Platos Teoricos 2v5y3d

Parámetros cromatográficos

Número de Platos Teóricos(N) Es la longitud de columna requerida para que se establezca un equilibrio del soluto entre la FM y FE. El número de platos teóricos mide que tan buena es una columna, la cual debe tener un número grande de platos teóricos y producir picos angostos. Algunas formas empleadas para incrementar los platos teóricos incluye: Alargar la columna, disminuir el diámetro de la columna, mejorar el empaque, disminuir la cantidad de muestra y optimizar el flujo de fase móvil. La definición de plato teórico (y altura de plato) a permanecido desde la teoría propuesta por Martin y Syle, postulada para tratar de explicar eficiencias en las separaciones cromatográficas; Según esta teoría la columna se encuentra formada por un numero N de capas angostas y sucesivas llamadas “platos” dentro de los cuales se efectuaban equilibrios del analito entre las fases móvil y estacionaria.

Determinación de N

Determinación de N

Es difícil establecer en forma precisa el comienzo y final de la señal cromatográfica, se mide el ancho en la mitad de la altura de la señal y se asumirá que es una Gaussiana (W1/2)

N = 16(tr / Wb)

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Altura de un plato teórico (HETP ó H) – Representa el largo de columna requerida por un plato teórico. Según Syle y Martin: representa la longitud de las capas continuas (platos) que componen una columna. H es empleada como medida de la eficiencia de una columna. Cuando el valor es pequeño representa una eficiencia mayor. H es empleada además como parámetro para determinar el ensanchamiento de una banda.

H =L/N

Coeficiente de partición (K) Es el valor de la constante de equilibrio formado por el analito entre las fases móvil y estacionaria. Es constante para una temperatura y característica para cada relación de analito-fase móvil-fase estacionaria.

K = Conc.AnalitoFE / Conc.AnalitoFM K = Cs / CM K = k, xb  = Volúmen FM/ Volúmen FE

Factor de Capacidad (k´) Es un parámetro (k´) que se utiliza para describir las velocidades de migración de los analitos en las columnas y se interpreta considerando que mientras mayor sea el valor de este factor menor es la velocidad de migración de los solutos en la columna. Para una especie A, el factor de capacidad A k′ se define como:

k′A = KA VS VM Donde KA = constante de distribución, VS = Volumen de la fase estacionaria y VM = Volumen de fase Móvil También puede escribirse:

k′A = tRA - tM tM Donde tRA = Tiempo de retención de Compuesto A, tM = Tiempo muerto

Factor de Selectividad o separacaión (α) Determina las separaciones entre picos, un valor de α = 1 representa tiempos de retención iguales y por lo tanto no existe separación. Un número más grande significa una columna más selectiva y una mejor resolución . Los valores grandes de α son el resultado de una fase estacionaria selectiva. (α)

= k’B k’A

donde k’B es el factor de capacidad del compuesto B, que es el mas retenido y k’A es el factor de capacidad del compuesto A( primer comuesto en eluir), que es el menos retenido. Con esta definición α siempre es mayor que la unidad.

 =

tRB - tM tRA - tM

Resolución (R): Es un parámetro que indica cómo dos señales están separadas una de la otra. Un valor de 1.5 representa una separación hasta la linea base de ambos picos, y un valor de 1.0 , representa una resolución del 90%, en algunos casos esto es suficiente para los cálculos del área de los picos Rs = 2 [tRB – tRA] WA + WB

Factor de Retención (Rf ) : Mide la velocidad del soluto a través de una columna comparado con la velocidad de la fase móvil.

Tiempo y Volumen de Retención

Mecanismo de Separación de Componentes Si los solutos 1 y 2 tienen capacidades k1 y k2, entonces sus tiempos de retención están dados por:

y la separación de las señales cromatográficas estará dada por:

Asumiendo que las fases no son compresibles

después de diversas operaciones matemáticas se tiene que:

Donde w es el ancho de la señal cromatográfica

Resolución (R) Es un parámetro que indica cómo dos señales están separadas una de la otra

Otras formas de calcular R usando datos experimentales se muestra a continuación:

Capacidad de Señales Es una medida de cuántas señales se pueden separar entre dos puntos en un cromatograma.

Calculo en terminos teóricos

 Es una medida del número de componentes que pueden ser separados.  Está basada en condiciones isotérmicas o isocráticas.  Asume que el ancho de la señal aumenta linealmente con la temperatura.  Si asumimos un ancho de señal (w) constante, el número posible de señales separadas entre los puntos 1 y 2 será:

Rs1/Rs2=√N1/√N2

Tr1/tr2=(Rs1/Rs2)2

Ejemplo: Ancho

Modelo de Platos Modificado Para Columnas Capilares Las ecuaciones para calcular la resolución y la capacidad para columna empacadas NO son aplicables para columnas capilares. Si el punto 1 corresponde al solvente (aire )

El número de platos puede ser determinado por:

Donde W0 corresponde al ancho de la señal del solvente (aire)

Tiempo de retención tR= Tiempo transcurrido desde el instante de inyección de muestra al máximo de pico Tiempo retención ajustado: t’R = tR – tm

Tiempo muerto, tm, tiempo necesario para que la fase móvil atraviese la columna

Recuerde que existen solo dos formas para mejorar las separaciones cromatográficas:

a)Incrementar la separación de las bandas: Aunque se mejora la separación de los componentes este método tiene el inconveniente de que ocasiona ensanchamiento de las bandas y se requieren tiempos de elución mayores. Ej. Emplear flujos de fase móvil menores, Al aumentar el largo de la columna, Al variar la fase estacionaria (modificando k’), finalmente, incrementando α ya sea variando la temperatura (GC), o la composición de la fase móvil (HPLC)

b) Disminuir el ensanchamiento de los picos Resulta la forma ideal de trabajar pero por desgracia las variables que afectan el ensanchamiento de las bandas solo pueden ser disminuidas hasta cierto grado debido a restricciones técnicas. Ej. Incrementando la eficiencia de la columna ya sea, disminuyendo el diámetro de la columna (ej. col. capilares en GC), o empleando empaques más pequeños (diámetro de partícula, GC/HPLC).

Los factores que pueden afectar las separaciones cromatográficas son:

Independientes del Operador a). Diámetro de columna b). Longitud de columna c). Composición de fase estacionaria d). Diámetro de las partículas de relleno e). Diámetro de la película de fase móvil f). Uniformidad del empaquetamiento Dependientes del Operador g). Composición de la fase móvil h). Flujo de fase móvil i). Temperatura j). Volumen de Injección k). Modificación química de la fase estacionaria

Métodos Analíticos (1) Análisis Cualitativo Comparar el tiempo de retención del pico del problema con el de un patrón.

Se agrega al problema una muestra conocida. Si el tiempo de retención es idéntico al de un componente del problema, el área de ese pico aumentará.

Se debe identificar en dos o más tipos de columnas.

Métodos Analíticos (2) Análisis Cuantitativo

El área de un pico es proporcional a la cantidad de ese componente. 1- Los cromatógrafos modernos tienen integradores y computadoras que calculan las áreas. 2- Planímetro. 3- Para un pico gaussiano, el producto de la altura por el ancho medido a la altura media es igual al 84 % del área total. 4- Puede dibujarse un triángulo con dos lados tangentes a los puntos de inflexión en cada lado del pico. El área es 96 % del área de un pico gaussiano.

Las sustancias A y B tienen tiempos de retención de 16,40 y 17,63 min, respectivamente, en una columna de 30,0 cm. Una especie no retenida pasa a través de la columna en 1,30 min. Las anchuras máximas (en la base) de A y B son 1,11 y 1,21 min, respectivamente. Calcule, a)La resolución de la columna b)número medio de platos en la columna, c)altura de plato, d)la longitud de la columna necesaria para lograr una resolución de 1,5 e)el tiempo necesario para eluir la sustancia B en la columna que da un valor de resolución de 1,5.

a)Rs=1,06 b)N=3444,68 c)H8,71•10-3 cm d)L=60cm e)34,76min

Métodos Analíticos (3) Cómo los detectores no responden de la misma manera a todos los solutos, debe medirse un factor de respuesta empírico F

Area del analito/Area Patrón interno

Área del analito Área del patrón

Concentración del analito =F Concentración del patrón F=FPI/FX Sx/SPI= F x Cx/I

Concentración del analito/Concentración Patrón interno

1.-Se realizo una curva de calibración en HPLC de teobrimina como patrón interno (PI) y teofilina como analito, obteniendo los datos en la siguiente tabla, Calcular la concentración de la muestra problema en ppm. C. analito (mg/L) Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 MP

300 400 500 600

Y= 1,2611x-0,5593

C. patrón Interno (mg/L) 350 350 350 350 350

Área analito

Área Patrón Interno

450,7 804,9 1150,2 1405,6 1268,4

905,7 901,3 890,1 897,8 903,6