Star Vac 106a14

Biblioteca

5 Startvac®

nº

Evaluación de la utilización de la vacuna Startvac® en una explotación lechera afectada por mastitis ambientales Carlos Ribeiro, Médico Veterinario; Dália Castro, Médica Veterinaria [email protected] | Centro Veterinario de Aveiro, Portugal

1. Introducción as mastitis representan un coste muy elevado en una explotación lechera. El coste de una mastitis puede suponer una reducción del 20% al 25% tanto en la producción de leche como en la proporción de grasa de la misma (Sharma et al., 2009). A estas pérdidas económicas se le suman los costes inmediatos ligados al tratamiento de la mastitis, el valor de la leche desechada y las penalizaciones en el precio de la leche, resultantes del aumento del recuento de células somáticas (RCS) y de los recuentos bacterianos totales. A todo esto hemos de añadir que muchas mastitis conducen a la pérdida de uno o más cuartos mamarios y al rechazo precoz de algunas vacas. Las mastitis nunca podrán ser erradicadas, porque son el resultado de múltiples factores: animal, ambiente, manejo, rutina de ordeño y microorganismos. La elevada producción de leche también es uno de los factores de predisposición para la aparición de mastitis, pues aumenta la sensibilidad de la ubre frente a las infecciones. Diversos estudios han demostrado que casi

Tasa de Taxa denuevas novas infecciones infecções

L

Parto Parto

Lactancia Lactação

Secado Secagem Parto Parto Período Período seco seco

Gráfica 1. Tasa de nuevas infecciones intramamarias durante la lactancia y el período seco (Adaptado de Naztke)

la mitad de las mastitis ambientales desarrolladas en el inicio de la lactancia estaban relacionadas con infecciones adquiridas durante el período seco (Bradley et al., 2000) (Gráfica. 1).

En el terreno del control de las mastitis, aparte de los antibióticos, del manejo ambiental, de las medidas de higiene y de la rutina de ordeño, surge ahora en Europa el tratamiento profiláctico mediante vacunación.

5

Evaluación de la utilización de la vacuna Startvac® en una explotación lechera afectada por mastitis ambientales | Centro Veterinario de Aveiro, Portugal

Problemas Problemas digestivos (1) digestivos

Probl. músculoProb. musculoesqueléticos (1) esqueléticos

tal y los considerables costes que supone la aplicación de antibióticos intramamarios (Gráfica 3) nos llevaron a elegir esta explotación de vacas de leche como blanco de nuestro estudio. De hecho, durante el año 2009, la explotación estudiada tuvo unos gastos aproximados de 11.000 euros en antibióticos intramamarios para el tratamiento de mastitis clínicas de vacas en lactancia, lo que corresponde al 72% del coste total correspondiente a medicamentos de la explotación.

Problemas Problemas podales (1) podais

Síndrome de Sindrome vaca gorda da (1) vaca gorda

Aborto (2) Aborto

Baja enna la Baixa producción (3) produção

Trastorno causa Doen.decausa desconocida (2) desconhecida

Infertilidad (3) Infertilidade

de las LesãoLesión dos tetos mamas (1)

Lig. ubre roto Lig. ubere (1) partdo

Mastitis crónica Mamite crónica (10)

Vacas Vacas

nº 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Cetosis (1) Cetose

Carlos Ribeiro, Médico Veterinario; Dália Castro, Médica Veterinaria | [email protected]

Gráfica 2. Motivos de rechazo durante el período de 15/3/2009 a 16/3/2010

Las vacunas tipo J5 (E. coli), ya disponibles hace algunos años en los Estados Unidos, son utilizadas en la prevención de mastitis provocadas por coliformes, tales como E. coli, Klebsiella spp, Citrobacter spp y Enterobacter spp. Según varios estudios, la istración antes del parto en vacas adultas y novillas representa una sólida inversión, con un significativo beneficio económico. HIPRA ha registrado ahora STARTVAC®, que asocia la protección inmunitaria contra E. coli y coliformes a la protección contra S. au-

reus y estafilococos coagulasa negativos (ECN), en el sentido de reducir la gravedad y la duración del estado clínico de las mastitis y prevenir nuevas infecciones. Con el objetivo de evaluar la eficacia y la relación coste/beneficio de esta vacuna, utilizamos STARTVAC® en una explotación lechera con elevadas pérdidas económicas debidas a mastitis por agentes coliformes, sin haber sido alterado el control preventivo. El alto porcentaje de rechazo por mastitis (Gráfica. 2), el elevado recuento celular to-

80

El protocolo utilizado fue el indicado por el fabricante (HIPRA) y consistió en la aplicación intramuscular de 2 ml de STARTVAC®, entre 45 y 15 días antes del parto y 50 días después del parto, en vacas y novillas gestantes. Este protocolo de vacunas fue aplicado durante un período de seis meses, tras el cual se evaluaron la incidencia de nuevas infecciones en el total de animales vacunados, la evolución del recuento celular en el hato y los costes asociados al tratamiento de las mastitis. El estudio en cuestión se llevó a cabo sobre un grupo de 65 vacas en lactancia. El ensayo se inició el 27 de julio de 2009 y durante el mismo fueron vacunadas 10 novillas y 16 vacas adultas. La primera vaca vacunada tenía el parto previsto para el 7 de septiembre de 2009, por lo que fue a partir de esta fecha cuando empezaron a recogerse datos para el análisis de la eficacia de la vacuna en el grupo por comparación con los 6 meses anteriores.

3. Análisis de los resultados

40

Gráfica 3. Costes (en %) en medicamentos (2009)

Antibióticos Antibióticos secado secagem

Antiinflamatorios Anti-infl.

Corticosteroides Corticos

Desparasitantes Desparasitantes

Hormonas Hormonas

Otros Outros

Suplementos Suplementos

Vacunas Vacinas

en general

0

Antibióticos Antibióticos

20

Antibióticos Antibióticos mastitis mamite

Porcentaje Percentagem

60

2. Metodología

Para descartar la posibilidad de que nuestros resultados quedaran enmascarados por el eventual rechazo de vacas crónicas, comparamos el número de animales eliminados por mastitis en los seis meses anteriores al ensayo y durante el mismo. Analizando estos datos, observamos que el número de vacas rechazadas por mastitis se mantuvo igual en ambos semestres (Tabla.

Evaluación de la utilización de la vacuna Startvac® en una explotación lechera afectada por mastitis ambientales

Tabla 1. Vacas rechazadas en el período de 01-02-2009 a 28-02-2010. Fecha 24/02/2009 24/02/2009 24/02/2009 24/02/2009 24/02/2009 24/02/2009 24/02/2009 18/03/2009 18/03/2009 18/03/2009 22/03/2009 19/05/2009 20/06/2009 20/06/2009 20/06/2009 23/06/2009 25/08/2009 25/08/2009 19/09/2009 22/09/2009 24/09/2009 25/09/2009 15/12/2009 15/12/2009 16/12/2009 16/12/2009 16/12/2009 16/12/2009 18/01/2010 18/01/2010 18/01/2010 21/02/2010 21/02/2010 21/02/2010

Id. Vaca 1057 8601 4260 1046 4256 8600 3857 4023 3243 5629 4104 8697 4830 8602 8597 2234 1048 9602 4296 4253 6741 4252 6970 1595 2702 2227 4266 0344 6968 9520 4241 9451 4255 4293

Causa del rechazo Mastitis CLÍNICA MUERTE SÚBITA COMPLICACIONES POSTPARTO LESIÓN DE LOS PEZONES ABORTO LIPIDOSIS HEPÁTICA LIPIDOSIS HEPÁTICA Mastitis CRÓNICA ABORTO Mastitis CRÓNICA BAJA EN LA PRODUCCIÓN LIGAMENTO UBRE ROTO Mastitis CRÓNICA INFERTILIDAD ENFERMEDAD CAUSA DESC. ENFERMEDAD CAUSA DESC. PROB. DIGESTIVOS Mastitis CRÓNICA CETOSIS ABORTO LIPIDOSIS HEPÁTICA PROB.MUSCULOESQUELÉTICOS Mastitis CRÓNICA Mastitis CRÓNICA Mastitis CRÓNICA Mastitis CRÓNICA Mastitis CRÓNICA Mastitis CRÓNICA INFERTILIDAD BAJA EN LA PRODUCCIÓN BAJA EN LA PRODUCCIÓN INFERTILIDAD PROBLEMAS PODALES LESIÓN DE LOS PEZONES

Nº Parto 1 3 2 1 3 2 3 4 3 2 5 3 3 2 3 3 1 2 2 3 4 3 3 3 3 4 2 3 3 4 3 1 4 2

Días en lactación 2 293 5 325 330 441 408 347 365 403 482 112 43 417 111 178

Tabla 2. Lista de vacas con valores de RCS por encima de 250.000 células somáticas. Id. Vaca

Nº Parto

4261 4295 1042 1053 4262 4268 1051 4300 1043 1049 1052 1060

05/04/09/2/G 04/05/09/2/G 07/05/09/2/G 19/05/09/1/G 15/06/06/2/S 26/07/09/2/G 11/09/09/1/I 27/11/09/2/I 27/12/09/2/C 18/01/10/2/I 23/03/10/2/P 17/04/10/2/P

05 04 04 04 03 Ene Feb Mar May Jun

03 Jul

03 03 03 04 03 03 Oct Nov Dec Ene Feb Mar

34 146 40 111 77 50 33 -

171 577 41 29 80 874 176 176

227 301 381 15 47 31 111 398 309 76

149 176 36 272 205 44 47 1151

65 121 40 262 738 20 3556 379 139

39 275 219 29 412 265 303

226 143 64 20 3556 379 139

967 545 1770 43 58 133 199 345 541 153

109 570 306 1185 64 102 236 43 336 137

876 929 1975 487 207 200 71 79 64 92

290 787 1929 1020 112 179 638 138 1559 130 147

304 577 880 781 2570 405 433 305 1550 437 -

Días en lactación

Total producción

Media producción

332 349 300 288 307 220 173 96 66 44 -

13,426 9,969 12,057 9,200 10,237 6,039 5,875 4,729 2,377 1,702 -

40.44 28.56 40.19 31.94 33.35 27.45 33.96 49.26 36.02 38.68 -

.

600 500 CCS x1000

400 300 200

Nov

Dez

Jan

Fev

Marzo

Out

Febrero

Set

Enero

Ago

Diciembre

Jul

Noviembre

Jun

Octubre

Mai

Septiembre

Julio

Abr

Agosto

Junio

0

Mayo

100 Abril

1), por lo que podemos considerar que éste no será un criterio con influencia en los resultados. Durante los seis meses del ensayo (de septiembre a febrero), fueron rechazadas 6 vacas por mastitis, al igual que en el semestre anterior. Considerando que, a partir de 250.000 cels/ml, el animal presenta índices de pérdidas de producción y de calidad de la leche (Brito et al., 1997), seguimos este criterio en nuestro ensayo. De esta forma, analizamos el número de vacas vacunadas, con RCS por encima de 250.000 células (RCS por encima de 300.000 implican la pérdida de un punto de bonificación en el pago de la leche) (Tabla. 2). De los 26 animales vacunados (novillas y vacas adultas), 5 aparecen marcadas en la lista de animales con RCS mayor de 250.000 cels/ml. Esto representa el 25% de nuevos casos en el total de vacas adultas y el 10% de las novillas vacunadas durante este período de tiempo. El recuento celular en el tanque disminuyó (como media por semestre) de 449.000 cels/ml a 239.000 cels/ml. (Gráfica 4). Analizando la evolución de los costes de tratamiento, verificamos una significativa reducción de los mismos en relación con la medicación intramamaria para las mastitis (Gráfica 5). Al observar el gráfico, constatamos un gasto medio mensual en medicamentos intramamarios por encima de los 1.000€. Este valor quedó reducido a menos de la mitad a partir de septiembre. La inmunización durante el período seco puede considerarse como una posible explicación de los resultados tan inmediatos en la reducción de los costes de tratamiento, al registrarse una menor incidencia de mastitis en el posparto y responder más rápidamente los casos clínicos a los antibióticos comunes. Ante la hipótesis del carácter estacional típico de las infecciones por coliformes, buscamos si en el año anterior, y en la misma época, se había verificado esta reducción de costes en materia de antibióticos intramamarios. Al analizar la tabla de datos del año 2008, de la cual sólo disponemos de cifras a partir del mes de abril, no se observa estacionalidad, manteniéndose los costes constantes a lo largo del año en una media de 1.250€ (Gráfica 6).



Mar

Gráfica 4. Evolución del RCS durante el último año. El recuento celular en tanque ha disminuido (en media por semestre) de 449.000 céls/ml para 239.000 céls/ml.

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Evaluación de la utilización de la vacuna Startvac® en una explotación lechera afectada por mastitis ambientales Carlos Ribeiro, Médico Veterinario; Dália Castro, Médica Veterinaria | [email protected]

3.500 € 3.000 € 2.500 € 2.000 € 1.500 € 1.000 €

Febrero

Enero

Diciembre

Noviembre

Octubre

Septiembre

Agosto

Julio

Junio

Mayo

Abril

0€

Marzo

500 €

Febrero

nº

Durante el semestre en que llevamos a cabo la vacunación con STARTVAC® conseguimos resultados muy positivos, con una disminución del recuento celular en el hato (reducción de una media de RCS de 449.000 a 239.000) y con una extraordinaria reducción de costes en antibióticos intramamarios (disminución de la media mensual, que se hallaba por encima de 1.000€, a menos de la mitad). Así pues, se puede concluir que realmente existió una disminución de la gravedad de las mastitis clínicas y también de las subclínicas (RCS > 250.000). En lo referente a la aparición de nuevos casos, no podemos afirmar cuál fue su evolución, sabiendo sólo que la incidencia en el total de los animales vacunados fue del 20%. Para reforzar estas conclusiones sería interesante que se efectuasen nuevos estudios para evaluar la relación coste/eficacia de la vacuna, con un número mayor de animales y durante un tiempo más prolongado.

4.000 €

Enero

4. Conclusiones

| Centro Veterinario de Aveiro, Portugal

Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Jan Fev

Gráfica 5. Gasto en medicamentos intramamarios en 2009

1.600 € 1.400 € 1.200 € 1.000 € 800 € 600 € 400 €

Nov

Diciembre

Out

Noviembre

Set

Octubre

Ago

Septiembre

Jul

Agosto

Jun

Julio

Mai

Junio

Abr

Mayo

0€

Abril

200 € Dez

Gráfica 6. Coste medio mensual con uso de intramamarios: ~1.250€

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Aspectos generales del Biofilm e implicación en la mastitis de rumiantes Antoni Prenafeta

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Antoni Prenafeta

6. Perspectivas del biofilm en la mastitis

disminución de los signos clínicos y reducción del tratamiento con antibióticos en los animales infectados). Adicionalmente, la vacunación con STARTVAC incrementó la tasa de curación espontánea en las vacas infectadas. En este sentido, STARTVAC es la primera vacuna registrada en todo el mundo que confiere protección frente a la mastitis causada por estafilococos coagulasa negativos. Los anticuerpos frente al exopolisacárido PNAG del SAAC, inducidos por la inmunización con STARTVAC, podrían ser uno de los factores responsables de conferir protección cruzada frente a infecciones de SCN.

La capacidad de formar biofilm es un importante factor de virulencia de S. aureus implicado en las mastitis ovinas y bovinas. A pesar que otros factores de virulencia pueden estar involucrados en la patogénesis de la mastitis, los anticuerpos específicos frente PNAG o SAAC pueden impedir el establecimiento de la infección de S. aureus en la glándula mamaria, uniéndose a la matriz extracelular de exopolisacárido (antes que se constituya el biofilm) y facilitando, de este modo, la fagocitosis mediada por neutrófilos polimorfonucleares y la eliminación de la infección. Desde este punto de vista, la vacunación con STARTVAC ofrece una opción para la disminución de las infecciones intramamarias de S. aureus y SCN.

b

a

1,200

0,800

a’

nº Bibliografía

a’

0,400

c

b’ 0,200

c’

0,000

S. aureus

Ac -

Ac +

Control Cultivo

Biofilm

Figura 5. Inhibición de la formación de biofilm de S. aureus en microplaca mediada por anticuerpos anti-SAAC. En el gráfico se representa la DO del crecimiento bacteriano al finalizar la incubación de la microplaca (en azul) y la DO del biofilm después de realizar la tinción de las células adheridas (en azul claro). En este estudio se incubó un cepa de S. aureus productora de biofilm sin presencia de anticuerpos (columnas “S. aureus”), en presencia de suero sin anticuerpos anti-SAAC (columnas “Ac-“) o en presencia de un suero hiperinmune con anticuerpos anti-SAAC (columnas “Ac+”). Las columnas “Control –“ corresponden a los pocillos con medio de cultivo no inoculados. Las columnas con la misma letra no presentan diferencias significativas entre ellas (P < 0,05). Las barras de error indican la desviación estándar de la media.

4

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Aspectos generales del biofilm e implicación en la mastitis de rumiantes Antoni Prenafeta

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1. El biofilm como mecanismo de supervivencia

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l biofilm puede ser definido, en términos generales, como una comunidad microbiana, dinámica y bien estructurada, adherida a una superficie sólida y englobada en una matriz extracelular. La capacidad de formar biofilm es una característica muy extendida entre los organismos procariotas, tanto en el dominio Archea como Bacteria, hallándose en el registro fósil formaciones con una antigüedad de hasta 3.200 millones de años. Desde el punto de vista evolutivo, probablemente la formación de biofilm confirió una ventaja adaptativa al proporcionar homeostasis frente a las condiciones extremas y fluctuantes de la tierra primitiva (temperaturas, pH y exposición a radiaciones UV). Además de ofrecer protección ante factores ambientales físico-químicos, el biofilm facilita las funciones catalíticas extracelulares (al mantener las células próximas entre ellas) y favorece la concentración de nutrientes en la superficie (Hall-Stoodley et al., 2004). La resistencia del biofilm a los agentes antimicrobianos (por ejemplo los antibióticos) puede ser debida a la dificultad en la penetración del agente antimicrobiano a través de la matriz extracelular, a la disminución de la tasa de multiplicación de las células del biofilm (los antibióticos β-lactámicos son efectivos en las células Gram-positivas que se dividen activamente) o a la existencia de fenotipos resistentes entre una población hetereogénea genéticamente.

2. El biofilm en ambientes naturales y su implicación en las infecciones La formación de biofilm en ambientes naturales es ubicua, encontrándose este tipo de estructuras biológicas en el fondo de ríos o en la superficie de aguas estancadas; en ambientes extremos, desde emanaciones de aguas termales hasta glaciares de la Antártida; en duchas o baños, favorecido por el ambiente húmedo y cálido; en el interior de conductos de distribución de agua potable o tuberías de gas y aceite industrial; en simbiosis con plantas, etc. Por otro lado, la formación de biofilm está implicada en la patogénesis de muchas infecciones humanas. La adhesión de Staphylococcus o Streptococcus a las proteínas de la membrana basal del epitelio cardíaco dañado es una causa de endocarditis. En el caso de pacientes de fibrosis quística, la disminución de la actividad ciliar de la mucosa respiratoria y la hiperviscosidad de la secreción mucosa favorecen la colonización y la formación de biofilm de Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae y Pseudomonas aeruginosa. Otro ejemplo bien conocido de biofilm es la placa subgingival de Streptococcus mutans. La formación de biofilm también se ha descrito en cepas de Escherichia coli uropatógenas. Finalmente, el biofilm es un im-

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portante factor de virulencia implicado en el desarrollo de infecciones relacionadas con el implante de catéteres intravenosos, válvulas cardíacas, prótesis, catéteres peritoneales de diálisis, tubos endotraqueales… causadas principalmente por la adhesión de S. aureus y Staphylococcus epidermidis a la superficie de estos implantes (Hall-Stoodley et al., 2004). La contribución del biofilm a la patogénesis se atribuye a su resistencia a los antibióticos y a la fagocitosis, facilitando de este modo la cronificación de las infecciones. El desprendimiento de células bacterianas del biofilm es causa de septicemia y nuevas colonizaciones, mientras que la producción de endotoxinas y exotoxinas producen inflamación y lesiones tisulares. Uno de las dificultades para eliminar las infecciones relacionadas con la producción de biofilm es la resistencia a los antibióticos. En la Tabla 1 se puede apreciar que la muerte bacteriana dentro del biofilm requiere una mayor cantidad de antibiótico que la concentración con actividad bactericida en las células bacterianas planctónicas (libres o en suspensión).

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Aspectos generales del Biofilm e implicación en la mastitis de rumiantes Antoni Prenafeta





Biblioteca Startvac®

| [email protected] | I+D., HIPRA. Avda. La Selva, 135. Amer (Girona)

Tabla 1. Sensibilidad a los antibióticos de distintos géneros bacterianos creciendo en forma planctónica (libre o en suspensión) o en biofilm (según Donlan and Costerton, 2002). MIC o MBC del Concentración efectiva Microorganismo Antibiótico crecimiento contra el crecimiento planctónico (g/ml) en biofilm (g/ml) S. aureus Vancomicina 2 (MBC) 20 NCTC 8325-4 Pseudomonas aeruginosa ATCC Imipenem 1 (MIC) 1024 27853 E. coli Ampicilina 2 (MIC 512 ATCC 25922 P. pseudomallei Ceftazidima 8 (MBC) 800 Streptococcus Doxiciclina 0,063 (MIC) 3,15 sanguls 804

nº

MIC: concentración mínima inhibitoria. MBC: concentración mínima bactericida.

3. Desarrollo del biofilm de S. aureus

La formación de biofilm de S. aureus es un proceso bien caracterizado que ocurre en dos pasos. En primer lugar las células bacterianas se adhieren a una superficie de manera específica o mediante interacciones físico-químicas. En la adhesión específica están involucradas proteínas de S. aureus que se unen a factores de la matriz extracelular del huésped, tales como las proteínas de unión a la fibronectina (FnBPA, FnBPB) (O’Neill et al., 2008), proteínas de unión al fibrinógeno (ClfA, ClfB) (McDevitt et al., 1994), proteína de unión al colágeno (Can) (Patti et al., 1992) o la proteína de unión a la sialoproteína del hueso (Bbp) (Tung et al., 2000). En un segundo paso, las células bacterianas adheridas se multiplican, interaccionan entre ellas y se acumulan en capas, quedando envueltas por una matriz extracelular secretada por la propia célula bacteriana (Figura 1). El principal constituyente de la matriz extracelular y responsable de la interacción intercelular de S. aureus y S. epidermidis es el exopolisacárido poli-N-acetil β-1,6glucosamina (PNAG), sintetizado por los enzimas codificados en el operón icaADBC (Cramton et al., 1999). Asimismo, se han descrito algunas proteínas de S. aureus que también pueden estar implicadas en la interacción intercelular y en la formación de biofilm: Bap (Cucarella et al., 2001), proteína A (Merino et al., 2009), SasC (Schroeder et al., 2009) y SasG (Corrigan et al., 2007).

Figura 1. Micrografía mediante microscopio electrónico de rastreo de un biofilm de S. aureus creciendo in vitro (www.erc.montana.edu).

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4. Implicación del biofilm en las mastitis de rumiantes causadas por S. aureus En las mastitis bovinas y ovinas causadas por estafilococos, las células bacterianas se adhieren a las células epiteliales de la glándula mamaria y crecen formando colonias envueltas en una matriz extracelular, constituyendo el biofilm. Debido a su tamaño, el biofilm no es susceptible de ser fagocitado por los neutrófilos polimorfonucleares o macrófagos y, por otro lado, confiere resistencia a los antibióticos, promoviendo de este modo la cronificación de la infección. Distintos estudios demuestran la presencia del operón icaADBC, que codifica los enzimas responsables de la biosíntesis del exopolisacárido PNAG, principal componente de la matriz extracelular del biofilm, en un 94,36 % (Cucarella et al., 2004) o un 100 % (Vasudevan et al., 2003) de los S. aureus aislados de mastitis bovina. Aparte de esta capacidad genética, en diversos trabajos se ha demostrado también la capacidad de cepas aisladas de mastitis bovina para formar biofilm in vitro. En este sentido, Vasudevan et al. (2003) determinaron que un 91 % de los aislados de S. aureus de mastitis bovina tenían la capacidad de formar biofilm in vitro mediante la determinación de la morfología colonial en placas de agar con Rojo Congo (Figura 2), mientras que un 69 % mostraban adherencia en microplaca (Figura 3). En otro estudio, Oliveira et al. (2007) caracterizaron como productores de biofilm in vitro a un 80,8 % de los aislados de S. aureus y un 75,9 % de los aislados de S. epidermidis de mastitis bovina. Dhanawade et al. (2010) determinaron que el 48,03 % de las cepas de S. aureus aisladas de mastitis bovina tenían la capacidad de formar biofilm in vitro según la prueba de cultivo en placas de agar con Rojo Congo. Si bien parece clara la capacidad genética y la producción in vitro de biofilm en los aislados de S. aureus de mastitis bovina, ¿existe alguna evidencia de la producción de biofilm de S. aureus en la glándula mamaria? Watson et al. (1989) observaron, mediante microscopía electrónica, la producción de una matriz extracelular

5.Vacunas frente al biofilm de S. aureus para combatir la mastitis en rumiantes

Figura 3. Análisis de la producción de biofilm en microplaca (test de adherencia). Después de un período de incubación del aislado de S. aureus en los pocillos de la microplaca, la placa se vacía, se lavan los pocillos, se fijan las células que se hayan adherido, se tiñen y se determina la densidad óptica (DO) de los pocillos mediante un lector de placas de ELISA. Si el aislado formó biofilm durante el crecimiento, la DO de los pocillos es elevada (filas A, B y C), mientras que la DO no es significativa si el aislado no produjo biofilm (filas D, E y F), en comparación con los pocillos control negativo no inoculados (filas G y H).

de polisacárido (denominada pseudocápsula por los autores) en células de S. aureus aisladas directamente de la leche de ovejas y vacas con mastitis clínica. Poco más tarde, Baselga y colaboradores (1993) demostraron la producción de una matriz de exopolisacárido, en células de S. aureus, mediante análisis inmunohistoquímico de muestras de tejido parenquimal de la glándula mamaria de ovejas infectadas experimentalmente con S. aureus por vía intramamaria. La expresión de exopolisacárido in vivo también se ha demostrado indirectamente al observar la producción de anticuerpos específicos frente a PNAG (Pérez et al., 2009) y frente a SAAC (Slime Associated Antigenic Complex; Prenafeta et al., 2009) en ovejas y vacas respectivamente infectadas experimentalmente con S. aureus por vía intramamaria.

Teniendo en cuenta que la formación de biofilm es un importante factor de virulencia de S. aureus en la patogénesis de la mastitis en ovejas y vacas, se ha ensayado la eficacia de distintas vacunas experimentales, observándose distintos grados de protección. Watson et al. (1993) y Nordhaug et al. (1994) utilizaron vacunas basadas en células enteras e inactivadas de S. aureus envueltas en su propia matriz extracelular denominada por ellos como pseudocápsula. Las vacunas experimentales en el estudio de Amorena et al. (1994) consistían en una mezcla de slime (matriz de exopolisacárido del biofilm) en liposomas, toxoide y distintos aislados de S. aureus inactivados. Más recientemente, sabiendo que el exopolisacárido PNAG es el principal componente de la matriz extracelular del biofilm de S. aureus, Pérez et al. (2009) realizaron una prueba de inmunización e infección experimental intramamaria con una cepa virulenta de S. aureus en ovejas, usando como vacunas bacterinas (células bacterianas enteras e inactivadas), extracto crudo, PNAG purificado y distintos adyuvantes. Los resultados de este estudio pusieron de manifiesto que las bacterinas de aislados altamente productores de biofilm indujeron los títulos más altos de anticuerpos específicos frente a PNAG y confirieron una mayor protección frente a la infección experimental intramamaria, en comparación con las vacunas que contenían bacterinas de cepas poco productoras de biofilm, extracto crudo o PNAG purificado. En el estudio realizado por Prenafeta et al. (2009) se pone de manifiesto el papel de los anticuerpos específicos anti-SAAC en la protección frente a la mastitis causada por S. aureus en una infección experimental en vacas. SAAC es una fracción celular aislada de cepas de S. aureus productoras de biofilm. La presencia de este componente extracelular se ha determinado en todos los aislados de

S. aureus caracterizados como productores de slime en placas de agar con Rojo Congo (Figura 4) y su producción está directamente relacionada con la formación de biofilm in vitro (Tabla 2). La caracterización química del SAAC reveló que está compuesto por un 58 % (p/v) de polisacárido y un 42 % (p/v) de proteína. Entre la fracción polisacarídica, se halló un contenido del 6,1 % de glucosamina y galactosamina, pudiendo corresponder estos azúcares a formas deacetiladas del PNAG. Cabe destacar, que los anticuerpos frente a las formas deacetiladas del PNAG son los que presentan una mayor capacidad de opsonización (unión específica de los anticuerpos al antígeno) y protección frente a las infecciones de S. aureus (Cerca et al., 2007). Tabla 2. Determinación del fenotipo productor de “slime” (+/-), capacidad de formación de biofilm en microplaca (DO del biofilm en el ensayo) y producción de SAAC (mg SAAC / mg proteína total) en aislados de S. aureus. La correlación entre la producción de SAAC y la capacidad de formar biofilm en microplaca es significativa (R = 0,882). Aislado Fenotipo DO en el ensayo S. aureus productor de slime de biofilm (DE1) SA1H + 1,444 (0,04) SA2H + 1,597 (0,02) SA3H + 0,385 (0,03) SA4H + 1,499 (0,04) SA5H + 1,521 (0,03) SA6H 0,088 (0,01) SA7H + 1,030 (0,02) SA8H 0,388 (0,06) SA9H 0,200 (0,02) SA10H 0,145 (0,01) SA11H 0,130 (0,01) SA12H 0,235 (0,01) SA13H + 0,632 (0,02) 1

DE : desviación estándar de la media.

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Nd. : no detectado.

Producción de SAAC (DE1) 54,0 (0,012) 63,3 (0,015) 20,8 (0,011) 60,5 (0,012) 27,6 (0,015) 2,2 (0,011) 26,5 (0,012) Nd2 Nd2 0,1 (0,010) Nd2 Nd2 6,9 (0,013)

El principal mecanismo de defensa de la glándula mamaria frente a las infecciones es la opsonización mediada por anticuerpos y la consiguiente fagocitosis por los neutrófilos polimorfonucleares. No obstante, no se puede descartar que los anticuerpos específicos frente al biofilm actúen además de una manera directa en la protección, uniéndose a las células bacterianas e impidiendo la adherencia al epitelio y la interacción intercelular que lleva a la formación del biofilm. En este sentido, en un estudio in Vitro, se ha demostrado que los anticuerpos anti-SAAC son capaces de inhibir la formación de biofilm sin la presencia de neutrófilos (en la Figura 5 se muestran los resultados de un estudio realizado por el autor). Una de las ventajas que ofrece el uso de PNAG o el componente SAAC como antígenos vacunales, a diferencia de los antígenos capsulares, es que no se han descrito serotipos entre aislados de S. aureus. Por lo tanto, los anticuerpos inducidos por la vacunación con estos antígenos confiere protección cruzada independientemente del tipo capsular de S. aureus. STARTVAC (HIPRA) es la primera vacuna frente a la mastitis bovina registrada en toda la Unión Europea vía EMEA (Agencia Europea del Medicamento). Esta vacuna consta de células inactivadas de una cepa de S. aureus altamente productora de biofilm y con un alto

Figura 2. Determinación de la capacidad de formar biofilm mediante la caracterización de la morfología colonial en placas de agar con Rojo Congo. Los aislados slime positivos o productores de biofilm forman colonias rugosas y de contorno irregular en placas de Rojo Congo (A), mientras que los aislados slime negativos o no productores de biofilm forman colonias brillantes, lisas y de contorno bien definido (B).

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Figura 4. Análisis por inmunoelectroforesis en gel de agarosa de extractos bacterianos de una cepa de S. aureus productora de biofilm (A: pocillos 1 y 3) y una cepa no productora (B: pocillos 4 y 6), usando un suero policlonal contra la bacteria entera (líneas 2 y 5). La flecha muestra la línea de inmunoprecipitación correspondiente al antígeno SAAC, presente únicamente en cepas caracterizadas como productoras de exopolisacárido en placas de agar con Rojo Congo.

contenido de SAAC asociado. Asimismo, la vacuna contiene la cepa E. coli J5 inactivada y un adyuvante apropiado para potenciar la respuesta inmunológica. Tanto en las pruebas preclínicas como en las pruebas clínicas realizadas durante el desarrollo de la vacuna, la inmunización con STARTVAC indujo títulos elevados y duraderos de anticuerpos anti-SAAC en sangre y en leche. En las pruebas clínicas realizadas con STARTVAC en 6 granjas (198 vacas vacunadas con STARTVAC y 188 vacas control no vacunadas) se demostró que la vacunación redujo significativamente la incidencia de mastitis clínica y subclínica y la severidad de los síntomas clínicos de mastitis causados por S. aureus, coliformes o estafilococos coagulasa negativos (SCN) (reducción en el recuento de células somáticas,

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Aspectos generales del Biofilm e implicación en la mastitis de rumiantes Antoni Prenafeta





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Tabla 1. Sensibilidad a los antibióticos de distintos géneros bacterianos creciendo en forma planctónica (libre o en suspensión) o en biofilm (según Donlan and Costerton, 2002). MIC o MBC del Concentración efectiva Microorganismo Antibiótico crecimiento contra el crecimiento planctónico (g/ml) en biofilm (g/ml) S. aureus Vancomicina 2 (MBC) 20 NCTC 8325-4 Pseudomonas aeruginosa ATCC Imipenem 1 (MIC) 1024 27853 E. coli Ampicilina 2 (MIC 512 ATCC 25922 P. pseudomallei Ceftazidima 8 (MBC) 800 Streptococcus Doxiciclina 0,063 (MIC) 3,15 sanguls 804

nº

MIC: concentración mínima inhibitoria. MBC: concentración mínima bactericida.

3. Desarrollo del biofilm de S. aureus

La formación de biofilm de S. aureus es un proceso bien caracterizado que ocurre en dos pasos. En primer lugar las células bacterianas se adhieren a una superficie de manera específica o mediante interacciones físico-químicas. En la adhesión específica están involucradas proteínas de S. aureus que se unen a factores de la matriz extracelular del huésped, tales como las proteínas de unión a la fibronectina (FnBPA, FnBPB) (O’Neill et al., 2008), proteínas de unión al fibrinógeno (ClfA, ClfB) (McDevitt et al., 1994), proteína de unión al colágeno (Can) (Patti et al., 1992) o la proteína de unión a la sialoproteína del hueso (Bbp) (Tung et al., 2000). En un segundo paso, las células bacterianas adheridas se multiplican, interaccionan entre ellas y se acumulan en capas, quedando envueltas por una matriz extracelular secretada por la propia célula bacteriana (Figura 1). El principal constituyente de la matriz extracelular y responsable de la interacción intercelular de S. aureus y S. epidermidis es el exopolisacárido poli-N-acetil β-1,6glucosamina (PNAG), sintetizado por los enzimas codificados en el operón icaADBC (Cramton et al., 1999). Asimismo, se han descrito algunas proteínas de S. aureus que también pueden estar implicadas en la interacción intercelular y en la formación de biofilm: Bap (Cucarella et al., 2001), proteína A (Merino et al., 2009), SasC (Schroeder et al., 2009) y SasG (Corrigan et al., 2007).

Figura 1. Micrografía mediante microscopio electrónico de rastreo de un biofilm de S. aureus creciendo in vitro (www.erc.montana.edu).

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4. Implicación del biofilm en las mastitis de rumiantes causadas por S. aureus En las mastitis bovinas y ovinas causadas por estafilococos, las células bacterianas se adhieren a las células epiteliales de la glándula mamaria y crecen formando colonias envueltas en una matriz extracelular, constituyendo el biofilm. Debido a su tamaño, el biofilm no es susceptible de ser fagocitado por los neutrófilos polimorfonucleares o macrófagos y, por otro lado, confiere resistencia a los antibióticos, promoviendo de este modo la cronificación de la infección. Distintos estudios demuestran la presencia del operón icaADBC, que codifica los enzimas responsables de la biosíntesis del exopolisacárido PNAG, principal componente de la matriz extracelular del biofilm, en un 94,36 % (Cucarella et al., 2004) o un 100 % (Vasudevan et al., 2003) de los S. aureus aislados de mastitis bovina. Aparte de esta capacidad genética, en diversos trabajos se ha demostrado también la capacidad de cepas aisladas de mastitis bovina para formar biofilm in vitro. En este sentido, Vasudevan et al. (2003) determinaron que un 91 % de los aislados de S. aureus de mastitis bovina tenían la capacidad de formar biofilm in vitro mediante la determinación de la morfología colonial en placas de agar con Rojo Congo (Figura 2), mientras que un 69 % mostraban adherencia en microplaca (Figura 3). En otro estudio, Oliveira et al. (2007) caracterizaron como productores de biofilm in vitro a un 80,8 % de los aislados de S. aureus y un 75,9 % de los aislados de S. epidermidis de mastitis bovina. Dhanawade et al. (2010) determinaron que el 48,03 % de las cepas de S. aureus aisladas de mastitis bovina tenían la capacidad de formar biofilm in vitro según la prueba de cultivo en placas de agar con Rojo Congo. Si bien parece clara la capacidad genética y la producción in vitro de biofilm en los aislados de S. aureus de mastitis bovina, ¿existe alguna evidencia de la producción de biofilm de S. aureus en la glándula mamaria? Watson et al. (1989) observaron, mediante microscopía electrónica, la producción de una matriz extracelular

5.Vacunas frente al biofilm de S. aureus para combatir la mastitis en rumiantes

Figura 3. Análisis de la producción de biofilm en microplaca (test de adherencia). Después de un período de incubación del aislado de S. aureus en los pocillos de la microplaca, la placa se vacía, se lavan los pocillos, se fijan las células que se hayan adherido, se tiñen y se determina la densidad óptica (DO) de los pocillos mediante un lector de placas de ELISA. Si el aislado formó biofilm durante el crecimiento, la DO de los pocillos es elevada (filas A, B y C), mientras que la DO no es significativa si el aislado no produjo biofilm (filas D, E y F), en comparación con los pocillos control negativo no inoculados (filas G y H).

de polisacárido (denominada pseudocápsula por los autores) en células de S. aureus aisladas directamente de la leche de ovejas y vacas con mastitis clínica. Poco más tarde, Baselga y colaboradores (1993) demostraron la producción de una matriz de exopolisacárido, en células de S. aureus, mediante análisis inmunohistoquímico de muestras de tejido parenquimal de la glándula mamaria de ovejas infectadas experimentalmente con S. aureus por vía intramamaria. La expresión de exopolisacárido in vivo también se ha demostrado indirectamente al observar la producción de anticuerpos específicos frente a PNAG (Pérez et al., 2009) y frente a SAAC (Slime Associated Antigenic Complex; Prenafeta et al., 2009) en ovejas y vacas respectivamente infectadas experimentalmente con S. aureus por vía intramamaria.

Teniendo en cuenta que la formación de biofilm es un importante factor de virulencia de S. aureus en la patogénesis de la mastitis en ovejas y vacas, se ha ensayado la eficacia de distintas vacunas experimentales, observándose distintos grados de protección. Watson et al. (1993) y Nordhaug et al. (1994) utilizaron vacunas basadas en células enteras e inactivadas de S. aureus envueltas en su propia matriz extracelular denominada por ellos como pseudocápsula. Las vacunas experimentales en el estudio de Amorena et al. (1994) consistían en una mezcla de slime (matriz de exopolisacárido del biofilm) en liposomas, toxoide y distintos aislados de S. aureus inactivados. Más recientemente, sabiendo que el exopolisacárido PNAG es el principal componente de la matriz extracelular del biofilm de S. aureus, Pérez et al. (2009) realizaron una prueba de inmunización e infección experimental intramamaria con una cepa virulenta de S. aureus en ovejas, usando como vacunas bacterinas (células bacterianas enteras e inactivadas), extracto crudo, PNAG purificado y distintos adyuvantes. Los resultados de este estudio pusieron de manifiesto que las bacterinas de aislados altamente productores de biofilm indujeron los títulos más altos de anticuerpos específicos frente a PNAG y confirieron una mayor protección frente a la infección experimental intramamaria, en comparación con las vacunas que contenían bacterinas de cepas poco productoras de biofilm, extracto crudo o PNAG purificado. En el estudio realizado por Prenafeta et al. (2009) se pone de manifiesto el papel de los anticuerpos específicos anti-SAAC en la protección frente a la mastitis causada por S. aureus en una infección experimental en vacas. SAAC es una fracción celular aislada de cepas de S. aureus productoras de biofilm. La presencia de este componente extracelular se ha determinado en todos los aislados de

S. aureus caracterizados como productores de slime en placas de agar con Rojo Congo (Figura 4) y su producción está directamente relacionada con la formación de biofilm in vitro (Tabla 2). La caracterización química del SAAC reveló que está compuesto por un 58 % (p/v) de polisacárido y un 42 % (p/v) de proteína. Entre la fracción polisacarídica, se halló un contenido del 6,1 % de glucosamina y galactosamina, pudiendo corresponder estos azúcares a formas deacetiladas del PNAG. Cabe destacar, que los anticuerpos frente a las formas deacetiladas del PNAG son los que presentan una mayor capacidad de opsonización (unión específica de los anticuerpos al antígeno) y protección frente a las infecciones de S. aureus (Cerca et al., 2007). Tabla 2. Determinación del fenotipo productor de “slime” (+/-), capacidad de formación de biofilm en microplaca (DO del biofilm en el ensayo) y producción de SAAC (mg SAAC / mg proteína total) en aislados de S. aureus. La correlación entre la producción de SAAC y la capacidad de formar biofilm en microplaca es significativa (R = 0,882). Aislado Fenotipo DO en el ensayo S. aureus productor de slime de biofilm (DE1) SA1H + 1,444 (0,04) SA2H + 1,597 (0,02) SA3H + 0,385 (0,03) SA4H + 1,499 (0,04) SA5H + 1,521 (0,03) SA6H 0,088 (0,01) SA7H + 1,030 (0,02) SA8H 0,388 (0,06) SA9H 0,200 (0,02) SA10H 0,145 (0,01) SA11H 0,130 (0,01) SA12H 0,235 (0,01) SA13H + 0,632 (0,02) 1

DE : desviación estándar de la media.

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Nd. : no detectado.

Producción de SAAC (DE1) 54,0 (0,012) 63,3 (0,015) 20,8 (0,011) 60,5 (0,012) 27,6 (0,015) 2,2 (0,011) 26,5 (0,012) Nd2 Nd2 0,1 (0,010) Nd2 Nd2 6,9 (0,013)

El principal mecanismo de defensa de la glándula mamaria frente a las infecciones es la opsonización mediada por anticuerpos y la consiguiente fagocitosis por los neutrófilos polimorfonucleares. No obstante, no se puede descartar que los anticuerpos específicos frente al biofilm actúen además de una manera directa en la protección, uniéndose a las células bacterianas e impidiendo la adherencia al epitelio y la interacción intercelular que lleva a la formación del biofilm. En este sentido, en un estudio in Vitro, se ha demostrado que los anticuerpos anti-SAAC son capaces de inhibir la formación de biofilm sin la presencia de neutrófilos (en la Figura 5 se muestran los resultados de un estudio realizado por el autor). Una de las ventajas que ofrece el uso de PNAG o el componente SAAC como antígenos vacunales, a diferencia de los antígenos capsulares, es que no se han descrito serotipos entre aislados de S. aureus. Por lo tanto, los anticuerpos inducidos por la vacunación con estos antígenos confiere protección cruzada independientemente del tipo capsular de S. aureus. STARTVAC (HIPRA) es la primera vacuna frente a la mastitis bovina registrada en toda la Unión Europea vía EMEA (Agencia Europea del Medicamento). Esta vacuna consta de células inactivadas de una cepa de S. aureus altamente productora de biofilm y con un alto

Figura 2. Determinación de la capacidad de formar biofilm mediante la caracterización de la morfología colonial en placas de agar con Rojo Congo. Los aislados slime positivos o productores de biofilm forman colonias rugosas y de contorno irregular en placas de Rojo Congo (A), mientras que los aislados slime negativos o no productores de biofilm forman colonias brillantes, lisas y de contorno bien definido (B).

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Figura 4. Análisis por inmunoelectroforesis en gel de agarosa de extractos bacterianos de una cepa de S. aureus productora de biofilm (A: pocillos 1 y 3) y una cepa no productora (B: pocillos 4 y 6), usando un suero policlonal contra la bacteria entera (líneas 2 y 5). La flecha muestra la línea de inmunoprecipitación correspondiente al antígeno SAAC, presente únicamente en cepas caracterizadas como productoras de exopolisacárido en placas de agar con Rojo Congo.

contenido de SAAC asociado. Asimismo, la vacuna contiene la cepa E. coli J5 inactivada y un adyuvante apropiado para potenciar la respuesta inmunológica. Tanto en las pruebas preclínicas como en las pruebas clínicas realizadas durante el desarrollo de la vacuna, la inmunización con STARTVAC indujo títulos elevados y duraderos de anticuerpos anti-SAAC en sangre y en leche. En las pruebas clínicas realizadas con STARTVAC en 6 granjas (198 vacas vacunadas con STARTVAC y 188 vacas control no vacunadas) se demostró que la vacunación redujo significativamente la incidencia de mastitis clínica y subclínica y la severidad de los síntomas clínicos de mastitis causados por S. aureus, coliformes o estafilococos coagulasa negativos (SCN) (reducción en el recuento de células somáticas,

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Aspectos generales del Biofilm e implicación en la mastitis de rumiantes Antoni Prenafeta





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Tabla 1. Sensibilidad a los antibióticos de distintos géneros bacterianos creciendo en forma planctónica (libre o en suspensión) o en biofilm (según Donlan and Costerton, 2002). MIC o MBC del Concentración efectiva Microorganismo Antibiótico crecimiento contra el crecimiento planctónico (g/ml) en biofilm (g/ml) S. aureus Vancomicina 2 (MBC) 20 NCTC 8325-4 Pseudomonas aeruginosa ATCC Imipenem 1 (MIC) 1024 27853 E. coli Ampicilina 2 (MIC 512 ATCC 25922 P. pseudomallei Ceftazidima 8 (MBC) 800 Streptococcus Doxiciclina 0,063 (MIC) 3,15 sanguls 804

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MIC: concentración mínima inhibitoria. MBC: concentración mínima bactericida.

3. Desarrollo del biofilm de S. aureus

La formación de biofilm de S. aureus es un proceso bien caracterizado que ocurre en dos pasos. En primer lugar las células bacterianas se adhieren a una superficie de manera específica o mediante interacciones físico-químicas. En la adhesión específica están involucradas proteínas de S. aureus que se unen a factores de la matriz extracelular del huésped, tales como las proteínas de unión a la fibronectina (FnBPA, FnBPB) (O’Neill et al., 2008), proteínas de unión al fibrinógeno (ClfA, ClfB) (McDevitt et al., 1994), proteína de unión al colágeno (Can) (Patti et al., 1992) o la proteína de unión a la sialoproteína del hueso (Bbp) (Tung et al., 2000). En un segundo paso, las células bacterianas adheridas se multiplican, interaccionan entre ellas y se acumulan en capas, quedando envueltas por una matriz extracelular secretada por la propia célula bacteriana (Figura 1). El principal constituyente de la matriz extracelular y responsable de la interacción intercelular de S. aureus y S. epidermidis es el exopolisacárido poli-N-acetil β-1,6glucosamina (PNAG), sintetizado por los enzimas codificados en el operón icaADBC (Cramton et al., 1999). Asimismo, se han descrito algunas proteínas de S. aureus que también pueden estar implicadas en la interacción intercelular y en la formación de biofilm: Bap (Cucarella et al., 2001), proteína A (Merino et al., 2009), SasC (Schroeder et al., 2009) y SasG (Corrigan et al., 2007).

Figura 1. Micrografía mediante microscopio electrónico de rastreo de un biofilm de S. aureus creciendo in vitro (www.erc.montana.edu).

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4. Implicación del biofilm en las mastitis de rumiantes causadas por S. aureus En las mastitis bovinas y ovinas causadas por estafilococos, las células bacterianas se adhieren a las células epiteliales de la glándula mamaria y crecen formando colonias envueltas en una matriz extracelular, constituyendo el biofilm. Debido a su tamaño, el biofilm no es susceptible de ser fagocitado por los neutrófilos polimorfonucleares o macrófagos y, por otro lado, confiere resistencia a los antibióticos, promoviendo de este modo la cronificación de la infección. Distintos estudios demuestran la presencia del operón icaADBC, que codifica los enzimas responsables de la biosíntesis del exopolisacárido PNAG, principal componente de la matriz extracelular del biofilm, en un 94,36 % (Cucarella et al., 2004) o un 100 % (Vasudevan et al., 2003) de los S. aureus aislados de mastitis bovina. Aparte de esta capacidad genética, en diversos trabajos se ha demostrado también la capacidad de cepas aisladas de mastitis bovina para formar biofilm in vitro. En este sentido, Vasudevan et al. (2003) determinaron que un 91 % de los aislados de S. aureus de mastitis bovina tenían la capacidad de formar biofilm in vitro mediante la determinación de la morfología colonial en placas de agar con Rojo Congo (Figura 2), mientras que un 69 % mostraban adherencia en microplaca (Figura 3). En otro estudio, Oliveira et al. (2007) caracterizaron como productores de biofilm in vitro a un 80,8 % de los aislados de S. aureus y un 75,9 % de los aislados de S. epidermidis de mastitis bovina. Dhanawade et al. (2010) determinaron que el 48,03 % de las cepas de S. aureus aisladas de mastitis bovina tenían la capacidad de formar biofilm in vitro según la prueba de cultivo en placas de agar con Rojo Congo. Si bien parece clara la capacidad genética y la producción in vitro de biofilm en los aislados de S. aureus de mastitis bovina, ¿existe alguna evidencia de la producción de biofilm de S. aureus en la glándula mamaria? Watson et al. (1989) observaron, mediante microscopía electrónica, la producción de una matriz extracelular

5.Vacunas frente al biofilm de S. aureus para combatir la mastitis en rumiantes

Figura 3. Análisis de la producción de biofilm en microplaca (test de adherencia). Después de un período de incubación del aislado de S. aureus en los pocillos de la microplaca, la placa se vacía, se lavan los pocillos, se fijan las células que se hayan adherido, se tiñen y se determina la densidad óptica (DO) de los pocillos mediante un lector de placas de ELISA. Si el aislado formó biofilm durante el crecimiento, la DO de los pocillos es elevada (filas A, B y C), mientras que la DO no es significativa si el aislado no produjo biofilm (filas D, E y F), en comparación con los pocillos control negativo no inoculados (filas G y H).

de polisacárido (denominada pseudocápsula por los autores) en células de S. aureus aisladas directamente de la leche de ovejas y vacas con mastitis clínica. Poco más tarde, Baselga y colaboradores (1993) demostraron la producción de una matriz de exopolisacárido, en células de S. aureus, mediante análisis inmunohistoquímico de muestras de tejido parenquimal de la glándula mamaria de ovejas infectadas experimentalmente con S. aureus por vía intramamaria. La expresión de exopolisacárido in vivo también se ha demostrado indirectamente al observar la producción de anticuerpos específicos frente a PNAG (Pérez et al., 2009) y frente a SAAC (Slime Associated Antigenic Complex; Prenafeta et al., 2009) en ovejas y vacas respectivamente infectadas experimentalmente con S. aureus por vía intramamaria.

Teniendo en cuenta que la formación de biofilm es un importante factor de virulencia de S. aureus en la patogénesis de la mastitis en ovejas y vacas, se ha ensayado la eficacia de distintas vacunas experimentales, observándose distintos grados de protección. Watson et al. (1993) y Nordhaug et al. (1994) utilizaron vacunas basadas en células enteras e inactivadas de S. aureus envueltas en su propia matriz extracelular denominada por ellos como pseudocápsula. Las vacunas experimentales en el estudio de Amorena et al. (1994) consistían en una mezcla de slime (matriz de exopolisacárido del biofilm) en liposomas, toxoide y distintos aislados de S. aureus inactivados. Más recientemente, sabiendo que el exopolisacárido PNAG es el principal componente de la matriz extracelular del biofilm de S. aureus, Pérez et al. (2009) realizaron una prueba de inmunización e infección experimental intramamaria con una cepa virulenta de S. aureus en ovejas, usando como vacunas bacterinas (células bacterianas enteras e inactivadas), extracto crudo, PNAG purificado y distintos adyuvantes. Los resultados de este estudio pusieron de manifiesto que las bacterinas de aislados altamente productores de biofilm indujeron los títulos más altos de anticuerpos específicos frente a PNAG y confirieron una mayor protección frente a la infección experimental intramamaria, en comparación con las vacunas que contenían bacterinas de cepas poco productoras de biofilm, extracto crudo o PNAG purificado. En el estudio realizado por Prenafeta et al. (2009) se pone de manifiesto el papel de los anticuerpos específicos anti-SAAC en la protección frente a la mastitis causada por S. aureus en una infección experimental en vacas. SAAC es una fracción celular aislada de cepas de S. aureus productoras de biofilm. La presencia de este componente extracelular se ha determinado en todos los aislados de

S. aureus caracterizados como productores de slime en placas de agar con Rojo Congo (Figura 4) y su producción está directamente relacionada con la formación de biofilm in vitro (Tabla 2). La caracterización química del SAAC reveló que está compuesto por un 58 % (p/v) de polisacárido y un 42 % (p/v) de proteína. Entre la fracción polisacarídica, se halló un contenido del 6,1 % de glucosamina y galactosamina, pudiendo corresponder estos azúcares a formas deacetiladas del PNAG. Cabe destacar, que los anticuerpos frente a las formas deacetiladas del PNAG son los que presentan una mayor capacidad de opsonización (unión específica de los anticuerpos al antígeno) y protección frente a las infecciones de S. aureus (Cerca et al., 2007). Tabla 2. Determinación del fenotipo productor de “slime” (+/-), capacidad de formación de biofilm en microplaca (DO del biofilm en el ensayo) y producción de SAAC (mg SAAC / mg proteína total) en aislados de S. aureus. La correlación entre la producción de SAAC y la capacidad de formar biofilm en microplaca es significativa (R = 0,882). Aislado Fenotipo DO en el ensayo S. aureus productor de slime de biofilm (DE1) SA1H + 1,444 (0,04) SA2H + 1,597 (0,02) SA3H + 0,385 (0,03) SA4H + 1,499 (0,04) SA5H + 1,521 (0,03) SA6H 0,088 (0,01) SA7H + 1,030 (0,02) SA8H 0,388 (0,06) SA9H 0,200 (0,02) SA10H 0,145 (0,01) SA11H 0,130 (0,01) SA12H 0,235 (0,01) SA13H + 0,632 (0,02) 1

DE : desviación estándar de la media.

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Nd. : no detectado.

Producción de SAAC (DE1) 54,0 (0,012) 63,3 (0,015) 20,8 (0,011) 60,5 (0,012) 27,6 (0,015) 2,2 (0,011) 26,5 (0,012) Nd2 Nd2 0,1 (0,010) Nd2 Nd2 6,9 (0,013)

El principal mecanismo de defensa de la glándula mamaria frente a las infecciones es la opsonización mediada por anticuerpos y la consiguiente fagocitosis por los neutrófilos polimorfonucleares. No obstante, no se puede descartar que los anticuerpos específicos frente al biofilm actúen además de una manera directa en la protección, uniéndose a las células bacterianas e impidiendo la adherencia al epitelio y la interacción intercelular que lleva a la formación del biofilm. En este sentido, en un estudio in Vitro, se ha demostrado que los anticuerpos anti-SAAC son capaces de inhibir la formación de biofilm sin la presencia de neutrófilos (en la Figura 5 se muestran los resultados de un estudio realizado por el autor). Una de las ventajas que ofrece el uso de PNAG o el componente SAAC como antígenos vacunales, a diferencia de los antígenos capsulares, es que no se han descrito serotipos entre aislados de S. aureus. Por lo tanto, los anticuerpos inducidos por la vacunación con estos antígenos confiere protección cruzada independientemente del tipo capsular de S. aureus. STARTVAC (HIPRA) es la primera vacuna frente a la mastitis bovina registrada en toda la Unión Europea vía EMEA (Agencia Europea del Medicamento). Esta vacuna consta de células inactivadas de una cepa de S. aureus altamente productora de biofilm y con un alto

Figura 2. Determinación de la capacidad de formar biofilm mediante la caracterización de la morfología colonial en placas de agar con Rojo Congo. Los aislados slime positivos o productores de biofilm forman colonias rugosas y de contorno irregular en placas de Rojo Congo (A), mientras que los aislados slime negativos o no productores de biofilm forman colonias brillantes, lisas y de contorno bien definido (B).

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Figura 4. Análisis por inmunoelectroforesis en gel de agarosa de extractos bacterianos de una cepa de S. aureus productora de biofilm (A: pocillos 1 y 3) y una cepa no productora (B: pocillos 4 y 6), usando un suero policlonal contra la bacteria entera (líneas 2 y 5). La flecha muestra la línea de inmunoprecipitación correspondiente al antígeno SAAC, presente únicamente en cepas caracterizadas como productoras de exopolisacárido en placas de agar con Rojo Congo.

contenido de SAAC asociado. Asimismo, la vacuna contiene la cepa E. coli J5 inactivada y un adyuvante apropiado para potenciar la respuesta inmunológica. Tanto en las pruebas preclínicas como en las pruebas clínicas realizadas durante el desarrollo de la vacuna, la inmunización con STARTVAC indujo títulos elevados y duraderos de anticuerpos anti-SAAC en sangre y en leche. En las pruebas clínicas realizadas con STARTVAC en 6 granjas (198 vacas vacunadas con STARTVAC y 188 vacas control no vacunadas) se demostró que la vacunación redujo significativamente la incidencia de mastitis clínica y subclínica y la severidad de los síntomas clínicos de mastitis causados por S. aureus, coliformes o estafilococos coagulasa negativos (SCN) (reducción en el recuento de células somáticas,

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6. Perspectivas del biofilm en la mastitis

disminución de los signos clínicos y reducción del tratamiento con antibióticos en los animales infectados). Adicionalmente, la vacunación con STARTVAC incrementó la tasa de curación espontánea en las vacas infectadas. En este sentido, STARTVAC es la primera vacuna registrada en todo el mundo que confiere protección frente a la mastitis causada por estafilococos coagulasa negativos. Los anticuerpos frente al exopolisacárido PNAG del SAAC, inducidos por la inmunización con STARTVAC, podrían ser uno de los factores responsables de conferir protección cruzada frente a infecciones de SCN.

La capacidad de formar biofilm es un importante factor de virulencia de S. aureus implicado en las mastitis ovinas y bovinas. A pesar que otros factores de virulencia pueden estar involucrados en la patogénesis de la mastitis, los anticuerpos específicos frente PNAG o SAAC pueden impedir el establecimiento de la infección de S. aureus en la glándula mamaria, uniéndose a la matriz extracelular de exopolisacárido (antes que se constituya el biofilm) y facilitando, de este modo, la fagocitosis mediada por neutrófilos polimorfonucleares y la eliminación de la infección. Desde este punto de vista, la vacunación con STARTVAC ofrece una opción para la disminución de las infecciones intramamarias de S. aureus y SCN.

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Figura 5. Inhibición de la formación de biofilm de S. aureus en microplaca mediada por anticuerpos anti-SAAC. En el gráfico se representa la DO del crecimiento bacteriano al finalizar la incubación de la microplaca (en azul) y la DO del biofilm después de realizar la tinción de las células adheridas (en azul claro). En este estudio se incubó un cepa de S. aureus productora de biofilm sin presencia de anticuerpos (columnas “S. aureus”), en presencia de suero sin anticuerpos anti-SAAC (columnas “Ac-“) o en presencia de un suero hiperinmune con anticuerpos anti-SAAC (columnas “Ac+”). Las columnas “Control –“ corresponden a los pocillos con medio de cultivo no inoculados. Las columnas con la misma letra no presentan diferencias significativas entre ellas (P < 0,05). Las barras de error indican la desviación estándar de la media.

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nº 13. Oliveira, M., Nunes, S.F., Carneiro, C., Bexiga, R., Bernardo, F. und Vilela, C.L., 2007. Time course of biofilm formation by Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis mastitis isolates. Vet. Microbiol. 124:187-191.

2. Baselga, R., Albizu, I., De La Cruz, M., Del Cacho, E., Barberan, M. und Amorena, B., 1993. Phase variation of slime production in Staphylococcus aureus: implications in colonization and virulence.

14. O’Neill, E., C. Pozzi, P. Houston, D. Smyth, H. Humphreys, D.A. Robinson, A. Loughman, T. J. Foster und J.P. O’Gara., 2008. A novel Staphylococcus aureus biofilm phenotype mediated by the fibronectin-binding proteins, FnBPA and FnBPB. J. Bacteriol. 190:3835-50.

3. Cerca, N., Jefferson, K.K., Maira-Litrán, T., Pier, D.B., Kelly-Quintos, C., Goldmann, D.A., Azeredo, J. und Pier, G.B., 2007. Molecular basis for preferential protective efficacy of antibodies directed to the poorly acetylated form of staphylococcal poly-N-acetyl-β-(1-6)-glucosamine. Infect. Immun. 75:3406-3413. 4. Corrigan, R.M., Rigby, D., Handley, P. und Foster, T.J., 2007. The role of Staphylococcus aureus surface protein SasG in adherence and biofilm formation. Microbiology. 153:2435-2446.

7. Dhanawade, N.B., Kalorey, D.R., Srinivasan, R., Barbuddhe, S.B. und Kurkure, N.V., 2010. Detection of intercellular adhesion genes and biofilm production in Staphylococcus aureus isolated from bovine subclinical mastitis. Vet. Res. Commun. 34:81-9.

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1. Amorena, B., Baselga, R. und Albizu, I., 1994. Use of liposome-immunopotentiated exopolysaccharide as a component of an ovine mastitis staphylococcal vaccine. Vaccine. 2:243-249.

6. Cucarella, C., Tormo, M.A., Úbeda, C., Trotonda, M.P., Monzón, M., Peris, C., Amorena, B., Lasa, I. und Penadés, J.R., 2004. Role of biofilm-associated protein Bap in the pathogenesis of bovine Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 72:2177-2185.

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5. Cramton, S.E., Gerke, C., Schnell, N.F., Nichols, W.W. und Götz, F., 1999. The intercellular adhesion (ica) locus is present in Staphylococcus aureus and is required for biofilm formation. Infect. Immun. 67:5427-5433.

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Aspectos generales del Biofilm e implicación en la mastitis de rumiantes

8. Donlan, R.M. und Costerton, J.W., 2002. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15:167-193. 9. Hall-Stoodley, L., Costerton, J.W. und Stoodley, P., 2004. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2: 95-108.

15. Patty, J.M., Jonsson, H., Guss, B., Switalski, L.M., Wiberg, K. et al. 1992. Molecular characterization and expression of a gene encoding a Staphylococcus aureus collagen adhesion. J. Biol. Chem. 267:1766-1772. 16. Pérez, M.M., Prenafeta, A., Valle, J., Penadés, J., Rota, C., Solano, C., Marco, J., Grilló, M.J., Lasa, I., Irache, J.M., Maira-Litran, T., Jiménez-Barbero, J., Costa, L., Pier, G.B., de Andrés, D., Amorena, B., 2009. Protection from Staphylococcus aureus mastitis associated with poly-N-acetyl β-1,6 glucosamine specific antibody production using biofilm-embedded bacteria. Vaccine. 27, 2379-2386. 17. Prenafeta, A., March, R., Foix, A., Casals, I. und Costa, LL., 2009. Study of the humoral immunological response after vaccination with a Staphylococcus aureus biofilm-embedded bacterin in dairy cows: possible role of the exopolysaccharide specific antibody production in the protection from Staphylococcus aureus induced mastitis. Vet. Immun. Immunopathol. 134:208-217. 18. Schroeder, K., Jularic, M., Horsburgh, S.M., Hirschhausen, N., Neumann, C., Bertling, A., Schulte, Foster, S., Kehrel, B.E., Peters, G. und Heilmann, C., 2009. Molecular characterization of a novel Staphylococcus aureus surface protein (SasC) involved in cell aggregation and biofilm accumulation. PLoS ONE. 4(10):7567. 19. Tung, H., Guss, B., Hellman, U., Persson, L., Rubin, K. et al., 2000. A bone sialoprotein-binding protein from Staphylococcus aureus: a member of the staphylococcal Sdr family. Biochem J. 345(3):611-619.

10. Merino, N., Toledo-Arana, A., Vergara-Irigaray, M., Valle, J., Solano, C., Calvo, E., López, A.J., Foster, T.J., Penadés, J.R. und Lasa, I. 2009. Protein A-mediated multicellular behaviour in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 191:832-843.

20. Vasudevan, P., Nair, M.K.M., Annamalai, T. and Venkitanarayanan, K.S., 2003. Phenotypic and genotypic characterization of bovine mastitis isolates of Staphylococcus aureus for biofilm formation. Vet. Microbiol. 92:179185.

11. McDevitt, D., Francois, P., Vaudaux, P. und Foster, T.J., 1994. Molecular characterization of the clumping factor (fibrinogen receptor) of Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 11:237-248.

21. Watson, D.L. und Watson, N.A., 1989. Expression of a pseudocapsule by Staphylococcus aureus: influence of cultural conditions and relevance to mastitis. Research in Veterinary Science. 47:152-157.

12. Nordhaug, M.L., Nesse, L.L., Norcross, N.L. und Gudding, R., 1994. A field trial with an experimental vaccine against Staphylococcus aureus mastitis in cattle. 1. Clinical parameters. J. Dairy Sci. 77:1267-1275.

22. Watson, D.L. und Davies, H.I., 1993. Influence of adjuvants on the immune response of sheep to a novel Staphylococcus aureus vaccine. Vet. Microbiol. 34:139-153. Laboratorios Hipra, S.A. Avd. la Selva, 135 17170 Amer (Girona) Spain

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1. El biofilm como mecanismo de supervivencia

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l biofilm puede ser definido, en términos generales, como una comunidad microbiana, dinámica y bien estructurada, adherida a una superficie sólida y englobada en una matriz extracelular. La capacidad de formar biofilm es una característica muy extendida entre los organismos procariotas, tanto en el dominio Archea como Bacteria, hallándose en el registro fósil formaciones con una antigüedad de hasta 3.200 millones de años. Desde el punto de vista evolutivo, probablemente la formación de biofilm confirió una ventaja adaptativa al proporcionar homeostasis frente a las condiciones extremas y fluctuantes de la tierra primitiva (temperaturas, pH y exposición a radiaciones UV). Además de ofrecer protección ante factores ambientales físico-químicos, el biofilm facilita las funciones catalíticas extracelulares (al mantener las células próximas entre ellas) y favorece la concentración de nutrientes en la superficie (Hall-Stoodley et al., 2004). La resistencia del biofilm a los agentes antimicrobianos (por ejemplo los antibióticos) puede ser debida a la dificultad en la penetración del agente antimicrobiano a través de la matriz extracelular, a la disminución de la tasa de multiplicación de las células del biofilm (los antibióticos β-lactámicos son efectivos en las células Gram-positivas que se dividen activamente) o a la existencia de fenotipos resistentes entre una población hetereogénea genéticamente.

2. El biofilm en ambientes naturales y su implicación en las infecciones La formación de biofilm en ambientes naturales es ubicua, encontrándose este tipo de estructuras biológicas en el fondo de ríos o en la superficie de aguas estancadas; en ambientes extremos, desde emanaciones de aguas termales hasta glaciares de la Antártida; en duchas o baños, favorecido por el ambiente húmedo y cálido; en el interior de conductos de distribución de agua potable o tuberías de gas y aceite industrial; en simbiosis con plantas, etc. Por otro lado, la formación de biofilm está implicada en la patogénesis de muchas infecciones humanas. La adhesión de Staphylococcus o Streptococcus a las proteínas de la membrana basal del epitelio cardíaco dañado es una causa de endocarditis. En el caso de pacientes de fibrosis quística, la disminución de la actividad ciliar de la mucosa respiratoria y la hiperviscosidad de la secreción mucosa favorecen la colonización y la formación de biofilm de Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae y Pseudomonas aeruginosa. Otro ejemplo bien conocido de biofilm es la placa subgingival de Streptococcus mutans. La formación de biofilm también se ha descrito en cepas de Escherichia coli uropatógenas. Finalmente, el biofilm es un im-

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portante factor de virulencia implicado en el desarrollo de infecciones relacionadas con el implante de catéteres intravenosos, válvulas cardíacas, prótesis, catéteres peritoneales de diálisis, tubos endotraqueales… causadas principalmente por la adhesión de S. aureus y Staphylococcus epidermidis a la superficie de estos implantes (Hall-Stoodley et al., 2004). La contribución del biofilm a la patogénesis se atribuye a su resistencia a los antibióticos y a la fagocitosis, facilitando de este modo la cronificación de las infecciones. El desprendimiento de células bacterianas del biofilm es causa de septicemia y nuevas colonizaciones, mientras que la producción de endotoxinas y exotoxinas producen inflamación y lesiones tisulares. Uno de las dificultades para eliminar las infecciones relacionadas con la producción de biofilm es la resistencia a los antibióticos. En la Tabla 1 se puede apreciar que la muerte bacteriana dentro del biofilm requiere una mayor cantidad de antibiótico que la concentración con actividad bactericida en las células bacterianas planctónicas (libres o en suspensión).

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6. Perspectivas del biofilm en la mastitis

disminución de los signos clínicos y reducción del tratamiento con antibióticos en los animales infectados). Adicionalmente, la vacunación con STARTVAC incrementó la tasa de curación espontánea en las vacas infectadas. En este sentido, STARTVAC es la primera vacuna registrada en todo el mundo que confiere protección frente a la mastitis causada por estafilococos coagulasa negativos. Los anticuerpos frente al exopolisacárido PNAG del SAAC, inducidos por la inmunización con STARTVAC, podrían ser uno de los factores responsables de conferir protección cruzada frente a infecciones de SCN.

La capacidad de formar biofilm es un importante factor de virulencia de S. aureus implicado en las mastitis ovinas y bovinas. A pesar que otros factores de virulencia pueden estar involucrados en la patogénesis de la mastitis, los anticuerpos específicos frente PNAG o SAAC pueden impedir el establecimiento de la infección de S. aureus en la glándula mamaria, uniéndose a la matriz extracelular de exopolisacárido (antes que se constituya el biofilm) y facilitando, de este modo, la fagocitosis mediada por neutrófilos polimorfonucleares y la eliminación de la infección. Desde este punto de vista, la vacunación con STARTVAC ofrece una opción para la disminución de las infecciones intramamarias de S. aureus y SCN.

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Figura 5. Inhibición de la formación de biofilm de S. aureus en microplaca mediada por anticuerpos anti-SAAC. En el gráfico se representa la DO del crecimiento bacteriano al finalizar la incubación de la microplaca (en azul) y la DO del biofilm después de realizar la tinción de las células adheridas (en azul claro). En este estudio se incubó un cepa de S. aureus productora de biofilm sin presencia de anticuerpos (columnas “S. aureus”), en presencia de suero sin anticuerpos anti-SAAC (columnas “Ac-“) o en presencia de un suero hiperinmune con anticuerpos anti-SAAC (columnas “Ac+”). Las columnas “Control –“ corresponden a los pocillos con medio de cultivo no inoculados. Las columnas con la misma letra no presentan diferencias significativas entre ellas (P < 0,05). Las barras de error indican la desviación estándar de la media.

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nº 13. Oliveira, M., Nunes, S.F., Carneiro, C., Bexiga, R., Bernardo, F. und Vilela, C.L., 2007. Time course of biofilm formation by Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis mastitis isolates. Vet. Microbiol. 124:187-191.

2. Baselga, R., Albizu, I., De La Cruz, M., Del Cacho, E., Barberan, M. und Amorena, B., 1993. Phase variation of slime production in Staphylococcus aureus: implications in colonization and virulence.

14. O’Neill, E., C. Pozzi, P. Houston, D. Smyth, H. Humphreys, D.A. Robinson, A. Loughman, T. J. Foster und J.P. O’Gara., 2008. A novel Staphylococcus aureus biofilm phenotype mediated by the fibronectin-binding proteins, FnBPA and FnBPB. J. Bacteriol. 190:3835-50.

3. Cerca, N., Jefferson, K.K., Maira-Litrán, T., Pier, D.B., Kelly-Quintos, C., Goldmann, D.A., Azeredo, J. und Pier, G.B., 2007. Molecular basis for preferential protective efficacy of antibodies directed to the poorly acetylated form of staphylococcal poly-N-acetyl-β-(1-6)-glucosamine. Infect. Immun. 75:3406-3413. 4. Corrigan, R.M., Rigby, D., Handley, P. und Foster, T.J., 2007. The role of Staphylococcus aureus surface protein SasG in adherence and biofilm formation. Microbiology. 153:2435-2446.

7. Dhanawade, N.B., Kalorey, D.R., Srinivasan, R., Barbuddhe, S.B. und Kurkure, N.V., 2010. Detection of intercellular adhesion genes and biofilm production in Staphylococcus aureus isolated from bovine subclinical mastitis. Vet. Res. Commun. 34:81-9.

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1. Amorena, B., Baselga, R. und Albizu, I., 1994. Use of liposome-immunopotentiated exopolysaccharide as a component of an ovine mastitis staphylococcal vaccine. Vaccine. 2:243-249.

6. Cucarella, C., Tormo, M.A., Úbeda, C., Trotonda, M.P., Monzón, M., Peris, C., Amorena, B., Lasa, I. und Penadés, J.R., 2004. Role of biofilm-associated protein Bap in the pathogenesis of bovine Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 72:2177-2185.

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5. Cramton, S.E., Gerke, C., Schnell, N.F., Nichols, W.W. und Götz, F., 1999. The intercellular adhesion (ica) locus is present in Staphylococcus aureus and is required for biofilm formation. Infect. Immun. 67:5427-5433.

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Aspectos generales del Biofilm e implicación en la mastitis de rumiantes

8. Donlan, R.M. und Costerton, J.W., 2002. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15:167-193. 9. Hall-Stoodley, L., Costerton, J.W. und Stoodley, P., 2004. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2: 95-108.

15. Patty, J.M., Jonsson, H., Guss, B., Switalski, L.M., Wiberg, K. et al. 1992. Molecular characterization and expression of a gene encoding a Staphylococcus aureus collagen adhesion. J. Biol. Chem. 267:1766-1772. 16. Pérez, M.M., Prenafeta, A., Valle, J., Penadés, J., Rota, C., Solano, C., Marco, J., Grilló, M.J., Lasa, I., Irache, J.M., Maira-Litran, T., Jiménez-Barbero, J., Costa, L., Pier, G.B., de Andrés, D., Amorena, B., 2009. Protection from Staphylococcus aureus mastitis associated with poly-N-acetyl β-1,6 glucosamine specific antibody production using biofilm-embedded bacteria. Vaccine. 27, 2379-2386. 17. Prenafeta, A., March, R., Foix, A., Casals, I. und Costa, LL., 2009. Study of the humoral immunological response after vaccination with a Staphylococcus aureus biofilm-embedded bacterin in dairy cows: possible role of the exopolysaccharide specific antibody production in the protection from Staphylococcus aureus induced mastitis. Vet. Immun. Immunopathol. 134:208-217. 18. Schroeder, K., Jularic, M., Horsburgh, S.M., Hirschhausen, N., Neumann, C., Bertling, A., Schulte, Foster, S., Kehrel, B.E., Peters, G. und Heilmann, C., 2009. Molecular characterization of a novel Staphylococcus aureus surface protein (SasC) involved in cell aggregation and biofilm accumulation. PLoS ONE. 4(10):7567. 19. Tung, H., Guss, B., Hellman, U., Persson, L., Rubin, K. et al., 2000. A bone sialoprotein-binding protein from Staphylococcus aureus: a member of the staphylococcal Sdr family. Biochem J. 345(3):611-619.

10. Merino, N., Toledo-Arana, A., Vergara-Irigaray, M., Valle, J., Solano, C., Calvo, E., López, A.J., Foster, T.J., Penadés, J.R. und Lasa, I. 2009. Protein A-mediated multicellular behaviour in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 191:832-843.

20. Vasudevan, P., Nair, M.K.M., Annamalai, T. and Venkitanarayanan, K.S., 2003. Phenotypic and genotypic characterization of bovine mastitis isolates of Staphylococcus aureus for biofilm formation. Vet. Microbiol. 92:179185.

11. McDevitt, D., Francois, P., Vaudaux, P. und Foster, T.J., 1994. Molecular characterization of the clumping factor (fibrinogen receptor) of Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 11:237-248.

21. Watson, D.L. und Watson, N.A., 1989. Expression of a pseudocapsule by Staphylococcus aureus: influence of cultural conditions and relevance to mastitis. Research in Veterinary Science. 47:152-157.

12. Nordhaug, M.L., Nesse, L.L., Norcross, N.L. und Gudding, R., 1994. A field trial with an experimental vaccine against Staphylococcus aureus mastitis in cattle. 1. Clinical parameters. J. Dairy Sci. 77:1267-1275.

22. Watson, D.L. und Davies, H.I., 1993. Influence of adjuvants on the immune response of sheep to a novel Staphylococcus aureus vaccine. Vet. Microbiol. 34:139-153. Laboratorios Hipra, S.A. Avd. la Selva, 135 17170 Amer (Girona) Spain

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Aspectos generales del biofilm e implicación en la mastitis de rumiantes Antoni Prenafeta

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1. El biofilm como mecanismo de supervivencia

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l biofilm puede ser definido, en términos generales, como una comunidad microbiana, dinámica y bien estructurada, adherida a una superficie sólida y englobada en una matriz extracelular. La capacidad de formar biofilm es una característica muy extendida entre los organismos procariotas, tanto en el dominio Archea como Bacteria, hallándose en el registro fósil formaciones con una antigüedad de hasta 3.200 millones de años. Desde el punto de vista evolutivo, probablemente la formación de biofilm confirió una ventaja adaptativa al proporcionar homeostasis frente a las condiciones extremas y fluctuantes de la tierra primitiva (temperaturas, pH y exposición a radiaciones UV). Además de ofrecer protección ante factores ambientales físico-químicos, el biofilm facilita las funciones catalíticas extracelulares (al mantener las células próximas entre ellas) y favorece la concentración de nutrientes en la superficie (Hall-Stoodley et al., 2004). La resistencia del biofilm a los agentes antimicrobianos (por ejemplo los antibióticos) puede ser debida a la dificultad en la penetración del agente antimicrobiano a través de la matriz extracelular, a la disminución de la tasa de multiplicación de las células del biofilm (los antibióticos β-lactámicos son efectivos en las células Gram-positivas que se dividen activamente) o a la existencia de fenotipos resistentes entre una población hetereogénea genéticamente.

2. El biofilm en ambientes naturales y su implicación en las infecciones La formación de biofilm en ambientes naturales es ubicua, encontrándose este tipo de estructuras biológicas en el fondo de ríos o en la superficie de aguas estancadas; en ambientes extremos, desde emanaciones de aguas termales hasta glaciares de la Antártida; en duchas o baños, favorecido por el ambiente húmedo y cálido; en el interior de conductos de distribución de agua potable o tuberías de gas y aceite industrial; en simbiosis con plantas, etc. Por otro lado, la formación de biofilm está implicada en la patogénesis de muchas infecciones humanas. La adhesión de Staphylococcus o Streptococcus a las proteínas de la membrana basal del epitelio cardíaco dañado es una causa de endocarditis. En el caso de pacientes de fibrosis quística, la disminución de la actividad ciliar de la mucosa respiratoria y la hiperviscosidad de la secreción mucosa favorecen la colonización y la formación de biofilm de Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae y Pseudomonas aeruginosa. Otro ejemplo bien conocido de biofilm es la placa subgingival de Streptococcus mutans. La formación de biofilm también se ha descrito en cepas de Escherichia coli uropatógenas. Finalmente, el biofilm es un im-

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portante factor de virulencia implicado en el desarrollo de infecciones relacionadas con el implante de catéteres intravenosos, válvulas cardíacas, prótesis, catéteres peritoneales de diálisis, tubos endotraqueales… causadas principalmente por la adhesión de S. aureus y Staphylococcus epidermidis a la superficie de estos implantes (Hall-Stoodley et al., 2004). La contribución del biofilm a la patogénesis se atribuye a su resistencia a los antibióticos y a la fagocitosis, facilitando de este modo la cronificación de las infecciones. El desprendimiento de células bacterianas del biofilm es causa de septicemia y nuevas colonizaciones, mientras que la producción de endotoxinas y exotoxinas producen inflamación y lesiones tisulares. Uno de las dificultades para eliminar las infecciones relacionadas con la producción de biofilm es la resistencia a los antibióticos. En la Tabla 1 se puede apreciar que la muerte bacteriana dentro del biofilm requiere una mayor cantidad de antibiótico que la concentración con actividad bactericida en las células bacterianas planctónicas (libres o en suspensión).

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Revisión Bibliográfica: Mamitis bovina causada por Estafilococos Coagulasa Negativos Clara Navarro Sansano Serveis de Qualitat de Llet [email protected]

1. Introducción

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no de los grupos de bacterias que provocan la mamitis son los denominados estafilococos coagulasa negativos (ECN). Estas bacterias son de elevado interés debido a que actualmente son los microorganismos más frecuentemente aislados de los rebaños en vacas y novillas, estando consideradas en la actualidad como patógenos emergentes de la mamitis bovina (Pyöräla S. et al. 2009). Normalmente los ECN se encuentran en la piel sana del pezón y en las manos del ordeñador. A menudo son denominados “microorganismos oportunistas”, ya que habitan zonas desde donde les es sencillo colonizar el canal del pezón y penetrar hasta los tejidos secretores. La implementación de programas de control de mastitis durante los últimos 30 años condujo a una reducción de la incidencia general de mastitis clínica en la mayoría de rebaños. En algunos casos, la disminución llegó al 90%. Mientras que la enfermedad clínica causada por patógenos mayores, como los Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae descendió significativamente, patógenos menores como los ECN han ido en aumento tomando cada vez una mayor importancia.

Las vacas y las novillas pueden ser infectadas por ECN antes del parto. En la lactación, la infección debida a ECN se asocia a un aumento en el recuento de células somáticas (RCS), que provoca pérdidas económicas por la penalización en el precio de la leche. La prevalencia de las mamitis por ECN es más elevada en primíparas. Generalmente suelen ser infecciones leves y se limitan a flóculos en la leche debidos a cambios locales en la ubre. Muchas de estas infecciones incluso se curan espontáneamente; pero puntualmente, también se observan animales con infecciones intramamarias por ECN con síntomas a nivel sistémico y otros con infecciones persistentes que, si no se interviene, pueden tener una duración de varios meses. Hay más de 50 especies de estafilococos coagulasa negativos, y quizás sea un error observar su comportamiento como grupo y no como especies individuales. Aunque no se consideran un grupo de bacterias tan patógenas como los principales patógenos causantes de mamitis, su patogenicidad y la resistencia a tratamientos antimicrobianos varía dependiendo de la especie de ECN.

Algunos investigadores los consideran patógenos secundarios en ubre, pero la importancia de estas infecciones intramamarias son aún tema de debate, ya que, por otro lado, otros trabajos les otorgan gran importancia en la etiología de la mamitis subclínica o clínica y en el aumento de células somáticas de las vacas afectadas.

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2. Etiología y epidemiología

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Los ECN son cocos Gram positivos que habitan tanto en el exterior como en el interior de las ubres infectadas. Muchas veces se les denomina “oportunistas de la flora de la piel” porque pueden ser aislados de la piel del pezón, del canal del pezón, la vagina, el pelaje y las fosas nasales. Este grupo de bacterias incluye más de 50 especies y subespecies (Pyöräla S. et al. 2009). Las bacterias más comunes de ECN aisladas de mamitis bovina son Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus epidermitis, Staphylococcus hyicus y Staphylococcus simulans. Especies como Staphylococcus epidermitis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus simulans y Staphylococcus warneri pertenecen a la flora bacteriana normal de la piel del pezón; mientras otras, como Staphylococcus xylosus y Staphylococcus sciuri, parecen provenir del ambiente. Staphylococcus chromogenes puede colonizar la piel del pezón y también otros lugares del cuerpo del animal como el pelaje, la vagina y el canal de pezón. Parece ser que hay diferencias en cuanto a la patogenicidad de las distintas especies de ECN que se investigan mediante técnicas de diagnóstico molecular (Zadoks and Schukken, 2006). Encontramos especies con diferente susceptibilidad antimicrobiana y diversos factores de virulencia de ECN aislados de mamitis bovina (Taponen S. et al. 2009). La incidencia de nuevas infecciones es máxima durante el período de vaca seca y antes del parto; por lo tanto, el porcentaje de cuartos infectados es alto en el momento del parto. La prevalencia de ECN es más alta en primíparas que en vacas adultas. Desafortunadamente, muchos productores creen erróneamente que sus novillas están sanas, y la presencia de mastitis no se observa hasta el momento del parto. La recría representa la futura lactación, y el cuidado de la salud de ubres es básico para asegurar la rentabilidad de las explotaciones lecheras. Muchas de las infecciones intramamarias causadas por ECN curan espontáneamente y la prevalencia decrece a medida que avanza la lactación. Aunque por lo general las infecciones por ECN suelen ser leves o de tipo subclínico, se ha demostrado también que pueden causar procesos más graves y persistentes, provocando un aumento en el recuento de células somáticas y una disminución en la calidad y producción de

la leche debido al daño causada al tejido mamario (Taponen S. et al. 2009; Gillespie BE et al. 2009).

3. Características de las infecciones por ECN

• Suelen ser infecciones leves y causar mamitis subclínicas. • Aumento en el RCS. • Pueden provocar procesos clínicos persistentes que no responden al tratamiento antibiótico. • Aspecto de la leche normal, pero puede provocar infecciones intramamarias con alteraciones en la leche (flóculos). • Alta prevalencia en primíparas (sobre todo en el período alrededor del parto). • Mayor incidencia de nuevas infecciones en el período seco de la vaca. • No suele haber afectación del estado general del animal, ni signos sistémicos graves. • Elevada tasa de curación espontánea.

4. Diagnóstico Una vez detectados los cuarterones con elevados recuentos celulares, o bien que presentan mamitis clínicas, se deben recoger muestras de leche de forma adecuada y aséptica para su posterior procesado en el laboratorio. El análisis microbiológico es la prueba más importante para el diagnóstico en los programas de control de mamitis. La metodología habitual incluye la siembra en medios de crecimiento general y específicos para los principales grupos etiológicos. Se incuban a 37ºC, realizando lecturas a las 24 y 48 horas. El Agar Baird Parker es el medio de cultivo específico para estafilococos. Permite diferenciar entre CNS y Staphylococcus aureus. La identificación de las diferentes especies de CNS es importante para poder determinar su patogenicidad y desarrollar prácticas de manejo específicas para prevenir la mastitis. El problema es que la identificación de éste grupo de organismos es difícil y relativamente costosa. Por esta razón, muchos laboratorios no incluyen la identificación de especies de CNS en sus procedimientos de rutina.

5. Tratamiento Generalmente se asume que el porcentaje de curación espontánea de CNS es elevado Los CNS responden mucho mejor a la terapia antimicrobiana que los Staphylococcus

aureus, y la mayoría de especies de CNS son susceptibles a los antibióticos comúnmente utilizados para el tratamiento de mamitis. El tratamiento mediante la terapia intramamaria en el periparto y en el secado es eficaz para poder controlar las infecciones debidas a CNS. Sin embargo, no siempre es efectivo el tratamiento. Según el National Mastitis Council (NMC), podemos clasificar a estos gérmenes como Staphylococcus Coagulase Negatives novobiocina sensibles y Staphylococcus Coagulase Negative novobiocina resistentes.

Tratamiento de mamitis clínicas debidas a Staphylococcus Coagulase Negative (CNS) novobiocina sensibles: Penicilinas y/o Penetamato o Cefalosporinas (vía intramamaria y/o parenteral). Tratamiento de mamitis debidas a CNS novobiocina resistentes: El tratamiento no es necesario ya que presentan curaciones espontáneas. Tratamiento antibiótico de secado: Penicilinas y/o Penetamato o Cefalosporinas

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6. Medidas de control Se aplicarán medidas de control en las vacas en lactación, en las vacas secas y también a las novillas de recría. La recría puede ser una fuente de infección en la lechería, particularmente bajo los sistemas de manejo actuales, donde las novillas son transportadas y mezcladas varias veces antes de llegar a la lechería donde van a parir (Oliver y Nickerson). Generalmente, en las explotaciones no se presta demasiada atención a las novillas, y tampoco al periodo seco de la vaca; pero si tenemos en cuenta que las novillas forman aproximadamente una tercera parte del rebaño cada año, y que junto con las vacas secas son la inversión de futuro de nuestra explotación, la salud de la ubre y el buen funcionamiento de las novillas y vacas secas debería ser la prioridad número uno. Las medidas de control deben disminuir el o del animal con los organismos que provocan mastitis mucho antes del parto. Manejo • Separar las terneras en boxes individuales: evitar que se mamen unas a otras, ya que pueden transmitir

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bacterias y causar infecciones persistentes que se establecen muy temprano en la vida del animal. • No alimentar a las novillas lactantes con leche infectada: evitar la transmisión de agentes infecciosos de las vacas adultas a las becerras. • Separar las novillas de las vacas antes del parto. • Proporcionar áreas de parto limpias para las vacas y también para las novillas.

por los microorganismos medioambientales. La llegada al mercado de la primera vacuna registrada a nivel mundial contra CNS puede ser una buena herramienta para incrementar la inmunización de las explotaciones. El protocolo a base de dos aplicaciones antes del parto y una después ayuda a disminuir la incidencia y la severidad en el momento de más pérdidas de una explotación

Ambiente • Control de moscas: las moscas pueden ser vectores de agentes patógenos y también crean una lesión en la punta del pezón, lo cual permite a las bacterias como Staphylococcus aureus o bien, CNS establecerse en la piel del pezón y entrar por el orificio del mismo. • Asegurar un ambiente seco y limpio. También para la recría.

Terapia antibiótica de secado y pautas generales • istrar una correcta terapia antibiótica de secado en función del perfil bacteriológico de la explotación. • Corregir la rutina de ordeño. Realizar una correcta desinfección de la punta del pezón mediante baños desinfectantes preordeño y postordeño. • Eliminar animales crónicos. • Garantizar la higiene de los tratamientos de secado. • Verificar el estado de los alimentos y del agua de bebida. • Utilizar y mantener adecuadamente la máquina de ordeño. • Cuidar especialmente el estado de las camas y las zonas de paso en el secado y en la lactación.

Programa vacunal No podemos asegurar una buena prevención y control de la salud de las ubres de novillas y vacas de la explotación sin tener en cuenta un buen Programa de Vacunación. Es importante para protegerse contra la incidencia y la severidad de la mastitis causada

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pauta de vacunación STARTVAC®

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Eficacia en el posparto gracias a su pauta vacunal Con el uso de dos aplicaciones preparto (a los 45 días y 10 días antes del parto) y una aplicación posparto (a los 52 días), se reducen las mamitis en el momento de más riesgo de infecciones y pérdidas económicas.

Bibliografía 1. John R.Middleton, Christopher D.Luby, D.Scott Adams, 2009 Efficacy of vaccination against staphylococcal mastitis: A review and new data 2. Schukken, Y.H., et al., 2009 CNS mastitis: Nothing to worry about?

9. A.A. Sawant, B.E. Gillespie, S.P.Oliver, 2008 Antimicrobial susceptibility of coagulase-negative Staphylococcus species isolated from bovine milk

3. Stephen C.Nickerson, 2008 Control of heifer mastitis: Antimicrobial treatment-An overview

10. O.C.Sampimon, H.W.Barkema, I.M.G.A.Berends, J.Sol, T.J.G.M.Lam, 2008 Prevalence and herd-level risk factors for intramammary infection with coagulasa-negative staphylococci in Dutch dairy herds

4. Suvi Taponen, Satu Pyörälä, 2009 Coagulase-negative staphylococci as cause of bovine mastitis-Not so different from Staphylococcus aureus?

11. National Mastitis Council Annual Meeting Proceedings, StephenC. Nickerson

5. Satu Pyörälä, Suvi Taponen, 2009 Coagulase-negative staphylococciEmerging mastitis pathogens

12. Wilson, D.J., Gonzalez, R.N. and Das, H.H. Bovine Mastitis Pathogens in New York and Pennsylvania: Prevalence and Effects on Somatic Cell Count and Milk Production

6. White, L.J., et al., 2001 A multispecies model for the transmission and control of mastitis in dairy cows 7. Zadoks, R.N., et al., 2001 Cow- and quarter-level risk factors for Streptococcus uberis and Staphylococcus aureus mastitis 8. Zadoks, R.N., Schukken, Y.H., 2006 Use of the molecular epidemiology in veterinary practice.

13. W. Nelson Philpot, Ph.D. y Stephen C. Nickerson, Ph.D. Ganando la lucha contra la mastitis 14. Arthur Saran-Marcelo Chaffer Mastitis y Calidad de Leche 15. Boehringer Ingelheim España, S.A. Div. Veterinaria Dosier solomamitis etiologia, tratamiento y diagnótico.

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Mastitis colibacilar Demetrio Herrera [email protected]

1. Introducción

2. Patogenia

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Escherichia coli, así como la mayoría de bacterias Gram-negativas, tiene en su membrana celular externa una macromolécula característica y esencial denominada lipopolisacárido (LPS). Este LPS es el principal factor de patogenicidad de la bacteria y el desencadenante del típico cuadro de mamitis hiperaguda por coliformes. La inyección intramamaria experimental de LPS en animales sanos provoca la misma sintomatología y es dosis dependiente, provocando la muerte del animal a dosis altas. La bacteria penetra únicamente vía canal del pezón, se multiplica rápidamente en la cisterna de la ubre y, en el proceso de multiplicación y lisis, la toxicidad y la potente capacidad inductora de citoquinas inflamatorias del LPS provoca en la vaca una sintomatología generalmente aguda, que cursa con una pérdida casi total de la producción láctea, una inflamación aguda del cuarto afectado y, a menudo, pérdida de

pesar de los esfuerzos de ganaderos y técnicos para mejorar la salud de ubre de los rebaños, la mamitis colibacilar sigue siendo un problema importante en muchas ganaderías. En granjas donde las mamitis de origen contagioso están prácticamente erradicadas y con bajos recuentos celulares de tanque, entre el 20 y el 40% de los episodios de mamitis clínicas son provocados por coliformes. Escherichia coli, Klebsiella spp. y, en menor grado, Enterobacter spp. son los coliformes más comúnmente aislados de episodios clínicos de este tipo. La presentación del cuadro clínico y sus costes derivados (leche retirada, coste tratamiento, reposición por muerte o sacrificio del animal, etc.) es muy variable y depende primordialmente, más que de la patogenicidad de la cepa implicada, de factores ligados a la vaca. En el presente artículo discutiremos los factores predisponentes y las medidas de prevención para luchar contra esta patología.

apetito, fiebre, decaimiento, shock y en algunos casos la muerte del animal. Dependiendo del estado inmunitario de la vaca la presentación puede ser no tan aguda. La infección crónica con episodios clínicos recurrentes también puede ocurrir, pero es menos frecuente. La capacidad del sistema inmunitario de la vaca es clave para limitar la rápida proliferación de E. coli en la ubre y reducir la acción tóxica del LPS. Los neutrófilos son los principales actores en la lucha contra las infecciones intramamarias. Se encargan de secuestrar, matar y eliminar al patógeno, ayudados por anticuerpos opsonizantes, principalmente IgG2 y citoquinas proinflamatorias, las cuales son responsables del paso masivo de neutrófilos desde los capilares sanguíneos de la ubre hacia la cisterna. La rápida movilización de los neutrófilos hacia la ubre es fundamental para reducir los efectos del cuadro clínico.

Mastitis colibacilar

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3. Factores predisponentes

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La mayoría de infecciones intramamarias por coliformes se dan en las dos primeras semanas del período seco y, sobre todo, en el periparto. Además, prácticamente la mitad de las mamitis clínicas que ocurren dentro de los primeros 100 días en lactación tienen el origen en el secado y periparto. La presentación aguda o hiperaguda de la mamitis colibacilar no es exclusiva del posparto, pero sí un elevado porcentaje. Las infecciones intramamarias por coliformes en la lactación avanzada, provocan casos leves o moderados que el propio sistema inmune de la vacas es capaz de resolver y a menudo pasan desapercibidos.

El inicio del período seco es una fase de riesgo debido principalmente a: • Incremento de la presión en el interior de la ubre que, a veces, provoca pérdidas de leche y también del antibiótico de las jeringas de secado, dejando el esfínter abierto, por donde pueden penetrar bacterias. • Proliferación bacteriana en la piel del pezón, fruto del cese del ordeño y la práctica de pre y postdipping. • Retraso en la formación del tapón de queratina. Hay vacas que tardan días, incluso semanas, en sellar el pezón. • Una higiene deficiente al aplicar las cánulas intramamarias de secado puede provocar infecciones intramamarias.

El periparto es también una fase de riesgo debido a que el sistema inmune se ve comprometido por varios factores: • El parto en sí mismo es estresante para la vaca. Los niveles plasmáticos de cortisol experimentan un fuerte incremento fisiológico, necesario para el desencadenamiento del parto y la calostrogénesis. El cortisol inhibe la respuesta inflamatoria e influye negativamente en la funcionalidad de los neutrófilos. • Balance Energético Negativo (BEN). Hay infinidad de estudios que relacionan el BEN con patologías posparto. El incremento de las necesidades energéticas en el posparto, unido a una capacidad de ingesta reducida, provoca la movilización de reservas grasas que, tras su metabolización en el hígado, pueden provocar cetosis. Los cuerpos cetónicos influyen negativamente en la capacidad de migración y reclutamiento de neutrófilos hacia la ubre, en la fagocitosis y también en la capacidad de oxidación y destrucción por parte de los neutrófilos. • Estrés. Factores estresantes como calor, estrés metabólico, competencia, transporte, etc. inducen la secreción de cortisol y provocan inmunosupresión. En el posparto, el estrés es un círculo vicioso. Vacas estresadas comen menos, con lo que el BEN se alarga o acentúa, y la inmunosupresión se potencia.

• Otros:

* Pérdidas de leche, fruto del incremento de

la presión intramamaria al final del período seco. El esfínter está abierto para la entrada de patógenos. * La mayoría de formulaciones antibióticas de las cánulas de secado no cubren la fase final del secado, especialmente en secados estándares de 60 días. Además, la mayoría de los productos que hay en el mercado presentan una actividad limitada frente a los Gram negativos. * Ordeño posparto a menudo dificultoso por el edema de ubre, que provoca isiones de aire durante el ordeño, facilitando la entrada de patógenos hacia la cisterna.

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Mastitis colibacilar

4. Tratamiento

5. Prevención

El tratamiento se debe enfocar hacia la vaca, no hacia la bacteria. E. coli se multiplica rápidamente en la ubre alcanzando el pico de concentración en menos de 12 horas (Erksine et al 1989). El reconocimiento de los signos clínicos de mamitis colibacilar ocurre normalmente después de la máxima concentración bacteriana en la ubre. Esta idea pone en duda la conveniencia de tratar con antibióticos la mastitis colibacilar. Además, hay muchos estudios que demuestran la pobre eficacia de los tratamientos antibióticos contra las mamitis por Gram negativos. Por lo tanto, nos centraremos en el tratamiento sintomático: 1. Suero hipertónico salino IV. La vaca debe tener libre a agua limpia y fresca. 2. AINEs para controlar fiebre e inflamación. 3. Calcio, hierro y vitaminas ADE para potenciar la función de los neutrófilos. 4. Oxitocina y ordeños frecuentes. El propio dolor e inflamación inhibe la bajada de la leche. La oxitocina ayuda a un mejor vaciado de la ubre, eliminando así mayor número de bacterias. 5. Antibióticos activos frente a Gram negativos por vía parenteral (como preventivo de la sepsis, no para curar la infección).

Teniendo en cuenta la baja eficacia de cualquier tratamiento frente a la mamitis colibacilar hiperaguda, la prevención es el mejor tratamiento posible. Conociendo los períodos de máximo riesgo y los factores predisponentes, las estrategias de prevención se centran básicamente en 2 vías: 1. Minimizar la exposición de la punta del pezón a la bacteria presente en el ambiente: • Extremar la higiene de las zonas de descanso de las vacas, especialmente patios de secas, pre y posparto; teniendo en cuenta que estos son los períodos de máximo riesgo de contraer infección intramamaria por coliformes. Cubículos o camas limpias y secas son claves para evitar la proliferación de E. coli en las zonas de reposo. Los materiales inertes, como son la arena o marmolina, son más adecuados que los orgánicos (paja, serrín o cascarilla), proliferando menos las bacterias. • Ordeñar pezones limpios y secos. 2. Incrementar la resistencia del animal a la infección: • Minimizar el estrés de cualquier tipo. • Raciones y estrategias de alimentación que reduzcan al mínimo el BEN y su duración en el



tiempo. El objetivo es maximizar la ingesta de materia seca. • Asegurar los aportes necesarios de Vit E y Se en la ración, importantes para el sistema inmune, ya que incrementan la actividad fagocitaria de los neutrófilos. Los estados carenciales de estos elementos incrementan la posibilidad de sufrir mastitis y también la severidad y duración de la infección. • Vacunación. La vacunación contra la mamitis colibacilar es una estrategia comúnmente implementada en granjas lecheras de los Estados Unidos (entre el 40-65% de las granjas la aplican). Las más utilizadas son vacunas basadas en la cepa J5 de E. coli. Esta cepa es un mutante que carece de la cadena O-polisacárida del LPS, dejando expuesto al sistema inmunitario el antígeno “core” del LPS. A diferencia de la cadena O-polisacárida, la composición y estructura de dicho antígeno “core” se encuentra muy conservada entre los distintos Gram-negativos, por lo que las vacunas con J5 inducen anticuerpos opsonizantes “anticore” con inmunidad cruzada contra diferentes cepas de E. coli y otros gram negativos. La eficacia de la vacunación en la protección contra la mamitis colibacilar aguda ha sido demostrada en diferentes estudios de campo. En numerosas referencias bibliográficas se constata

Mastitis colibacilar

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Demetrio Herrera |[email protected]

que la inmunización con J5 no previene las infecciones intramamarias por coliformes, pero sí reduce la aparición del caso clínico, su severidad y las pérdidas económicas por muerte o sacrificio del animal. Según algunos estudios económicos llevados a cabo en los EEUU, un programa vacunal contra este tipo de mastitis es económicamente rentable cuando más del 1% de las lactaciones se ven afectadas por mamitis colibacilar. De acuerdo con la bibliografía, la vacunación puede ser una herramienta de gran utilidad en la prevención de las mastitis causadas por Gram-negativos en granjas donde existe tal problemática. Considerando que el posparto es el período más crítico y donde se dan la mayoría de casos clínicos por las causas ya citadas, el objetivo deber ser potenciar la inmunidad en este período, vacunando los animales en el secado y revacunando antes del parto. Una dosis de recuerdo durante los primeros meses de lactación puede ser apropiada para prolongar la duración de la inmunidad. En climas cálidos y húmedos, donde la incidencia puede ser alta en los meses de verano, una dosis de recuerdo a todos los animales podría proteger también el rebaño.

nº Conclusiones

La mastitis colibacilar es una patología importante en muchas explotaciones por el impacto económico que conlleva. La prevención es la mejor herramienta para controlar este problema. El manejo del período seco y en el periparto es clave. Vacas alojadas en patios o cubículos limpios, secos y confortables van a reducir las infecciones intramamarias por coliformes. Además estrategias de alimentación que minimicen el BEN en el posparto y reduzcan el estrés ayudarán a la vaca a luchar contra la mastitis hiperaguda. Por último, señalar que un protocolo de vacunación en el secado, puede ser de gran ayuda para prevenir los casos clínicos por coliformes en las explotaciones donde exista esta problemática.

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1. Introducción

2. ¿Es posible vacunar?

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Junto a todas estas medidas clásicas de control anteriormente citadas, se ha agregado otra medida complementaria: la vacunación.Tomando en cuenta la dificultad de que nos encontramos con agentes como el S. aureus o el E. coli, por su pobre respuesta a los tratamientos antibióticos, la prevención con una adecuada vacunación (sumada a las medidas ya mencionadas) sería de gran importancia. Para el caso de las mastitis por Staphylococcus aureus, las vacas lecheras son los reservorios de la bacteria. La terapia antibiótica es pobre cuando estas bacterias se encuentran en la profundidad del tejido mamario (Ma y col., 2004). Autores como Blowey y col (1995), realizando una revisión bibliográfica de tratamientos con Cloxacilina, muestran tasas de curación de la mastitis por S. aureus del 24 % para casos clínicos y del 40% para los subclínicos, siendo la tasa más elevada la de la terapia de secado (60%) que, por esta razón, se considera el tratamiento de elección para esta bacteria. La baja tasa de curación podría ser atribuida a la habilidad de la bacteria para sobrevivir al tratamiento cuando se encuentra intracelularmente en las células epiteliales o en los macrófagos (Hensen y col., 2000; Herbet y col 2000).

a mastitis es una reacción inflamatoria de los tejidos secretores o conductores de la leche en la glándula mamaria, como respuesta a una infección bacteriana, que afecta principalmente la producción lechera en cantidad y calidad. Los agentes causantes de la mastitis bovina son microorganismos que habitan en la ubre de la vaca y sus alrededores. De acuerdo con su epidemiología, pueden dividirse en tres grupos: 1) contagiosos, con bacterias como Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae, 2) ambientales, donde se destacan Streptococcus no agalactiae y gramnegativas, como por ejemplo E. coli y 3) oportunistas, donde tenemos a los Staphylococcis coagulasa negativos. El control de la Mastitis se ha basado en distintas medidas: 1) Rutina de ordeño adecuada e higiénica; 2) Mantenimiento y uso adecuados del equipo de ordeño; 3) Terapia de secado apropiada; 4) Tratamiento de casos clínicos durante la lactación; 5) Tratamiento de problemas de piel de la ubre y los pezones; 6) Descarte de vacas con mastitis crónica; 7) Examen de vacas que se deseen introducir a la explotación como reposición; 8) Registro de datos; 9) Mantener un ambiente limpio.

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En lo que respecta a E. coli, según lo estudiado por Sandholm y col (1995), la terapia antibiótica tendría poco efecto en mejorar los síntomas provocados por la bacteria, debido a que estos síntomas son debidos principalmente a la endotoxina. La vacunación tiene como fin mejorar y potenciar el sistema inmune contra un antígeno específico. En el caso de las vacunas contra la mastitis lo que se busca es una adecuada llegada de neutrófilos al lugar donde se encuentra el agente patógeno; lo que junto con una adecuada cantidad de inmunoglobulinas, favorecerá su opsonificación y posterior fagocitosis. Sumado a esto, los anticuerpos generados por la vacunación pueden también ejercer una importante función en la neutralización de toxinas, interfiriendo en los mecanismos de adhesión de la bacteria e induciendo su lisis. La revisión bibliográfíca nos muestra beneficios en el uso de vacunas protectoras contra S. aureus o E. coli. Así, se observa el efecto de la vacunación reflejado en:

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Beneficios obtenidos al utilizar vacunas contra S. aureus y E. coli 1) Reducción en la severidad y duración de la sintomatología de mastitis por coliformes; 2) Disminución en las tasa de infecciones 3) Disminución en el uso de antibióticos y en su posible aparición como residuos en la leche 4) Disminución en los recuentos celulares somáticos y aumentos en la producción diaria de leche.

Nordaugh y col., (1994) utilizando una vacuna inactivada de S. aureus, mostraron su efecto positivo en la no aparición de casos clínicos en el grupo de vacas vacunadas, contra un 6% de casos en las no vacunadas. En lo que respecta a casos de mastitis subclínica por S. aureus, ésta fue diagnosticada en un 8% del grupo de vacunadas y en un 14% en las vacas no vacunadas. En Israel, en un ensayo de campo, Leitner y col. (2003), utilizando una vacuna compuesta de fragmentos de S. aureus obtenidos por sonicación, mostraron efectos beneficiosos y estadísticamente significativos en lo que respecta a producción lechera y células somáticas en el grupo de vacas vacunadas. Lo importante en una vacunación contra S. aureus es hacerla de manera temprana, preferiblemente en la etapa de novillas preparto, evitando así una posible infección que comprometa su vida productiva lechera. En lo que respecta a una mastitis por coliformes, Hogan y col. (1995), en un experimento de desafío con cepa virulenta de E. coli a vacas vacunadas con una bacterina de E. coli J5 y a no vacunadas, demostraron que la duración de la infección intramamaria, así como la intensidad de los síntomas, son menores en el grupo vacunado. Deluyker y col. (2005), en un ensayo de campo, encontraron que si bien la vacuna contra E. coli no ayudó a disminuir la cantidad de casos clínicos en el grupo vacunado con respecto del no

vacunado, si hubo diferencias significativas en la cantidad de casos de mastitis tóxicas sistémicas a favor del grupo vacunado. Para el caso del S. aureus, se han desarrollado en el pasado distintos tipos de vacunas con resultados diversos. Estas vacunas las podríamos dividir en dos grandes grupos, 1) Bacterinas y 2) Vacunas que incluyen algún componente de la bacteria considerado de importancia antigénica. En el primer grupo (de las bacterinas) las vacunas son elaboradas con todos los componentes de la célula bacteriana y éstas pueden ser muertas o vivas. Así se han desarrollado pruebas con este tipo de vacunas en mastitis por autores como Pankey (1985) o Leitner y col. (2003). El segundo grupo, que son aquellas vacunas que incluyen elementos de importancia antigénica, se desarrolla a partir de factores de virulencia como pueden ser: a) Proteína A, componente de la pared celular de la bacteria que se une a las inmunoblogulinas (Pankey y col., 1985; Carter y Kerr, 2003). b) Pseudocápsula, polisacárido extracelular con propiedades antifagocíticas (Watson y col., 1992; Nordhaug y col., 1994). c) Antígenos capsulares, como por ejemplo el polisacárido Slime, también llamado Slime Associated Antigenic Complex (Yosida y col., 1987; Calzolari y col., 1997; Giraudo y col., 1997). d) Alfa y Beta toxinas (Herbelin y col., 1997). e) Fibronectin binding protein, molécula de superficie que actúa como factor de adherencia bacteriano (Shkreta y col., 2004). f) Clumping factor A, molécula de superficie que actúa como factor de adherencia bacteriano (Brouillete y col. 2002).

3. Ensayo de vacunación contra mastitis realizado en España En un ensayo multicéntrico realizado en 6 fincas lecheras de Cataluña se dividieron 386 vacas lecheras multíparas y primíparas en dos grupos. El primer grupo de 188 vacas fue el grupo control no vacunado; mientras que el segundo grupo, de 198 vacas, fue vacunado. El plan de vacunación para este grupo consistió en una primera dosis de vacuna unos 45 días antes del parto, una segunda dosis antes de llegar a los diez días previos al parto y una tercera dosis a los 50 días post-parto.

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La vacuna utilizada contenía antígenos de S. aureus de cepas 8 altamente productoras de Slime Associated Antigenic Complex, sumado a cepas E. coli J5. (Laboratorios Hipra, Amer, Girona, España). Los datos recabados fueron analizados por regresión logística con análisis de varianza. 3.1 Recuento celular somático, tasa de curación y tratamientos farmacológicos adicionales durante el ensayo Durante el ensayo de campo se midió el recuento celular somático, el parámetro más aceptado en el seguimiento de salud de ubre y calidad de leche (Laevens,1997; Pyorala, 2003; Schukken et al., 2003). El grupo vacunado presentó un recuento celular de 324.1 x 103 comparado con 581.4 x 103 en el grupo control. Cuando se comparó en forma logarítmica, estas diferencias fueron estadísticamente significativas (p=0.0182). La tasa de curación para las multíparas vacunadas fue de 53.33%, en comparación con el 20.45% registrado en las no vacunadas, siendo esta diferencia significativa (p<0.05). En las primíparas, a pesar de ser la tasa de curación favorable al grupo vacunado, la diferencia registrada no fue significativa. En el mismo ensayo se midieron tratamientos farmacológicos en los dos grupos de vacas, vacunadas o control. Hubo 24 animales tratados por mastitis en el grupo vacunado, 14 vacas multíparas y 10 primíparas. Las multíparas de este grupo vacunado recibieron 21 tratamientos, dando un promedio de 1.5, mientras que las primíparas recibieron 13 tratamientos, con un promedio de 0.7. Por otro lado, en el grupo control 40 vacas recibieron tratamiento farmacológico adicional, 28 multíparas y 12

primíparas. El promedio registrado para este grupo control no vacunado fue de 2.1 para las multíparas y 2.8 para las primíparas. El análisis estadístico de estos resultados dio que, para el grupo de las multíparas, esta diferencia

registrada en tratamientos farmacológicos adicionales necesarios fue significativamente diferente (p=0.003). Siendo el número de tratamientos por vaca menor en el grupo vacunado, el tiempo de tratamiento requerido es también menor. Estos puntos son sumamente interesantes ya que, en definitiva, determinan no sólo el menor uso de fármacos, sino también un menor descarte de leche por uso de antibióticos. Tanto el experimento realizado en Cataluña como la literatura aportan datos que muestran efectos positivos de las vacunas contra la mastitis. Si bien es un elemento a tener en cuenta y recomendado en la lucha contra esta enfermedad, no se debe olvidar que la vacunación debe ser combinada con las medidas tradicionales de control de mastitis en el establecimiento.

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