Lowry Assay 6v611z

E STIMATION  O F  P ROTEIN  C ONCENTRATION  I N  E GG  A LBUMIN  B Y  L OWRY  M ETHOD      

I NTRODUCTION   The  “Lowry  Assay:  Protein  by  Folin  Reaction”  (Lowry  et  al.,  1951)  has  been  the  most  widely  used method to estimate the amount of protein (already in solution or easily‐soluble in dilute  alkali) in biological samples. First the proteins are pretreated with copper ion in alkali solution,  and  then  the  aromatic  amino  acids  in  the  treated  sample  reduce  the  phosphomolybdatephosphotungstic acid present in the Folin Reagent. The end product of this  reaction has a blue color. The amount of protein in the sample can be estimated via reading the  absorbance  (at 750 nm) of the end product of the folin reaction against a standard curve of a  selected protein solution ( in our case; Bovine Serum Albumin(BSA) solution).    The Lowry method relies on two different reactions.   1. The first reaction is the formation of a copper ion complex with amide bonds, forming  reduced  copper  in  alkaline  solutions.  This  is  called  a  Biuret  chromophore  and  is  commonly stabilized by the addition of tartrate (Gornall et al., 1949).   2. The second reaction is reduction of the Folin‐Ciocalteu reagent (phosphomolybdate and  phosphotungstate), primarily by the reduced copper‐amide bond complex as well as by  tyrosine and tryptophan residues.    The  Biuret  reaction  itself  is  not  very  sensitive.  Using  the  Folin‐Ciocalteu  reagent  to  detect  reduced  copper  makes  the  Lowry  assay  nearly  100  times  more  sensitive  than  the  Biuret  reaction alone. Several useful modifications of the original Lowry assay have been developed to  increase the dynamic range of the assay over a wider protein concentration (Hartree, 1972), to  make  the  assay  less  sensitive  to  interference  by  detergents  (Dulley  and  Grieve,  1975),  and  to  first  precipitate  the  proteins  to  remove  interfering  contaminants  (Bensadoun  and  Weinstein,  1976).    The  Lowry  assay  is  relatively  sensitive,  but  requires  more  time  than  other  assays  and  is  susceptible to many interfering compounds. The following substances are  known  to  interfere  with  the  Lowry  assay:  detergents,  carbohydrates,  glycerol,  Tricine,  EDTA,  Tris,  potassium  compounds,  sulfhydryl  compounds,  disulfide  compounds,  most  phenols,  uric  acid,  guanine,  xanthine,magnesium,  and  calcium.  Many  of  these  interfering  substances  are  commonly  used  in  buffers  for  preparing  proteins  or  in  cell  extracts.  This  is  one  of  the  major  limitations of the assay. The Lowry assay is also sensitive to variations in the content of tyrosine  and tryptophan residues, a trait shared with the ultraviolet assay at 280 nm). The assay is linear  over the range of 1 to 100 μg protein. The absorbance can be read in the region of 500 to 750  nm,  with  660  nm  being  the  most  commonly  employed.  Other  wavelengths  can  also  be  used,  however,  and  may  reduce  the  effects  of  contamination  (e.g.,  chlorophyll  in  plant  samples 

interferes  at  660  nm,  but  not  at  750  nm).  Also,  if  the  A660  values  are  low,  sensitivity  can  be  increased by rereading the samples at 750 nm.   

M ATERIALS  &   C HEMICALS   1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Clean Glasswares  Centrifuge Tubes(10 ml)  semi‐micro cuvettes  Spectrophotometer (750 nm)  Bovine Serum Albumin (BSA)  Folin and Ciocalteu’s Phenol Reagent (2N)  Sodium tartrant : Na2Tartrant.2(H2O)  Copper sulphate : CuSO4.5(H2O)  Other chemicals : NaOH, Na2CO3 

 

P REPARING THE  S OLUTION   •

•

The Lowry Solution is a mixture of the above chemicals, except the Folin Reagent. The  Lowry  solution  should  be  prepared  fresh,  at  the  day  of  measurement.  Though  the  individual solutions for the Lowry solution can be prepared in advance and then mixed  at the day of measurement.  Solution A is a dilute alkali solution. 2N Folin and Ciocalteu’s Phenol Reagent contain HCl  and H2PO4. 

  Solution A: (alkaline Solution) (for 100 ml)  0.572gm NaOH  2.862gm Na2CO3    Solution B: (for 20 ml)  0.285gm CuSO4.5(H2O)    Solution C: (for 20 ml)  0.571gm Na2Tartrant.2(H2O)    Lowry Solution: (freshly prepared, 0.7/ml sample)  Sol. A + Sol. B +Sol. C with a ratio (vol:vol) of 100:1:1    Folin Reagent (instant fresh, 0.1 ml/sample)  5ml of 2N Folin and Ciocalteu’s Phenol Reagent + 6ml of double distilled water  ‐ this solution is light sensitive. So it should be prepared at least 5min of the first  sample incubation and kept in an amber container.   

2   

BSA Standard Protein Solution (fresh)  Although  BSA  is  a  water  soluble  protein,  it  takes  time  to  dissolve  it  completely.  So,  prepare  this  stock  solution  and  keep  it  mixed  i.e.,  for  1  hour  before  starting  the  experiment.  ‐ weigh 0.05 gm of BSA and add to a 500 ml volumetric flask containing ddl water.  ‐ Stir  well  to  dissolve  and  adjust  the  volume  to  500  ml  with  ddl  water.  Final  concentration of the stock solution is 100 mg BSA/L.  ‐ Prepare the dilution in 15 ml tubes, following the recipe given below    Vol.  ddl water  Vol. of stock BSA solution  Final Concentration  Diluted Sample no.  10 ml 

0 ml 

0 mg/ml 

dil. Std 1 

8 ml 

2 ml 

20 mg/ml 

dil. Std 2 

6 ml 

4 ml 

40 mg/ml 

dil. Std 3 

4 ml 

6 ml 

60 mg/ml 

dil. Std 4 

2 ml 

8 ml 

80 mg/ml 

dil. Std 5 

0 ml 

10 ml 

100 mg/ml 

dil. Std 6 

   

P ROTOCOL   1. The stock BSA solution was prepared and diluted for the standard curve.  2. The Lowry Solution was prepared by mixing Sol. A + Sol. B +Sol. C with a ratio (vol:vol) of  100:1:1  3. the samples were vortexed and diluted with ddl water  4. 0.5 ml of the diluted sample (or standard) was transferred to 10 ml centrifuge tube   5. 0.7 ml of Lowry Solution was added to the same centrifuge tube  6. The centrifuge tubes were capped and vortexed well to mix  7. The tubes were incubated for 20 min at room temp. in dark.  8. At the last 5 min of the incubation, Folin Reagent was prepared  9. After  the  20  min  incubation,  the  samples  were  taken  out  and  0.1  ml  of  diluted  Folin  Reagent was added to each tube  10. The tubes were capped and vortexed immediately  11. The tubes were incubated for 30 min at room temp. in dark  12. While waiting, the UV‐VIS spectrophotometer was warmed up and stabilized  13. After the 30 min incubation, the tubes were vortexed briefly  14. Then the  1.3 ml of samples  were transferred to semi‐micro disposable cuvettes  15. Absorbance reading were taken at 750 nm  16. The calibration curve form the absorbance readings of the standards were prepared and  the protein concentration in the samples in mg BSA/lit was calculated form the curve.   

3   

P ROTOCOL  S UMMARY   For Standard BSA solution:  Std. Sample no. 

Vol. of std  transferred to tubes 

Vol. of Lowry  Solution added 

Vol. of FC reagent  added 

To cuvettes 

dil. Std 1 

0.5 ml 

0.7 ml

0.1 ml

1.3 ml + distill. water

dil. Std 2 

0.5 ml 

0.7 ml

0.1 ml

1.3 ml + distill. water

dil. Std 3 

0.5 ml 

0.7 ml

0.1 ml

1.3 ml + distill. water

dil. Std 4 

0.5 ml 

0.7 ml

0.1 ml

1.3 ml + distill. water

dil. Std 5 

0.5 ml 

0.7 ml

0.1 ml

1.3 ml + distill. water

dil. Std 6 

0.5 ml 

0.7 ml

0.1 ml

1.3 ml + distill. water

  For Egg albumin (Unknown) solution:  Dilution of Egg albumin is done similar to the dilution of BSA    Unknown  Vol. of std  Vol. of Lowry  Solution added 

Vol. of FC reagent  added 

To cuvettes 

 Sample no. 

transferred to tubes 

dil. sample 1 

0.5 ml 

0.7 ml

0.1 ml

1.3 ml + distill. water

dil. sample 2 

0.5 ml 

0.7 ml

0.1 ml

1.3 ml + distill. water

dil. sample 3 

0.5 ml 

0.7 ml

0.1 ml

1.3 ml + distill. water

dil. sample 4 

0.5 ml 

0.7 ml

0.1 ml

1.3 ml + distill. water

dil. sample 5 

0.5 ml 

0.7 ml

0.1 ml

1.3 ml + distill. water

dil. sample 6 

0.5 ml 

0.7 ml

0.1 ml

1.3 ml + distill. water

  R EFERENCE   Protein (Lowry) Protocol, Protein Protocol, Ebru Dulekgurgen UIUC’04, (Author Unknown)

4