiotónicos. Para la cromatografía en capa delgada, en realidad en la experimentación no se pudo realizar de una manera adecuada la comparación entre las dos placas con los diferentes reveladores; vainillina y el reactivo de Kedde, pero al no tener algún resultado positivo con las pruebas de identificación anteriormente descritas, se concluye que Solanum mammosum no contiene glicósidos cardiotónicos. Al utilizar los reveladores; reactivo de Kedde y vainillina deben dar manchas rosadas y violetas en ambas placas para confirmar que efectivamente se trata de glicósidos cardiotónicos. Según la literatura Digitalis lanata contiene los glicósidos lanatósido C, que posee la aglicona digoxigenina, unida a dos moléculas de digitoxosa, una molécula de acetildigitoxosa y una molécula de glucosa, también contiene el lanatósido A que posee una estructura similar, con la diferencia de la aglicosa, digitoxigenina. Digitalis purpurea el glicósido es el purpureoglicósido A, cuya estructura es idéntica al lanatósido C, salvo por la ausencia del grupo acetilo [6]. CONCLUSIONES

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Para la muestra de Solanum mammosum se logró determinar que dicha planta no presenta presencia de glicósidos cardiotónicos.

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Se logro determinar la presencia de glicósidos cardiotónicos en la muestra de Digitalis sp reconociéndose de esta manera que es una de las plantas representativas en relación con el estudio de dicho grupo de compuestos. Las reacciones que presentan cambio de color significativo pretende demostrar la presencia de los glicósidos cardiotónicos de tipo azúcares y geninas. La cromatografía en capa delgada es una buena técnica, que nos permite corroborar la presencia de glicósidos cardiotónicos (específicamente uno como por ejemplo Digitoxina ó Digoxina) en una determinada muestra, con una mayor precisión, no obstante se hacen necesarias pruebas de identificación preliminares a este proceso. En CCD se denota la presencia de heterósidos cardiotónicos con manchas de color violetarojizo e incluso amarillos en la placa de sílica gel para el caso de la muestra de Digitalis sp. REFERENCIAS

1. Marin Juan Camilo. Práctica 3: Extracción de Glicósidos Cardiotónicos. Guías de laboratorio, Farmacognosia y Fitoquímica , Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias , Departamento de farmacia, Sede Bogotá, Pp 9-11. 2. Herbotecnia,2004. [28 Octubre 2016]. Disponible en: http://www.herbotecnia.com.ar/exodigital.html 3.Pinedo M.; Rengifo E.; Cerruti T. 1997. Plantas Medicinales de la Amazonia Peruana. Estudio de su uso y cultivo. AECI. IIAP.GRL. 304 p. Iquitos-Perú 4. Digitalis purpurea Plantas útiles: Linneo. Archivado desde el original el 24 de noviembre de 2015. Consultado el 29 de Abril de 2016. 5. Trabajo práctico N° 5 Glicósidos. Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco. recopilado de la web el día 28/06/2016 en: fcn.unp.edu.ar/sitio/farmacognosia/wp-content/s/2009/04/tp5_glicosidos_2009.pdf. 6. Sharapin. N, Fundamentos de tecnología de productos fitoterapéuticos, (2000), área de Ciencia y Tecnología del Convenio Andrés Bello & Red Iberoamericana de Productos Fitofarmacéuticos (RIPROFITO).