Microbiologia 1 151c6s

1. Elabore una tabla para las siguientes pruebas de ensayo: Nombre

pH inicial

Estado físico, color al preparar el medio

Líquido, ámbar claro, transparente sin precipitado.

Siembra y cantidad del inóculo

Inoculación directa por difusión, a partir del cultivo en estudio.

Utilidad

Reacciones de rojo de metilo y acetil-metil-carbinol (Voges-Proskauer) del grupo Enterobacter.

T y t de incubación

Constituyentes (g/L)

→Mezcla de peptonas (7)

RM: Agregar 5 gotas de RM al 0.04% en 5 mL y observar el color del medio.

Interpretación

RM: + →: Rojo. − →: Amarillo.

VP: Agregar a 5 mL del VP: + →: Rojo-rosado. medio una pizca de Inóculo liviano. →Fosfato de potasio creatinina más 5 mL − →: Ausencia de color (5) de KOH al 40%. La rojo. lectura final se hace hasta 4 horas más tarde. SE VALORA LA FERMENTACION ACIDO MIXTA (RM) Y LA FERMENTACION BUTILENGLICOLICA (VP), LA PRIMERA CON LA FORMACION DE ACIDOS ORGANICOS ( LACTICO, ACETICO Y FORMICO) QUE REDUCEN CONSIDERABLEMENTE EL pH DEL MEDIO , POR DEBAJO DE 4.4, Y EN LA SEGUNDA , LA MAYOR PARTE DEL PIRUVATO SE CONDENSA FORMANDO ACETILMETI CARBINOL, QUE ES REDUCIDO A 2,3-BUTILENGLICOL, PRODUCTOS QUE SON NEUTROS Inoculación directa Extracto de carne 3g por difusión, a partir Caldo con Liquido color 35°C durante Peptona 5,0 g 7 del cultivo en estudio. 1-2 min nitrato blanco 12-24 hrs. Nitrato de potasio g Agua desionizada 1L Inóculo denso Móviles: presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra. Caldo RMVP

6.9±0.2

35-37°C por 48-72 hrs.

Tiempo máximo de lectura

→Glucosa (5)

→Peptona de caseína (20)

SIM

7.3±0.2

Semisólido, ámbar.

Sembrar por picadura ¾ de la longitud del tubo.

Diferenciación e identificación de Enterobacterias y detecta la producción de sulfuros, indol y movilidad de las mismas.

→Peptona de carne (6.1) 35°C durante 24-48 hrs.

→FeSO4 y (NH4)2SO4 (0.2) →Tiosulfato de sodio (0.2) →Agar (3.5)

Inmóviles: crecimiento en la línea de siembra. 24 hrs luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich (antes adicionar 1 mL de cloroformo).

SH2 (+): ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio. SH2 (−): el medio permanece sin cambio de color. Indol (+): color rojo Indol (−): sin cambio de color.

→Extracto de levadura (3) →Peptona de gelatina (10)

MIO

6.5±0.2

Semisólido, púrpura transparente a ligeramente opalescente.

A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por punción profunda con ansa recta.

Identificación de Enterobacterias en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol.

35-37 °C durante 2448 hrs.

→Peptona de caseína (10) →L-Ornitidina (5) →Dextrosa (1) →Agar (2)

___ hrs. Agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich (antes adicionar 1 mL de cloroformo). La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina.

→Púrpura de bromocresol (0.02)

Fenilalanina desaminasa

7.3±0.2

Sólido en pico de flauta, amarillo ámbar.

A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar un inóculo denso estriando la superficie del medio.

Para diferenciar Morganella morganii biogrupo 1 y 2, Proteus spp. y Providencia spp., de la mayoría de otros de la familia Enterobacteriaceae, en base a la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa.

→Extracto de levadura (3) 35-37 °C durante 18 a 24 hrs.

→DL-Fenilalanina (2) →Fosfato disódico (1) →NaCl (5) →Agar (12) →Extracto de carne (3)

Agar almidón

7.5±0.2

Sólido

Inocular por estría cerrada.

Para revelar, agregar 4-5 gotas de FeCl3 y efectuar la observación dentro de los primeros 5 minutos

35-37°C durante 2448 horas.

Para detectar la hidrólisis de almidón

→Almidón soluble (10) →Agar (12)

48 horas después de incubar, se cubre la placa con solución de lugol y se lee.

Movilidad: - (+): presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra. - (−): crecimiento solamente en la línea de siembra. Ornitina decarboxilasa: - (+): color púrpura. - (−): color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio. Prueba del indol: - (+): color rojo al agregar el reactivo revelador. - (−): el color del reactivo revelador permanece incoloroamarillento. - (+): desarrollo de color verde pálido a intenso en el pico de flauta y en el líquido de condensación. - (−): sin cambios de color. El medio permanece amarillo debido al color del reactivo cloruro férrico. - (+): decoloración alrededor del desarrollo (hidrólisis). - (-): color parduzco (no hidrólisis).

2. Elabore una tabla para las siguientes pruebas bioquímicas o medios de ensayo: Nombre

pH inicial

Estado físico, color al preparar el medio

Siembra y cantidad del inóculo

Utilidad

T y t de incubación

Indicador de pH

Interpretación del viraje

Caldo rojo de fenol + carbohidratos

Urea de Christensen

Gelatina nutritiva

Hugh Leifson (O/F)

TSI

7.4±0.2

6.8±0.2

6.8±0.2

7.1±0.1

7.3±0.2

Líquido, color rojo

Sólido en pico de flauta, color amarillo rosado ligero.

Semisólido

Semisólido, color verde

Sólido en pico de flauta, color rojo

Por difusión de inóculo denso

Para estudios de fermentación de carbohidratos por bacterias.

35°C durante 18-24 horas

No punzar el fondo; sirve como indicador. Inóculo denso.

Para la diferenciación de microorganismos, bacilos entéricos, basándose en la capacidad de hidrolizar la urea.

35°C durante 24 hrs y todos los días sucesivos durante 6 días.

Por punción, inóculo denso.

Para detectar bacterias proteolíticas y para el recuento de gérmenes del agua.

35°C durante 24-48 horas.

Por punción, inóculo denso.

→ Determinar el metabolismo oxidativofermentativo de las bacterias Gram negativas, al ser suplementado con hidratos de carbono. →Diferenciar especies bacterianas. →Determinar movilidad y producción de gas.

35°C durante 48 hrs. Puede necesitar 3-4 o hasta 14 días de incubación.

Por punción y estría

Para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de

Rojo de fenol

Rojo de fenol

Gelatina

Azul de bromotimol

Amarillo: fermentación. Rojo: no hay fermentación. Púrpura intenso o rojo azulado: Organismos capaces de atacar urea. Positivo: Licuefacción del medio al colocar los tubos en refrigeración 30 min. NOTA: Si el resultado es negativo, incubar 72 hrs y repetir el procedimiento. Oxidación: Tubo abierto: amarillo (+) (ácido). Tubo cerrado: verde () Fermentación: Tubo abierto: amarillo (+) (ácido con gas) Tubo cerrado: amarillo (+) (ácido/ácido con gas) Sin oxidación o fermentación: Tubo abierto y cerrado: verde/verdeazul (-)

35°C durante 18-24 horas

Rojo de fenol

A=ácido K=alcalino Pico K/fondo A (pico rojo/fondo amarillo):

glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.

sólo fermenta glucosa. Pico A / fondo A (pico amarillo/fondo amarillo): fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. Pico K / fondo K (pico rojo/fondo rojo): no fermentador de azúcares. La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo: producción de gas.

Citrato de Simmons

LIA

6.9±0.2

6.7±0.2

Sólido en pico de flauta, color verde

Sólido en pico de flauta, color violeta

Sembrar en superficie un inóculo ligero, usando una ansa sin arrastrar el agar.

Para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.

Por punción y estría, inóculo poco denso.

Para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de H2S.

Ennegrecimiento del medio: producción de H2S → (+): crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. 35°C durante 24-48 horas.

35°C durante 18-24 horas.

Azul de bromotimol

Púrpura de bromocresol

→ (-): el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color. Decarboxilación de la lisina: → (+): Pico violeta/fondo violeta. → (-): Pico violeta/fondo amarillo. Desaminación de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género

Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. Producción de H2S: →(+):Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo)

3. ¿Por qué el medio TSI no debe leerse antes de 18 horas ni después de 24 horas de incubación? Porque habrá oxidación aerobia de los productos de fermentación de la lactosa, de la sacarosa o de ambas y el medio en la parte del agar inclinado terminará por revertir al estado alcalino. Antes de las 18 horas no se lee porque el pico de flauta sería acido, dado que en tan breve tiempo la glucosa aún no se ha degradado completamente y daría un falso positivo. Por otro lado, no se lee después de las 24hrs porque tanto el pico de flauta como el fondo del medio aparecerían alcalinos (color rojo), lo que indica que la bacteria ha terminado de degradar todos los azúcares y por consiguiente comienza a degradar las peptonas, dando al medio un pH alcalino., lo cual daría un resultado falso. 4. ¿Cómo se interpretan los resultados obtenidos a partir del medio TSI? 

Pico K/fondo A (pico rojo/fondo amarillo): sólo fermenta glucosa.



Pico A / fondo A (pico amarillo/fondo amarillo): fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.



Pico K / fondo K (pico rojo/fondo rojo): no fermentador de azúcares.



La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo: producción de gas.



Ennegrecimiento del medio: producción de H2S

A= ácido; K= alcalino 5. ¿Cómo se observa la desaminación de la lisina en el medio LIA?

1. La L-lisina es desaminada por la enzima lisina deshidrolasa dando como productos un acido orgánico y amoniaco. Al ser detectados estos productos por el indicador púrpura de bromocresol, el medio vira de color púrpura a color rojo-anaranjado en la superficie y amarillo en el fondo. Considerando esta prueba como positiva y reportándola como desaminación de la lisina. Se observa el pico rojizo y el fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 6. ¿Por qué es importante leer la prueba de rojo de metilo a las 48 horas de incubación? Porque los productos finales alcanzan niveles detectables con el tiempo. Si los resultados son dudosos a las 48 horas, habrá que repetir las pruebas con los cultivos incubados a 35-37°C durante 4 a 5 días en aerobiosis; en esos casos deben incubarse duplicados de las pruebas a 25°C. 7. ¿Cómo se interpreta la prueba Oxidación-Fermentación? ¿Cómo se reportan los posibles resultados obtenidos a partir del medio O/F de Hugh-Leifson? 

Microorganismos oxidativos del hidrato de carbono en estudio: producen una reacción ácida solo en el tubo “abierto”. Presentan poco o nulo desarrollo y ausencia de producción de ácido en el tubo “cerrado”.



Microorganismos fermentadores del hidrato de carbono en estudio: producen una reacción ácida en ambos tipos de tubos.



Microorganismos que no utilizan el hidrato de carbono en estudio: no producen cambios ninguno de los 2 tubos, los cuales permanecen verdes.



Se debe informar: producción de ácido (A), ácido con gas (AG), alcalino (K) o sin cambio (-).



También, puede informarse si el organismo es móvil, cuando crece lejos de la línea de inoculación.



Las reacciones típicas son las siguientes:

9. Si el medio SIM se encuentra totalmente ennegrecido a causa de la producción de H2S ¿Cómo interpretaría la prueba de motilidad?    

M (+) / SH2 (-): enturbiamiento del medio. M (+) / SH2 (+): ennegrecimiento de todo el medio. M (-) / SH2 (-): crecimiento solamente en la estría. M (-) / SH2 (+): precipitado negro alrededor de la estría (pero no ennegrecimiento de todo el medio).

10. ¿Qué importancia tiene la identificación de las bacterias? Cuando se han aislado las bacterias causantes de un proceso infeccioso, éstas deben ser identificadas hasta llegar a GENERO Y ESPECIE, para lograrlo se debe evaluar su actividad bioquímica o metabólica. Del microorganismo aislado dependerá el tipo de tratamiento que debe ser istrado al paciente. Se entiende por identificación microbiana al conjunto de técnicas y procedimientos que se aplican para establecer la identidad de un microorganismo. Estas técnicas se utilizan en diferentes áreas, por ejemplo:

• En el área clínica donde es de capital importancia conocer cuál es el agente causal de la infección que presenta un paciente, de manera de poder tratarlo con agentes terapéuticos. • En la industria farmacéutica, cosmética y de alimentos donde las normas de control de calidad exigen la ausencia de ciertos microorganismos. • En investigación básica donde se aísla un determinado microorganismo que debe identificarse para comprobar si se trata de un microorganismo conocido o de uno nuevo para poder clasificarlo.