Pre Informe 2 Unidad 5g633k

Universidad Nacional del Santa Laboratorio de Bioprocesos

E.A.P. Ing. Agroindustrial Pre Informe Nº 02

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

1



FACULTAD DE INGENIERIA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL TITULO: “DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES” PROFESOR: AUGUSTO CASTILLO CALDERON

GRUPO: B-3 CURSO: LABORATORIO DE BIOPROCESOS ALUMNOS:     

ESCOBEDO FLORES ALEX JESUS GUTIERREZ DIANA LÓPEZ ZAMORA MARILEYLA MORALES CHORRES CYNTHIA VALVERDE LÓPEZ EDISON

NVO CHIMBOTE, MAYO2016

2



CONTENIDO 1 I.

OBJETIVOS:...........................................................................................................3 1.1.

Objetivos Generales:

3

1.2.

Objetivos Específicos:

3

II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL:.................................................................4 2.1)

SOLIDO DE MANTENCION

5

2.2) Medio Activación:

6

2.3) Medio para fermentación:

8

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:.......................................12 1.

Preparación medio solido del de mantención

12

3.

Medio de activación

13

4.

Medio de fermentación

14

IV. CRONOGRAMA...................................................................................................15 V.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:...............................................................16

VI. ANEXOS:...............................................................................................................17 1) Referencias de composición de medio de mantención, activación y cultivo para Pichia Stipitis NRRL Y-7124 para la producción de etanol. 17 2)

Cálculo de la velocidad de aireación específica: “vvm”

17

3)

Cálculo del flujo de aireación recomendado

19

4)

Formato del plan de muestreo y registro de datos

20

3



DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES I.

OBJETIVOS:

I.1.

Objetivos Generales:  Diseñar y realizar una experiencia de fermentación en cultivo celular por lote de Pichia stipitis NRRL Y-7124 en un medio simulado de hidrolizado de cascarilla de arroz, a fin de producir etanol en condiciones de micro aireación, midiendo el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno a distintas condiciones de aireación y agitación.

I.2.

Objetivos Específicos:



Identificar y describir las partes, rios y geometría del fermentador de laboratorio, conocimiento de su operación,



esterilización, carga y descarga y toma de muestras. Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y

 

control automático, así como la calibración de los sensores. Activación celular y desarrollo del inoculo. Puesta en marcha del cultivo por lote CL. En el cultivo por lote determinar µmax y Y x/s. Asimismo determinar el Kla por el



método dinámico de Humphry y correlacionar los resultados. Obtener los perfiles de masa celular, fuente de carbono, oxígeno disuelto y pH después del tiempo total de fermentación en el biorreactor.

4


II.


METODOLOGIA EXPERIMENTAL:

Tabla 1: Referencia de composición de medios de mantención, activación y cultivo para Pichia stipitis Y- 7124 TABLA N°01 MEDIO Solido de mantención

Activación

Fermentación

NUTRIENTE Extracto de levadura

CONCENTRACION (g/l) 3

Peptona

5

Extracto de malta

3

Agar Glucosa

20 5

Extracto de levadura.

3

Extracto de malta

5

Solución de sales

5 ml/L

N = 220 rpm Glucosa

10

Xilosa

3

Extracto de levadura

3

KH2PO4

2

(NH4)2SO4

3

MgSO4.7H2O

1.1

Solución de sales

5 ml/L

Tampón citrato

100ml/L

Ph 4.5 0.04M

2.1)

SOLIDO DE MANTENCION

5



 Se iniciara teniendo en cuenta la referencia de composición de medios de cultivo de mantención para Pichia stipitis Y- 7124.  Luego de acuerdo a la tabla Nº 1 se pesan las cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado.

MEDIR

En una probeta graduada de 50 ml de agua destilada.

Adicionando agua destilada. MEZCLAR

CALENTAR Adicionar 6 ml de mezcla a cada tubo PREPARAR

COLOCAR

CALENTAR

AJUSTAR

6

Todos los componentes en un matraz Erlenmeyer Con el mechero de bunsen la mezcla disuelta en el matraz, agitando con una varilla de vidrio, hasta aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de a 1 a 2 min. 8 tubos de ensayo con tapa y en caliente, inmediatamente taparlos. Los tubos en un vaso precipitado, y llevarlos a la olla a presión, previamente aflojado las tapas, para permitir el intercambio de gases. Hasta que la temperatura alcance los 121°C y a partir de ello controlar de 15 a 20 minutos. Finalizando la esterilización. Las tapas de los tubos, luego colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.



Luego preparamos nuestra área de trabajo, desinfectando con alcohol. para tener un área estéril prendemos el mechero cinco minutos antes de realizar la resiembra con el Pichia stipitis Y- 7124

Los tubos de ensayo cerca del mechero de bunsen, flameando para evitar la contaminación, teniendo la aza bacteriológica calentando al rojo vivo.

ABRIR

2 a 3 azadas y colocamos en el tubo con agar, flameamos y cerramos el tubo y así los 8 tubos con agar.

SACAR 2.2) Medio Activación:

TABLA 02: Concentración de Nutrientes para el medio de activación (15 ml y 100ml) Nutriente

Concentración

Peso

(g/L)

15ml

100ml

Glucosa

5

(gr) 0.075

(gr) 0.5

Extracto de levadura

3

0.045

0.3

Extracto de malta

5

0.075

0.5

Solución de sales

5 ml/L

0.075

0.5

7

- Peso

-



DIAAGRAMA Nº1 preparación de medio de activación

Todos los nutrientes

Matraz Erlenmeyer de 125 ml

MEDIR PESAR

En cada tubo y adicionar agua para disolver

COLOCAR ESTERELIZAR

EL pH 6.0

MEDIR

En un mechero de Bunsen la mezcla para evitar contaminación Constantemente con una varilla por un minuto (aparición de la primera burbuja)

CALENTAR AGITAR

DIAGRAMA Nº 02 RESIEMBRA SOLIDO – LIQUIDO La AGREGAMOS

INOCULAMOS COLOCAMOS

En el matraz de 500ml Tomamos una azada e inoculamos en el matraz con el medio de activación En el Shaker a T= 30º 180 rpm

2.3) Medio para fermentación: TABLA 03: Concentración de Nutrientes para el medio de fermentación (3000 ml) nutriente Glucosa

Concentración – 1L 10 8

Concentración – 3L 30


Xilosa Extracto de levadura KH2PO4 (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O Solución de sales Tampón citrato


3 3 2 3 1.1 5 ml/L 100ml/L

9 9 6 9 3.3 15 300

Condiciones de asepsia Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza para prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo. 1 Rotular el matraz con el nombre de la cepa, la fecha y el nombre del grupo (A). 2 Desinfectar el área de trabajo utilizando alcohol 96° 3 Encender el mechero Bunsen. 4 Sostener los matraces. Si los matraces tienen un tapón de algodón, aflojar un poco de manera que no esté muy apretado. 5 Flamear en el mechero Bunsen. 6 Retirar una tapa con el meñique, mientras sostienes los matraces. Nunca poner las tapas sobre la mesa. 7 Flamear la boca de ambos matraces para matar cualquier microorganismo presente en el aire y que pueda contaminar la parte superior durante las manipulaciones. 8 Los matraces abiertos deben mantenerse en posición inclinada para que el riesgo de contaminación sea mínimo. 9 Sembrar en el matraz estéril el inoculo. 10 De nuevo flamea las bocas de los matraces y tápalos de nuevo. Asegúrate de mezclar muy bien el inoculo en los matraces que contienen el caldo sembrado. 11 Flamea los tapones antes de que los coloques en los matraces. Preparación de medio de fermentación, según la Tabla Nº .03. Para el cultivo de Pichia stipitis Y- 7124 Materiales  Matraces  Espectrofotómetro  Varilla de vidrio 9



Instrumentos e Equipos  Balanza analítica.  Biostato Reactivos  Extracto de levadura  Glucosa-xilosa  (NH4)2SO4  KH2PO4  MgSO4.7H2O

DIAGRAMA Nº03 preparación de medio de fermentación Los componentes

PESAR

DILUIMOS

REGULAR

ESTERELIZAR

Cada componente con agua destilada - Extracto de levadura en un matraz de 2L con agua destilada - (NH4)2 SO4 , KH2 PO4 , (MgSO4).7H2O en un

El pH de 4.5

Las disoluciones separado

por

ENFRIAR 10 MEZCLAR COLOCAMOS

El extracto extracto de de levaura yacon y adicionar el inoculo del medio de activación En el Shaker a T= 30º -



DIAGRAMA N: 04- Procedimiento para el fermentador en el medio de fermentación CULTIVAMOS

Los 2L de medio de fermentación en el biostat - Aplus

APLICAMOS

El método Dinámico durante 30 horas al caldo de cultivo

OBSERVAR

En las primeras 10 horas su crecimiento (KLa)

TOMAR

GRAFICAR

11

Lecturas de de oxígeno disuelto a cada intervalo (fase gasificada y fase de corte aire) En una hoja de Excel para las gráficas de regresión y correlación



III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS: 1. Preparación medio solido del de mantención Materiales  

 



Pipetas de 10 ml. Tubos de ensayo

 

con tapas Varilla de vidrio Matraz Erlenmeyer

  



      

12

Probeta graduada Mechero Bunsen Espátula Guantes. Capachos de papel Vaso de precipitado





Instrumentos e Equipos



Balanza analítica Olla a presión

 



Reactivos

    

 

Extracto de levadura. Peptona. Extracto de malta. Agar Glucosa

2. Resiembra celular 

Materiales 

Aza bacteriológica



Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra el M.O.



Mecheros.



Alcohol. 



Instrumentos e Equipos 



Incubadora

 3. Medio de activación  Materiales 

Matraz de 125 ml.



Guantes



2 tubos de ensayo con tapa



Capachos de papel aluminio



Varilla de vidrio



Pipetas de 1, 5, y 10 ml



Pinzas, espátula.



Algodón ,gasa



Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

  13



  Instrumentos e Equipo 

Shaker



pH metro



Balanza analítica



Olla a presión

    Reactivos o Glucosa

o MgSO4.7H2O (sigma).

o Extracto de levadura

o

pH 4,5

o Extraxto de malta

o

T 30ªC, N 220 rpm.

o o o o o o o o 4. Medio de fermentación o Materiales 

Matraz de Erlenmeyer



Espectrofotómetro.



Matraces.



Varilla de vidrio.

 

Instrumentos e Equipos

14







Biostato

15

Balanza analítica.


IV.


CRONOGRAMA 

16



V. 

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:



http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php? Mostrar=quimicos http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5CKitsC.pdf. http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.sht ml  QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniería Bioquímica.                                 

 



17



    

VI.

ANEXOS:

 1) Referencias de composición de medio de mantención, activación y cultivo para Pichia Stipitis NRRL Y-7124 para la producción de etanol.

18







Medio

 

Sólido de manten ción 

  

Nutriente



Concentra ción (g/L)  3  5  3  20

Extracto de levadura Peptona Extracto de malta Agar



  

Activac ión 

  

   

Glucosa Extracto de levadura Extracto de malta Solución de sales

Glucosa Xilosa Extracto de levadura

( NH 4 )2 SO 4



Ferme ntación

   





5 3 5 5 m/L

N: 220 rpm

 

  

KH 2 PO 4 MgSO4 .7 H 4 O Solución de sales Tampón citrato pH 4.5 0.04M

 

     19

 10  3  3  3  2  1.1  5 mL/L 100 /L


         






Fuente: A. Castillo. 1994. Tesis Magíster PUCV

2) Cálculo de la velocidad de aireación específica: “vvm”  vvm=2,035 x 10−4



NA x T ε

  

Donde: 

NA: Velocidad de Consumo de Oxigeno



T: Temperatura en °K



Ɛ : Eficiencia de Absorción

Los valores típicos de vvm: Laboratorio: 0,5 – 2.0 vvm



 Y o2=Rendimiento de oxigenoen celula



(0.5−2.0 g cel .) / g O2

DATOS A TENER EN CUENTA:  

Consideramos: o

Y o2=1

o

ε

gr gr

= 0.1 (Eficiencia de absorción)

o μmáx = 0.4984 h-1

20



 

Para determinar la biomasa producida X: △ x=Y x ∗( △ s )



s



Rendimiento:



Y x= s

△ x c . en la glucosa = ∗( F) △ s c . en la célula

 

F= 0.25: Factor de aireación para condiciones microareóbias.





Calculamos el rendimiento: Y x=



s

c .en la glucosa 40 ∗( F ) = ∗ ( 0.25 ) c .en la célula 46.57

Y x =0.21473 g /g



s

 

Sustrato en el hidrolizado de cascarilla de arroz 

 

ΔS = 10 g/L de glucosa + 03 g/L de Xilosa  ΔS = 13 g/L de sustrato total

 Por lo tanto, calculamos la Biomasa generada (Δx):

△ x=Y x ( △ s ) s





△ x=2.791497 g /L



21

g 0.21473 g /¿ ¿ △ x=¿





Entonces reemplazamos datos para calcular la demanda de

oxigeno (NA):

 

N A=

μ∗x Y o2

Valores: o

μmáx = 0.4984 h-1 Y o2=1

o

X =2.791497 g /L

o



gr gr

Entonces:

( 0.4984 )∗( 2.791497 ) 1



N A=



N A =1.39128 g O2 / L. h



Velocidad de aeración especifica ( vvm ): ∘

∘

T =30 C=303 K  

Fórmula: vvm=2,035 x 10−4

vvm=2, 035 x 10−4 (1.39128)∗(303) 0.1

NA x T ε vvm=0.85787 h−1

 3) Cálculo del flujo de aireación recomendado  ´ Q ´ vvm= ⟹ Q=vvm∗V L  VL   



Dónde:  

Vvm = 0.85787 min-1 Volumen de fermentación VL= 2 L

22





´ ( 0.85787∗2 )=1.71574 LO2 /h Q=

 

En minutos:

 

´ Q=0.028596 L O2 /min

Formato del plan de muestreo y registro de datos

  CULTIVO CELULAR POR LOTESY MEDICIÓN DEL KLA 



Plan de Muestreos y Registro de Datos

 

Grupo: __________________________________

Día: ___ /___ /

___ 

Microorganismos: ___________________________



Fuente Carbono: ____________________________

 





 

 T







N

A



I

b

H

E

s

M

.

P

(

O

6



 O

 



vacio

p

nes



4 0 n m ) 





















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







23

Obser





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