Practica N2 Metodo Directo De Breed.docx 2yp29

PRACTICA N° 02 MÉTODOS PARA EL EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS DETERMINACIÓN DEL NÚMERO TOTAL DE BACTERIAS RECUENTO MICROSCÓPICO DIRECTO DE BREED

I.

INTRODUCCIÓN

El crecimiento de los microorganismos presentes en sustratos que se encuentren en condiciones que lo propicien, se traducirá primero en el aumento de los componentes celulares, y en seguida por el aumento del tamaño y el incremento del número de células. Los estudios relacionados con el análisis de muestras de alimentos, leche y otro requieren de una enumeración cuantitativa de los microorganismos presentes en estos compuestos, ya que la calidad microbiológica de estos productos está en relación directa con la calidad sanitaria y la seguridad para el consumo de ellos. Por lo heterogéneo de los microorganismos y de las muestras, existen muchos métodos para tales fines que incluyen métodos microscópicos o directos, el uso de contadores electrónicos de células como el contador Coulter, métodos químicos que permiten estimar la masa celular o constituyentes celulares, lecturas turbidimétricas que se pueden relacionar con el aumento de la masa celular y el método de cuenta en placa de unidades formadoras de colonias. En esta práctica se desarrolla la determinación del número total de microrganismos mediante el método microscópico directo denominado Breed utilizando como muestra un alimento líquido, leche. II.

OBJETIVO 

Determinar el número total de microorganismos en un alimento, utilizando el método directo y utilizando un volumen conocido de alimento.

III.

MARCO TEÓRICO RECUENTO MICROSCÓPICO DIRECTO DE BREED

Es una técnica de laboratorio que se utiliza para el recuento de microorganismos en la leche. Fue presentado en 1910 por los biólogos estadounidenses Samuel Cate Prescott y Robert Stanley Breed, es el primer procedimiento microscópico para el examen de frotis en leche, con el fin de contabilizar las bacterias y leucocitos presentes en ella. IV.

MATERIALES Y MÉTODO

MATERIALES      

Muestra liquida. Microscopio compuesto, previamente calibrado. Lámina patrón para calibración. Ansa calibrada o pipeta calibrada de 0.01 ul. Lámina portaobjetos. Lámina patrón de Breed.

MÉTODO RECUENTO MICROSCÓPICO DIRECTO DE BREED Estandarización del microscopio a) Este debe tener una buena luminosidad, para estandarizarlo hay que utilizar una tabla micrométrica que viene con divisiones de 0.1 – 0.01 mm. b) Con el microscopio, ubicar el centro de la lámina patrón, se observará el campo microscópico, hacer coincidir en 0 mm (que es el inicio de la numeración), seguir continuamente hasta lograr medir el total del campo microscópico. c) Determinar el área del campo, en mm2 aplicando la fórmula de la superficie circular: 𝜋. 𝑟 2 d) Por ultimo pasar a cm2, para encontrar el “Factor Microscópico”. Preparación de la muestra a) Colocar una lámina portaobjetos nueva, desengrasada y de preferencia nueva sobre la lámina patrón de Breed (es este caso es sólo una manual que se realizó a partir de un cartón simple).

b) Homogenizar la muestra entre 20 a 25 veces.

c) Coger 0.01 ml de muestra y colocar sobre el cuadrado dibujado sobre la lámina portaobjetos y extender delimitando el cuadrado, al final quedrá una película, secar al mechero 40 a 45°C.

d) Si después del secado la muestra aparenta estar muy grasosa, realizar un pequeño lavado con xilol, este con el objetivo de aclarar la muestra. e) Teñir la película con el método de Gram.

f) Observar al microscopio y contar los microorganismos por campo, utilizando lente de inmersión para lo cual se utiliza un número de campos microscópicos que sean representativos.

g) Calcular el Número Promedio de Microorganismos por campo por el Factor Microscópico por el Recíproco de la dilución. V.

RESULTADOS 

El conteo de los diversos campos dio como resultado:

Campo 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15

Número de m.o. 2 1 3 1 0 1 1 0 4 1 2 1 0 1 1

Campo 16 17 8 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Número de m.o. 3 1 2 0 0 1 1 3 3 0 1 1 0 2 0



Número Promedio de Microorganismos por campo: ∑ 𝑚. 𝑜 𝑝𝑜𝑟 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑜 37 = = 𝟏. 𝟐𝟑 𝑛° 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑜𝑠 30



Factor Microscópico: Como no se determinó el campo microscópico, ya que no se contaba con una lámina patrón micrométrica que calibre al microscopio se usó su equivalencia según: Standard Methods for the Examination of Dairy Products APHA, indica que el factor microscópico tiene que estar entre:

300,000 - 400,000 - 500,000 - 600,000 

Recíproco de la dilución

0.01 = 100 

Recuento microscópico de microrganismos totales:

N° Promedio de m.o. por campo X F.M. X Recíproco de la dilución 1.23 X 400,000 X 100 49, 200 000 m.o./mL VI.

CONCLUSIONES  



Se determinó que el número total calculado de la muestra de leche trabajada es de 49, 200 000 microorganismos por cada mililitro. Es una técnica sencilla y rápida, los resultados no deben ser considerados precisos ya que no se pudo calibrar a los microscopios, pues no se contaba con una lámina patrón para calibrar, también se debe tener en cuenta que esta técnica se considera a todo tipo de células ya sean viables y no viables. De alguna u otra manera se pudo conocer este método, que servirá de mucha ayuda durante nuestra formación profesional.

VII. CUESTIONARIO 1. ¿Para qué otros alimentos se podrá utilizar el Método de Breed? Principalmente se analizan alimentos de tipo líquido:

    

Leche pasteurizada. Leche no pasteurizada. Leche Cruda O Bronca (De Establo). Vino Caducado. Sidra.

¿Qué otros método de contaje directo existen para determinar el número total de microrganismos? CONTEO MICROSCÓPICO DIRECTO EN CÁMARA DE PETROFF HA Es una placa de vidrio con una cuadricula en depresión donde se deposita la muestra medida. Es posible relacionar el número de células observadas en la superficie del cuadro, con el volumen de esa área. Considerando los volúmenes en la cuadricula se puede calcular la concentración de microorganismos por ml. CONTEO TURBIDIMÉTRICO En una suspensión microbiana la cantidad de células está directamente relacionada con la turbiedad o densidad óptica de la misma e inversamente relacionada con la cantidad de luz que pasa a través de ella. Esto permite determinar con bastante exactitud la cantidad de microorganismos en la suspensión mediante la determinación de la turbiedad mediante un nefelómetro o un espectrofotómetro. Los resultados se comparan con una curva estándar construida con una suspensión testigo de concentraciones conocidas. La turbiedad que resulta en la suspensión microbiana se aproxima a la producida por un cierto número de células en suspensión. Esta técnica es útil solamente para organismos unicelulares de pocos mm, como las bacterias, lo que les permite mantenerse suspendidos y homogéneamente distribuidos. CONTADORES ELECTRÓNICOS Se hace pasar un volumen conocido de la muestra con microorganismos a través de un orificio de 5 a 10 mm de diámetro, mediante la manipulación con una micropipeta de mercurio. La resistencia eléctrica a través del orificio está normalizada y se altera cada vez que un microorganismo pasa a través de él. La modificación de la resistencia se amplifica y se registra electrónicamente. MÉTODOS DE CONTEO EN MEDIO DE CULTIVO Mediante un cultivo de la muestra se detectan únicamente las células vivas. En todos los casos se parte de un volumen o peso de muestra conocido. Conociendo la procedencia de la muestra se puede esperar la obtencia s de

cuentas bajas o altas o incluso ausencia de organismos. Si se esperan pocos microorganismos, las muestras se pueden centrifugar o filtrar. Si se esperas cuentas altas, se puede diluir la muestra en cantidades conocidas del diluyente, utilizando solución salina, agua peptonada u otros.     

Método de las diluciones y vaciado en placa. Técnica de conteo en placa por extensión superficial. Recuento por filtro de membrana. Siembra en tubo o recuento del número más probable. Método de la gota o de miles y Misra OTROS MÉTODOS

Determinación del peso seco, determinación del Nitrógeno en las células cultivadas, medición de actividades bioquímicas. ¿Qué otros colorantes se pueden usar para realizar el método de Breed en el caso de trabajar con una muestra tipo liquida: leche? Se puede utilizar:   

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Azul de metileno de Löeffler. Cristal violeta. Se puede utilizar un microscopio de fluorescencia, en el cual se utilizará un tipo decolorante distinto (fluorenscentes) como el azul de anilina modificado. Las células viables se pueden diferenciar de las no viables, para eso se puede usar lanaranja de acridina (0,01%), este es el método de recuento directo con naranja deacridina (AODC). También se pueden usar coloraciones por los métodos de Levowitz– Weber o Broadhurst–Paley que permiten observar específicamente células somáticas en leche.

VIII. BIBLIOGRAFÍA OLIVAS E. EVANGELINA AND ALARCÓN LUIS R. manual de prácticas de microbiología básica y microbiología de alimentos. [INTERNET]. Pimera Edición. México Universidad Autónoma de Ciudad Juárez [revised 2001; Cited 2017 Oct 23] Available from: https://books.google.com.pe/books?id=OykG04ClBUC&pg=PA30&lpg=PA30&dq=RECUENTO+MICROSC%C3%93PICO +DIRECTO+DE+BREED&source=bl&ots=jKvIuPRik&sig=FpCElTLb9W5rvJ7qGreG3LAEwkU&hl=es419&sa=X&ved=0ahUKEwiH0oU4bzWAhVMKCYKHUnqDwUQ6AEINzAC#v=onepage&q=RECUENTO%20MI CROSC%C3%93PICO%20DIRECTO%20DE%20BREED&f=false MELO POBLETE GERMAN ANTONIO. DETERMINACIÓN DE CÉLULAS SOMÁTICAS EN LECHE CRUDA RECEPCIONADA EN PLANTAS LECHERAS, MEDIANTE DOS MÉTODOS DE RECUENTO. [Tesis de grado presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de LICENCIADO EN MEDICINA VETERINARIA] UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE Facultad de Ciencias Veterinarias Facultad de Ciencias Agrarias Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos, Valdivia, Chile; 1998 [INTERNET] [Cited 2017 Oct 23] Available from: http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/1998/fvm528d/doc/fvm528d.pdf C. Prescott and R. S. Breed. The Determination of the number of body cells in milk by a direct method. By S. [INTERNET] [Cited 2017 Oct 23] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2543863/pdf/amjphygiene000030209.pdf TÉCNICAS PARA LA ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA Y OTRAS MUESTRAS. [INTERNET] [Cited 2017 Oct 23] Available from: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/P7CuantificacionDeMicroorganismo s_21746.pdf GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS - MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA [INTERNET] [Cited 2017 Oct 23] Available from: http://www.qo.fcen.uba.ar/quimor/wp-content/s/2012/08/GUIA-TPMICRO_2012.pdf Ing. Nuria Dávila Fernández y Dr. C. Juan Emilio Hernández García. REVISTA ELECTRÓNICA DE VETERINARIA REDVET MÉTODOS DE ENSAYOS RÁPIDOS DE DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS EN LA LECHE. Vol. VII, Nº 07, Julio/2006 [INTERNET] [Cited 2017 Oct 23] Available from: http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070706/070603.pdf MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS. METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS. ANALISIS DE LOS MICROORGANISMOS TOTALES [INTERNET] [Cited 2017 Oct 23] Available from: http://www.academia.edu/5397941/MICROBIOLOGIA_DE_ALIMENTOS