Trabajo Tecnicas Histoquimicas 1p2h2

Técnicas Histoquímicas - Tinción Métodos morfológicos del Sistema Nervioso Máster de Neurociencias • INCYL • Febrero 2012

Daniel Íncera Fernández [email protected]

Técnicas Histológicas En el siguiente esquema se muestran los métodos y técnicas comúnmente empleados para el procesamiento de los tejidos: obtención del tejido, fijación, inclusión, corte, tinción o contraste y observación. En el presente trabajo por motivos de espacio voy a desarrollar el proceso de tinción.

Figura 1. Métodos y técnicas comúnmente utilizados en el procesamiento de los tejidos

Podemos dividir el conjunto de técnicas histológicas en cuatro categorías: a) Tinciones generales. Aquellas que están basadas en colorantes, sustancias mediante las cuales conseguimos colorear los tejidos. Generalmente los colorantes son hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas moléculas presentes en los tejidos gracias a unidades químicas. Se utilizan normalmente para teñir a las células y componentes tisulares que van a ser observados con el microscopio óptico y por ello se realizan habitualmente sobre secciones de tejido. Los colorantes son moléculas que poseen tres componentes Daniel Íncera Fernández [email protected]

importantes: un esqueleto incoloro, que normalmente es un anillo aromático de benceno, al cual se le unen dos tipos de radicales: uno que aporta el color, denominado cromoforo, y otro que posibilita la unión a elementos del tejido denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molécula se denomina cromógeno. Según la naturaleza química del cromoforo hay varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos, derivados de la antroquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas quinónicas, derivados de diferrilmetano y triferrilmetano, derivados del xanteno y derivados de las talocianinas. Según la naturaleza química del radical auxocromo los colorantes se clasifican en: Clasificación de los colorantes

Ponen de manifiesto

Ejemplos

BÁSICOS

Núcleo y ARN

Tionina, Safranina,

Imagen

Azul de toluidina, Azul de metileno o Hematoxilina Tionina ÁCIDOS

Citoplasma celular y el

Ucsina ácida,

colágeno de la matriz

Verde rápido,

extracelular

Naranja G o la Cosina Uesina ácida

NEUTROS

Puede teñir tanto las

El eosinato de

partes básicas como las

azul de metileno

ácidas de los tejidos Azul de metileno INDIFERENTES

No se unen a

Colorante sudan

elementos de los tejidos por afinidad química sino porque se disuelven en ellos Colorante Sudan Figura 2. Clasificación de los colorantes

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b) Histoquímica. Aquellas técnicas de tinción que utilizan una serie de métodos para observar reacciones químicas y/o biológicas en ciertas sustancias o la actividad de enzimas en muestras histológicas para después observarlas con colorantes. c) Lectinas. Son que son capaces de reconocer glúcidos que forman parte de polisacáridos. Tienen una gran especificidad y se usan para determinar el tipo de glúcido que aparece en las glucoproteínas de la membrana plasmática o de la matriz extracelular de los diferentes tejidos. d) Inmunocitoquímica. Son técnicas histológicas que consisten en la alta especificidad de unión de los anticuerpos a los antígenos contra los que se produjeron. Estos antígenos pueden ser cualquier molécula tisular que, purificada e inyectada en un animal, sea capaz de desarrollar una respuesta inmune. Estos anticuerpos añadidos a una sección de tejido reconocerán y se unirán específicamente a dicha molécula. e) Hibridación. Aquellas técnicas basadas en la unión complementaria de las bases de ácidos nucleicos (adenina con la timina, o con el uracilo, y de la guanina con al citosina). Esto hace que dos cadenas complementarias de ácidos nucleicos se unan entre sí de forma muy específica, es decir, hibriden. Así, se pueden sintetizar sondas marcadas, cadenas de ADN o ARN con una secuencia de bases determinada que llevan una molécula unida para poder detectarlas.

Tinciones generales Una de las tinciones mas comúnmente usada en histología es la hematoxilina-eosina sobre cortes de parafina. Como vemos se usa un colorante básico y otro ácido para teñir de diferente color a las estructuras ácidas y básicas de la célula. Antes de proceder a la tinción, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es el desparafinado, puesto que estos cortes son hidrosolubles (ver figura 3).

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Los tiempos dependen del grosor de los cortes y de la concentración de los colorantes. El desparafinado permite eliminar la parafina. El paso por agua de grifo, típico de la hematoxilena se denomina diferenciación. Las sales del agua permiten obtener una coloración mas violácea, en vez de púrpura. La deshidratación final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Tras el montado y secado, las secciones se puede observar con el microscopio óptico.

Figura 3. Pasos que se siguen tras un tinción general de hematoxilina-eosina

Histoquímica El objetivo de la histoquímica es mostrar moléculas presentes en una sección histológica y estudiar su distribución tisular “in situ”. Durante el procesamiento del tejido previo a la reacción histoquímica, como la fijación o la inclusión, hay que evitar dañar a la molécula que queremos detectar porque de otra manera resultara en falsos negativos, es decir, no tener tinción cuando en realidad la molécula de interés está presente en el tejido, aunque deteriorada. Para detectar la molécula que queremos mostrar, a veces, es necesario realizar pasos previos a la reacción histoquímica, por ejemplo usando un fijador adecuado, ya que de otra manera no reaccionará con los reactivos químicos. Podemos dividir las técnicas histoquímicas en: reacciones químicas e histoquímica enzimática. Daniel Íncera Fernández [email protected]

Las reacciones químicas consisten en la modificación química de moléculas del tejido para poder colorearlas. Existen técnicas histoquímicas para detectar glúcidos, proteínas y nucleótidos. La técnica histoquímica mas empleada es la reacción de PAS (Periodic Acid Schi). Se utiliza para la detección de hidratos de carbono, libres o conjugados, en los tejidos cuando están en cantidades relativamente grandes. Una de las ventajas de la tinción histoquímica PAS es su capacidad de discriminación de tipos de glúcidos con pequeñas modificaciones de la técnica (ver figura 4). La histoquímica enzimática o histoenzimología se fundamenta en la capacidad que tienen algunos enzimas del tejido de mantener funcional su centro activo tras el proceso de fijación. Estos enzimas y las células que los poseen se ponen de manifiesto mediante una reacción enzimática que convierte a unos sustratos solubles e incoloros en productos insolubles y coloreados. Los sustratos son específicos para el enzima y los productos se depositan en el lugar preciso, donde se localiza el enzima.

Figura 4: Tinción con hematoxilina-eosina (izquierda) y PAS-hematoxilina (derecha) de las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se observan células caliciformes teñidas de rosado con la técnica de PAS por su alto contenido en mucopolisacáridos, mientras que en una tinción general aparecen transparentes.

Las enzimas que se pueden detectar son variadas como las peroxidasas, fosfatasas, deshidrogenasas, diaforasas, acetilcolinesterasa, etcétera. Cuando queremos detectar una actividad enzimática no debemos incluir el material para obtener secciones puesto que la deshidratación y la temperatura elevada pueden dañar la conformación de la enzima. Por ello estas técnicas se realizan normalmente en secciones obtenidas por congelación o con el vibratomo. Daniel Íncera Fernández [email protected]

BIBLIOGRAFÍA

• Gómez de Ferraris, Campos Muñoz. (2009) Histología, Embriología e Ingeniería Tisular bucodental. (3ª ed). Ed. Médica Panamericana. • Hayat M.A. (2000). Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. Cambridge University Press. (4ª edición). New York. • Kiernan, J.A. (2002) Histological and histochemical methods: theory and practice Arnold Publisher. (3ª edición). London. • Montuenga Badía, L., Esteban Ruiz, F.J., Calvo González, A. (2009). Técnicas en Histología y Biología Celular. Elsevier Masson. Barcelona.

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