Viruela Aviar 3v2p71

Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Christian Yetiani García Alvarado

Asignatura: Virología y enfermedades virales en los animales domésticos.

Presentación de virosis: Viruela aviar (Avipoxvirus)

TRABAJO ESCRITO

Métodos de estudio de la enfermedad viral Nombre: Viruela aviar

Sinonimias: Difteria aviar; difteroviruela; epitelioma contagioso de las aves; enfermedad de Kikuth; bullas; pepilla; variole aviaire [Fr.]; bouba aviaria [Port.]; Geflugelpocken [Ger.]; virula aviar y variola gallinarum.

Historia Durante más de 2000 años, la viruela se consideró como una enfermedad mortal, ya que de los contagiados con este virus, del 20 al 30% de la población moría. La característica fundamental de esta enfermedad, en humanos, era la aparición de eritemas que estaban acompañadas por fiebre y malestar general. La susceptibilidad era mayor en niños y adultos mayores, y en los sobrevivientes, se presentaban secuelas en las que se incluyes marcas en la cara y en pocos casos, la ceguera. Su origen se remonta principalmente en la India y en Asia Occidental, ya que en documentos del siglo VI a.C., se encontró que los chinos trataron la viruela humana con la inoculación. En otros documentos, se le atribuye el mérito a una monja budista, contemporánea a la época que reinaba Jen Tsung, en la que ella recomendaba la selección de costras con un mes de aparecidas y en lugares en donde el clima es caliente; estas costras se mesclaban con un tipo específico de planta la cual se introducía en la nariz con un tubo curveado de plata. Y en más textos de la época, se incluían hasta cuatro formas de

inoculación. Tiempo antes de Jenner también se usaban pulgas blancas de la vaca para la prevención de la viruela, las cuales se hacían crecer en un polvo blanco y se hacían píldoras con ellas, lo cual quizá fueron de los primeros intentos de inmunización mediante la ingestión oral. En 1774, en Yeminster, Inglaterra, un ordeñador de vacas llamado Benjamin Jesty, inmune a la viruela después de haberla contraído de la viruela de la vacas, inoculo a su esposa e hijo a partir de vacas infectadas para escapar de la enfermedad, por lo cual estuvieron protegidos por 15 años. Posteriormente Jenner reconocería que esta experiencia de Jesty le sirvió de inspiración para sus posteriores trabajos. En 1796, Jenner inoculo a un niño de 8 años, James Phipps, con el virus de la viruela vacuna aislado de la mano infectada de Sarah Nelmes, un ordeñadora. En este experimento, Jenner demostró que este niño fue resistente al reto con el virus de la viruela humana. A partir de esos momentos, el procedimiento se conoció como vacuna. Después ese virus fue sustituido por el virus vaccinia, el cual producía una reacción más leve en el sitio de inoculación. Con la práctica de esta técnica, el último caso endémico de viruela humana que se registro fue en 1977, y en 1979, la Asamblea de la Organización Mundial de la Saluddeclaro la erradicación de la viruela humana y recomendó la eliminación de la vacunación contra su gente. En el caso de la viruela aviar se ha observado durante mucho tiempo en varias especies aviares. El término viruela aviar incluyen inicialmente todas las infecciones por virus de la viruela de las aves, pero ahora se utiliza principalmente para referirse a la enfermedad en aves comerciales. Inicialmente, Woodruff y Goodpasture presentaron evidencia de que las partículas del virus (cuerpos Borrell) dentro de los cuerpos de inclusión (cuerpos de Bollinger) eran el agente etiológico de la viruela aviar. Más tarde, Ledingham y Aberd demostraron que los antisueros producidos contra Avipoxvirus después de la vacunación o después de la recuperación de la infección aglutinaban una suspensión de cuerpos elementales de la viruela aviar.

Etiología Los viriones de los poxvirus son pleomorfos, típicamente en forma de ladrillos (220-450 nm x 140-260 nm) con una superficie irregular que proyecta estructuras globulares o tubulares, las cueles tienen un arreglo en forma de bola de estambre. La capa exterior del virion encierra un núcleo con forma de mancuerna y dos cuerpos laterales. No tienen una nucleocápside isométrica conforme a cualquiera de simetría icosaédrica o helicoidal que se encuentra en la mayoría de los otros virus, por lo que los poxvirus se dice que tienen una estructura "compleja". Los viriones que se liberan de las células por gemación, en lugar de por ruptura celular, tienen una envuelta adicional que contiene los lípidos celulares y varias proteínas codificadas por el virus. El genoma de los poxvirus consiste en una molécula de ADN de doble hebra con un tamaño aproximado de 260 a 365 kpb. Los poxvirus más de 200 genes en su genoma, y hasta 100 de ellos codifican para proteínas que contienen en los viriones. Muchas de esas proteínas son enzimas involucradas en la síntesis de ácidos nucleicos y componentes estructurales. Ejemplo de ellos son la ADN polimerasa, ADN ligasa, RNA polimerasa, enzimas involucradas en la nivelación y poliadenilacion de los ARNm y la timidin cinasa. Los genomas de los de los Poxviridae incluyen un número considerable de proteínas destinadas a contrarrestar la respuesta inmune del huésped. La replicación del virus ocurre predominantemente, pero no exclusivamente, en el citoplasma. Para lograr la independencia del núcleo de la célula, a diferencia de otros virus ADN, ellos codifican enzimas para la replicación y trasncripcion del genoma vírico. La replicación comienza después de la fusión de la envoltura extracelular del virion con la membrana plasmática, y el núcleo del virus se libera en el citoplasma donde se “desencapucha”. La transcripción se caracteriza por una cascada en la que la transcripción de cada clase de genes temporales (genes “tempranos”, “intermedios” y “tardíos”) requiere la presencia de factores de transcripción específicos que son transcribidos de los genes de clase temprana. Los factores de transcripción de los genes intermedios son codificados por los genes tempranos y los tardíos son codificados por los genes intermedios. La transcripción es iniciada por las transcriptasas virales y otros factores

acarreadores del núcleo del virion que esta mediados por la producción de ARNm minutos después de la infección. Estas primeras transcripciones se sintetizan a partir ambas cadenas de ADN, y se extruye a partir de la partícula del núcleo del virus antes de la traducción por los ribosomas de la célula huésped. Las proteínas producidas por la traslación de estos ARNm completan el desencapuchamiento del núcleo y la trascripción de más de 100 de sus genes, y todo esto ocurre antes de la síntesis viral de ADN. Entre las proteínas tempranas se incluyen la ADN polimerasa, la timidin cinasa, y otras varias enzimas necesarias para la replicación del genoma, algunas otras enzimas requiere una modificación post-transicional por escisión proteolítica, glucosilacion, etc. La síntesis de las macromoléculas del huesped son inhibidas por la producción de proteínas virales. La replicación del virus de la viruela implica la síntesis de compuestos intermedios concatemérica largos, que son posteriormente ligados. Con el inicio de la replicación del ADN hay un cambio dramático en la expresión génica. Con la transcripción de los genes intermedios y tardíos, se controla la transcripción, mediante la unión de las proteínas virales específicas para las secuencias de promotores en el genoma viral. Algunos de los primeros factores de trascripción de genes se realizan al final de la infección, empaquetándolas en los viriones, y se utilizan en la posterior ronda de infecciones. Porque los viriones de poxvirus se componen de un gran número de proteínas, no es de extrañar que el ensamblaje del virus sea un proceso complejo que requiere varias horas para ser completado. La formación del virión implica la coalescencia del ADN dentro del núcleo en estructuras inmaduras en forma de media luna, que luego maduran mediante la adición de capas de revestimiento exterior. La replicación y el ensamblaje se producen en sitios discretos dentro del citoplasma (llamado viroplasma o fábricas virus) y los viriones son liberados por gemación (viriones envueltos), por exocitosis o por lisis celular (viriones no envueltos). La mayoría de los viriones no están envueltos y son liberados por lisis celular. Ambos viriones, envueltos y no envueltos son infecciosos, pero aparentemente infectan células por diferentes vías; los viriones envueltos son absorbidos por las células más fácilmente y parecen ser más importante en la propagación de los viriones a través del cuerpo del animal.

El tropismo de los Poxvirus puede no ser dependiente de receptores específicos de la superficie celular, sino más bien en la capacidad de una célula dada para proporcionar factores que complementan intracelulares necesarias para la replicación del virus productiva, y en la capacidad del virus específico para manipular con éxito redes de señalización intracelular que regulan procesos celulares antivirales después de la entrada del virus. Los Avipoxvirus tienen grandes genomas que les permiten expresar colecciones únicas de las proteínas virales que actúan como factores del huésped, que se dirigen específicamente y manipular las vías de señalización del huésped para establecer las condiciones celulares óptimas para la replicación viral. Sin embargo, en algunas células, especialmente células de mamífero, la replicación de los avipoxvirus está bloqueada. Esto puede ser debido a la capacidad de los avipoxvirus para activar específicamente las vías de señalización o mediadores, por ejemplo, las vías de interferón, en esas células. El papel de los mediadores e inmunopatología de los avipoxvirus es complejo y no se entiende bien. Sin embargo, teniendo en cuenta los numerosos pasos implicados en la morfogénesis de los avipoxvirus, es importante tener en cuenta que estos virus inducen varios mediadores que les permiten sobrevivir e interactuar con las células huésped. Algunos mediadores potenciales han sido identificados y están en espera de una caracterización funcional adecuados. La actividad de las proteínas inmunomoduladoras son diversas, en las que se incluyen inhibidores del complemento y de la proteasa sérica, proteínas que modulan la actividad de la quimiocinas y citosinas, y las que se destinen específicamente a las vías inmunológicas innatas como complejo receptor de señalización tipo toll y la resistencia antiviral inducida por interferón. También codifican proteínas inmunomoduladoras que inhiben la migración de los leucocitos en áreas de infección o daño.

Epizootiología Virus de la viruela aviar infectan a las aves de ambos sexos y todas las edades y razas. La enfermedad ha sido reportada en más de 200 especies de aves. La viruela aviar en aves comerciales, es de distribución mundial. La incidencia, sin embargo, es variable. En áreas de alta densidad donde las aves de edad variada se crían bajo condiciones de confinamiento, la enfermedad tiende a persistir durante un largo tiempo a pesar de aplicar las vacunas preventivas. En los últimos años, varios brotes de la forma diftérica de la viruela aviar se han encontrado con anterioridad en parvadas de pollos vacunados. Infección por virus de la viruela se produce a través de la transmisión mecánica del virus a la piel lesionada o lacerada. Las personas que manipulan las aves en el momento de la vacunación pueden llevar el virus en sus manos y la ropa, y sin saberlo, pueden depositar el virus a los ojos de las aves susceptibles. Los insectos también sirven como vectores mecánicos del virus, lo que resulta en la infección ocular. El virus puede llegar a la región de laringe a través del conducto lagrimal para causar la infección del tracto respiratorio superior. En un ambiente contaminado, el aerosol generado por las plumas y costras secas que contienen partículas de virus de la viruela proporciona condiciones adecuadas para la infección cutánea y respiratoria. Las células de la mucosa del tracto respiratorio superior y la boca parecen ser altamente susceptibles al virus ya que puede producirse la iniciación de la infección en ausencia de trauma o lesión aparente. La detección de las lesiones sólo en los pulmones, en ausencia de otras zonas afectadas es sugestiva de infección por aerosol. Un homólogo de T10, que se expresa específicamente a altos niveles en las células epiteliales de las vías respiratorias, es codificado por un gen presente en el genoma de la viruela aviar. Su presencia puede estar relacionada con la función del intervalo del hospedador. Los mosquitos pueden infectar a un número de diferentes especies de aves después de una única alimentación en un ave infectada con el virus de la viruela aviar. Once especies de Diptera se han reportado como vectores de virus de la viruela aviar. El ácaro, Dermanyss gallinae, se ha implicado en la propagación de viruela aviar. En algunas parvadas, el virus puede persistir durante períodos prolongados. Esto es común en grandes complejos de edades variadas. En un estudio experimental, Duran-Reynals y

Bryan mostraron que el tratamiento cutáneo de los pollos y palomas con metilcolantreno activa una infección latente del virus de la viruela aviar. Tasa de morbilidad de la viruela en los pollos y pavos varía de unas pocas aves infectadas están a la participación de todo el rebaño si un virus virulento está presente y no se toman medidas de control. Las aves afectadas con la forma cutánea de la enfermedad son más propensas a recuperarse que aquellas con la forma diftérica en la se infecta la mucosa oral y el tracto respiratorio. Efectos de la viruela en los pollos suelen implicar emaciación y abaja de peso, la producción de huevos está temporalmente retrasada si las aves están infectadas. El curso de la forma cutánea leve de la enfermedad es de aproximadamente 3-4 semanas, pero si las complicaciones son constantes, la duración puede ser considerablemente más larga. Con cepas virulentas del virus de la viruela aviar, ambas lesiones cutáneas primarias y secundarias pueden persistir durante más de 4 semanas. En tales casos, las lesiones cutáneas alrededor de los ojos o lesiones diftéricas en la boca y el tracto respiratorio superior interfieren con las funciones normales que resultan en una mortalidad significativa. En los pavos, el retardo en el desarrollo del crecimiento de las aves de mercado es de mayor importancia financiera de la mortalidad. Si se produce la viruela de las aves de cría, puede resultar en la disminución de la producción de huevos y la alteración de la fertilidad puede. En infecciones leves sin complicaciones, el curso de la enfermedad en una parvada puede ser de 2-3 semanas. Brotes severos suelen durar 6, 7 o incluso 8 semanas. La mortalidad en parvadas de pollos y pavos es generalmente baja, pero en casos graves puede ser alto. En las palomas y los psitácidos, las tasas de morbilidad y mortalidad son similares a los de los pollos. La viruela aviar en canarios pueden causar una mortalidad de hasta 80-100%. Una mortalidad significativa se ha observado en la codorniz infectada con el virus de la viruela de codorniz.

Patogenia Muchos de los de los Poxvirus estimulan la síntesis de ADN en las células epiteliales del huésped, dando como resultado la hiperplasia del epitelio afectado. Los Avipoxvirus no pueden penetras epitelios intactos. Las lesiones traumáticas pueden ser generadas por insectos hematófagos, lo cual pueden generar un daño suficiente en la barrera epitelial. La infección puede ser restringida por las puertas de entrada o viremia y por una subsecuente distribución a los órganos de mayor daño. Los factores que controlan el tipo de infección todavía no son determinados, sin embargo, se conoce que la enfermedad grave generalizada ocurre solamente en infecciones de dos ciclos

Replicación en la puerta de entrada

Viremia primaria

Distribución a hígado y medula ósea

Replicación (puede matar al huésped, especialmente canarios)

Viremia secundaria

Enfermedad clínica generalizada

Este ciclo de replicación sólo se produce con cepas patógenas, y la viremia secundaria no se produce con cepas no patógenas, poco patógenas o cepas de vacuna de virus vivos modificados. Estas cepas inducen generalmente una infección restringida al sitio de inoculación. La infección por el virus de la viruela aviar, especialmente en parvadas puede estar latente durante años. Los factores no específicos que causan el estrés están asociados con la reactivación viral. Se ha sugerido que la infección latente del virus (incluyendo cepas vacunales) puede ser transmitida al huevo (y finalmente al producto final) la cual produce una inmunodepresión que puede potencializar infecciones secundarias.

Periodo de incubación El período de incubación de la enfermedad natural varía de cerca de 4-10 días en pollos, pavos y palomas y de 4 días si se trata de canarios.

Patología Viruela seca: La lesión característica de la forma cutánea de la viruela en pollos es una hiperplasia epitelial locales afecta a la epidermis y folículos de las plumas subyacentes, con la formación de nódulos que primero aparecen como pequeños focos blanco y, a continuación aumentan de tamaño rápidamente y se vuelven amarillas. En pollos infectados por vía intradérmica, algunas lesiones primarias aparecen en el cuarto día. Las pápulas son formadas por el quinto o sexto día. Esto es seguido por la etapa

vesicular, con la formación de extensas lesiones gruesas. Lesiones adyacentes pueden unirse y llegar a ser áspero y de color gris o marrón oscuro. Después de aproximadamente 2 semanas o a veces antes, las lesiones tienen zonas de inflamación en la base y se convierten en hemorrágico. La formación de una costra, que puede durar durante otras 1-2 semanas, termina con la descamación de la capa epitelial degenerado. Si la costra se retira temprano en su desarrollo, existe un suelo húmedo, exudado seropurulento debajo que cubre una superficie de granulación hemorrágica. Cuando la costra cae de forma natural, una cicatriz lisa puede estar presente, en los casos leves, puede haber ninguna cicatriz notable. Virus de la vacuna atenuadas producen lesiones localizadas, que son moderadas en comparación con las graves los debido a las cepas patógenas. Las lesiones secundarias producidas por cepas patógenas pueden persistir durante varias semanas.

Viruela húmeda o diftérica: En la forma diftérica, hay nódulos opacos blancos o manchas amarillentas ligeramente elevadas que se desarrollan en las membranas de las mucosas de la boca, el esófago, la lengua, o la tráquea superior. Los nódulos aumentan rápidamente de tamaño y, a menudo se unen para convertirse en una membrana amarilla, caseosa, necrótica, pseudodifteritica o diftérica. Si se eliminan las membranas, dejan erosiones hemorrágicas. El proceso inflamatorio puede extenderse dentro de los senos paranasales, de manera particular en la sinusitis infraorbitaria (resultando de la hinchazón) y también en la faringe y la laringe (que resulta en alteraciones respiratorias) y el esófago. No es raro encontrar infección cutánea que se caracteriza por el desarrollo de lesiones en las crestas y barbillas así como lesiones diftéricas en la boca y / o del tracto respiratorio de la misma ave. A menudo, la participación de los ojos y los párpados puede acompañar la formación de lesiones en otras áreas de la piel, así como en las lesiones diftéricas.

Forma septicémica: Hay un inicio agudo con plumaje erizado, somnolencia, cianosis y anorexia, característico de la enfermedad septicémica de la infección por el virus. Muchas aves (mortalidad del 70-99%) mueren simplemente con tres días después de desarrollar los signos clínicos. Las lesiones cutáneas son raras y la documentación antemortem de la infección por el virus es muy difícil. Las infecciones septicémicas ocurren comúnmente más en canarios y pinzones. La viruela del canario causa frecuentemente una neumonía descamativa con oclusión de los capilares aéreos, desarrollando una disnea. Los signos clínicos pueden desarrollarse por meses y la muerte puede ser causada por la etapa exhaustiva crónica del animal. Se ha sugerido, pero no se ha probado que hay una masiva proliferación inducida de las células del intersticio mesénquimal, lo cual puede causar cambios neoplásicos. Las lesiones postmortem en canarios afectados son focos neumónicos pequeños y hemorragias, con una degeneración de la grasa en hígado y una yeyunitis. Tumores: Algunas cepas de Avipoxvirus tienen propiedades oncogénicas. Los eriformes y los Columbiformes que sobreviven a la enfermedad tienden a la formación de tumores. Son de rápido crecimiento, con forma de coliflor y forman huecos en el epitelio normal y hemorragias cuando se transforman. Los cuerpos de Bolloinger están usualmente presentes en el tejido neoplásico pero no se ha demostrado que el virus de las inclusiones sea viable. La remoción quirúrgica de los tumores de la piel es una efectiva terapia.

Signos clínicos La formación de costras en las zonas carentes de plumas (cresta, barbillas, parpados, comisura de los picos y tarsos); reducción del consumo de alimento y agua; reducción del crecimiento, baja en la producción de huevo.

Puede presentarse disnea, lagrimeo, conjuntivitis, blefaroconjuntivitis, adhesión palpebral e irregularidad en los bordes de los parpados. Los signos más severos de la enfermedad es probable que reflejen la más reciente introducción del virus a un nuevo hospedero.

Diagnostico 1. Identificación del agente El virus de la viruela aviar se multiplica en el citoplasma de las células epiteliales formando grandes cuerpos de inclusión intracitoplásmica (cuerpos de Bollinger) que contienen cuerpos elementales más pequeños (cuerpos de Borrel). Las inclusiones se pueden demostrar en los cortes de lesiones cutáneas y diftéricas utilizando tinción con hematoxilina y eosina (H&E), con naranja de acridina o con Giemsa. Los cuerpos elementales se pueden detectar en los frotis de lesiones, por ejemplo, por el método de Giménez (18) que se describe más adelante. Se puede utilizar la microscopía electrónica para demostrar las partículas víricas con morfología típica de los poxvirus, mediante la tinción negativa o en cortes ultrafinos de tejidos infectados (3). a) Técnica de frotis para la viruela aviar i) Se coloca en un porta limpio una gota de agua destilada y la lesión (cutánea o diftérica). Se prepara un frotis fino presionando la lesión con otro porta limpio y rotando varias veces el porta superior. ii) Se seca al aire y se fija el frotis con cuidado a la llama. iii) Se tiñe el frotis durante 5–10 minutos con un colorante recién preparado (8 ml de solución stock1 de fucsina básica mezclada con 10 ml de tampón fosfato2, pH 7,5, y filtrado por papel de filtro Whatman número 1).

iv) Se lava cuidadosamente con agua del grifo. v) Se colorea para tinción de contraste con verde malaquita (0,8% en agua destilada) durante 30– 60 segundos. vi) Se lava el frotis con agua del grifo y se seca a continuación. vii) Se examina el frotis con aceite de inmersión. Los cuerpos elementales aparecen rojos y de un tamaño aproximado de 0,2–0,3 μm. b) Aislamiento del virus El virus de la viruela aviar se puede aislar inoculando el material sospechoso en huevos embrionados. Se inoculan la membranas corioalantoideas (MCA) de embriones de pollo de 9–12 días de desarrollo con aproximadamente 0,1 ml de suspensión del tejido cutáneo o de la lesión diftérica con la concentración adecuada de antibióticos. Los huevos se incuban a 37°C durante 5–7 días y después se examinan para observar la aparición de focos blancos de lesiones o un engrosamiento generalizado de las MCA. El examen histológico de las lesiones en la MCA revelará cuerpos de inclusión intracitoplásmicos y eosinófilos tras la tinción con H&E (19, 22). Para propagar el virus de la viruela aviar, también pueden utilizarse fibroblastos primarios de embrión de pollo, células renales de embrión de pollo, células dérmicas de embrión de pollo o la línea celular permanente QT35 de codorniz (6, 10). La adaptación de las cepas de virus a los cultivos celulares es un requisito importante para la formación de placas o calvas, y no todas las cepas formarán placas inicialmente. c) Métodos moleculares El análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) puede utilizarse para comparar los aislamientos naturales y las cepas vacunales del virus de la viruela aviar. Sin embargo, este procedimiento no se utiliza para el diagnóstico rutinario.

Los fragmentos genómicos clonados del virus de la viruela aviar se pueden emplear con eficacia como sondas de ácido nucleico para el diagnóstico. El ADN vírico aislado de lesiones puede detectarse por hibridación con sondas genómicas, marcadas radioactivamente o sin marcar. Este método es especialmente útil para diferenciar infecciones de viruela aviar y de laringotraqueitis cuando se presentan lesiones traqueales. Las secuencias genómicas de ADN de varios tamaños se pueden ampliar utilizando cebadores específicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica es útil cuando solo se dispone de una cantidad muy pequeña de ADN vírico en la muestra. 2. Pruebas serológicas Aunque en las infecciones por poxvirus tanto la inmunidad mediada por células (IMC) como la inmunidad humoral desarrollan un papel importante, no resulta conveniente utilizar rutinariamente las pruebas de la IMC. Por tanto, se usan pruebas serológicas para medir la respuesta de anticuerpos humorales específicos, del tipo de la neutralización vírica (NV), inmunodifusión en gel de agar (IGDA), hemaglutinación pasiva y las pruebas con anticuerpos fluorescentes así como los enzimoinmunoensayos. La evidencia de una inmunización favorable por la vacuna se puede demostrar examinando una bandada a los 7–10 días de la vacunación para “tomas”. Una toma consiste en un hinchamiento de la piel o una costra en el sitio de inoculación de la vacuna, y su presencia denota una inmunización acertada. a) Neutralización vírica Después de la interacción entre el virus y el suero, la actividad de los virus residuales puede probarse en huevos embrionados o en cultivos celulares. Esta prueba es técnicamente exigente y puede no resultar conveniente para el diagnóstico de rutina. Solo unas cuantas cepas de virus tienen capacidad para formar placas en células de embrión de pollo. Los anticuerpos neutralizantes aparecen a las 1–2 semanas de la infección.

b) Inmunodifusión en gel de agar Los anticuerpos precipitantes se pueden detectar haciendo reaccionar los sueros con los antígenos víricos. El antígeno puede derivar de lesiones de piel infectada o de lesiones de MCA después de la sonicación y homogenización, así como de los cultivos celulares infectados tratados como se describe más adelante en la sección B.2.f. Se centrifuga la suspensión lisada y el sobrenadante se utiliza como antígeno. El medio de difusión se prepara con 1% de agar, 8% de cloruro sódico y 0,01% de tiomersol. El antígeno vírico se coloca en el pocillo central y los sueros problema en los pocillos periféricos. Es importante incluir un control de suero negativo y otro de suero positivo. Las placas se incuban a temperatura ambiente y las líneas de precipitación aparecen a las 24–48 horas después de la incubación del antígeno con el anticuerpo contra cepas homólogas o estrechamente relacionadas. La prueba es menos sensible que el ELISA o que la prueba de la hemaglutinación pasiva. c) Hemaglutinación pasiva Los eritrocitos de oveja o de caballo se sensibilizan con un antígeno parcialmente purificado de la viruela aviar (20). El antígeno se prepara de las MCA infectadas o de células como se describe más adelante en la sección B.2.f. La hemaglutinación pasiva es más sensible que la IGDA. La prueba origina reacciones cruzadas entre los poxvirus aviares. d) Pruebas de inmunofluorescencia Las pruebas de inmunofluorescencia directa o indirecta revelan una fluorescencia intracitoplásmica específica en las células infectadas. La prueba indirecta es de uso común y consta de dos pasos: el anticuerpo contra el virus de la viruela aviar reacciona primero con el antígeno en las células infectadas y después con un anticuerpo secundario marcado con isotiocianato de fluoresceína contra la gammaglobulina de pollo (por ejemplo, suero antipollo obtenido en cabra). Estos anticuerpos marcados están comercializados.

A este respecto, para pruebas con anticuerpos fluorescentes se pueden utilizar con eficacia los cortes de tejidos fijados con formalina. e) Inmunoperoxidasa La tinción específica de las inclusiones citoplásmicas es el resultado de la reacción de un anticuerpo policlonal específico contra la viruela aviar, que está conjugado con peroxidasa de rábano, y los cortes hidratados de tejidos (MCA o piel) o de cultivos fijados e infectados con viruela aviar. Se obtienen resultados similares cuando se utilizan anticuerpos policlonales o monoclonales en una prueba indirecta. Una ventaja de la técnica es que los cortes se pueden observar por microscopía de luz visible y se pueden guardar durante mucho tiempo sin pérdida de color (19). f) Enzimoinmunoensayo Se han elaborado pruebas de ELISA para detectar anticuerpos humorales contra el virus de la viruela aviar. Son capaces de detectar anticuerpos 7–10 días después de la infección, pero estas pruebas todavía no se han comercializado. Los antígenos del virus de la viruela aviar se preparan de monocapas de células QT-35 infectadas, o de lesiones de MAC. Las células QT infectadas se precipitan (700 g durante 10 minutos a 4°C), se lavan con tampón isotónico (Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, etilén diamino tetra-acético [EDTA] 5 mM), y se lisan en tampón hipotónico (Tris 10 mM, pH 8,0, KCl 10 mM, EDTA 5 mM) con Triton X-100 al 0,1% y betamercaptoetanol al 0,025%. Los núcleos y los restos celulares se eliminan por centrifugación a baja velocidad (500 g durante 5 minutos a 4°C) y el sobrenadante se utiliza como fuente de antígenos del virus de la viruela aviar para la ELISA o para la inmunotransferencia. Para aislar antígeno vírico de las lesiones de MCA, se necesita una dispersión inicial de las lesiones mediante tratamiento con detergentes como se describió anteriormente. También se ha empleado

como antígeno el virus propagado en fibroblastos o en células dérmicas de embrión de pollo. La preparación del antígeno es como la descrita para las células QT. Los pocillos de la placa de microtitulación se antigenizan con 1 μg de antígeno soluble vírico de la viruela aviar en 100 μl de tampón de recubrimiento (Na2CO3 15 mM, NaHCO3 35 mM, pH 9,6) y se incuban durante toda la noche a 4°C (2, 19). Cada pocillo se lava después una vez con solución de lavado (NaCl 0,29 M, Tween 20 al 0,05%) y se bloquea con una solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4), que contenga 3% de seroalbúmina bovina (BSA), durante 1 hora a 37°C. Después de un lavado, se añaden a los pocillos diluciones seriadas de los sueros problema en PBS con 1% de BSA. Tras agitar durante 2 horas a 37°C, los pocillos se lavan tres veces antes de añadir 100 μl/pocillo de anticuerpos IgG (H+L) anti-pollo obtenidos en cabra conjugados con peroxidasa de rábano3, a una dilución recomendada en PBS. Después de 2 horas de incubación a 37°C y tres lavados posteriores, se añaden a cada pocillo 100 μl del substrato de la peroxidasa TBM3. Las reacciones se terminan por adición de ácido fosfórico 1 M y se registra la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de placas ELISA4. g) Inmunotransferencia Las variaciones antigénicas que ocurren entre las cepas del virus de la viruela aviar pueden determinarse por medio de inmunotransferencia. En este método, los antígenos se separan por SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico) y reaccionan con anticuerpos policlonales o monoclonales contra el virus de la viruela aviar (6, 12, 14). Este método no es conveniente para el diagnóstico rutinario.

Pronostico El pronóstico es favorable para las aves de mayor edad y que cursan con la viruela seca, ya que las secuelas cursan con simple marcas o cicatrices que no tienen ningún problema. Las aves de menor edad y las que tienen mayor edad y que cursan con la viruela diftérica, su pronóstico es malo, ya que las aves de pequeña edad llegan a morir, y en las aves que cursan con la viruela diftérica mueren por la dificultad para poder comer o respirar debido a los daños que se producen en la tráquea.

Tratamiento No existe un tratamiento específico para las aves infectadas con el virus de la viruela aviar. Pero en el caso de aves con gran valor, ya sea genético o comercial se recomienda el tratamiento con la istración de vitamina A en forma de suplementos de vitaminas solubles en agua. Este tratamiento se deberá repetir durante 3 semanas cada mes. Además, el tratamiento antibiótico sistémico con enrofloxacina se aplicó de forma continua durante 10 ó 14 días en aves de mayor edad, y trimetoprim sulfametoxazol en aves jóvenes. Nistatina 1 mL/300 g se istra cada 12 horas durante 7 días. Las lesiones alrededor de los ojos fueron tratadas por la limpieza de las heridas y la aplicación de agentes antimicrobianos tópicos seguros.

Control La forma más efectiva para evitar los problemas de viruela aviar es a través de la aplicación de la vacuna. La inmunización es realizada a través de la aplicación de la vacuna en donde son utilizados dos tipos de virus:  Virus de la viruela aviar atenuado (virus homologo)  Virus de la paloma (virus heterologo) Ambas con una reacción suave e inmunidad adecuada. Las dos vacunas pueden ser usadas en pavos, gallinas y pichones. Existe inmunidad cruzada, pero es recomendable que se apliquen la correspondiente a la especie. Estas vacunas comúnmente son aplicadas vía punción en el ala, pero también se pueden aplicar vía subcutánea. En el caso de los pavos es aplicada a través de una escarificación en el muslo. En el caso de las palomas se pueden usar ambas vías con éxito. La vacunación se puede efectuar desde el primer día hasta la sexta semana. En el pollo de engorda se puede aplicar una sola vacuna pero en pollas de reposición, es necesaria la revacunación entre las 8 y 10 semanas. En las zonas de alto riesgo se puede aplicar una vacuna entre 16 a 18 semanas. Es necesario el monitoreo de algunas aves tomadas al azar para observar la reacción post-vacunal en el sitio de la aplicación. Las medidas de higiene y control de vectores (mosquitos, ácaros, piojos y moscas), que son parte de la bioseguridad son importantes en la prevención de viruela aviar. Es importante que las vacunas contengan 10 TCID50 de virus. También puede combinarse la vacuna de la viruela aviar con virus vacuna de Newcastle y/o Marek, pero usualmente esta vacunación se debe dar mediante vía parenteral.

Profilaxis La resistencia al tratamiento éter está catalogada como uno de los criterios taxonómicos de virus de la viruela. Mientras que algunos autores afirmaron que el virus era sensible tanto a éter y cloroformo, otros informaron de que un virus de la viruela de las palomas y dos mutantes derivados fueron resistentes a ambos cloroformo y éter. El virus de la viruela aviar se conoce para soportar 1% de fenol y 1:1000 formalina durante 9 días, pero se inactiva por 1% potasa cáustica cuando es liberado de su matriz. El calentamiento a 50 ° C durante 30 minutos o 60 ° C durante 8 minutos también inactiva el virus. La tripsina no tiene ningún efecto sobre el ADN o virus entero. Cuando desecado, el virus muestra una marcada resistencia. Puede sobrevivir en costras secas durante meses o incluso años. Debido a su estabilidad genética e inherente, el virus de la viruela aviar puede persistir en costras en el entorno de las aves de corral y se convierten en una fuente de infección para las aves jóvenes susceptibles de reemplazo. La mayor frecuencia de la enfermedad es tal vez debido al confinamiento muy cercano de los pollos, especialmente en grandes complejos de múltiples edades. Tales condiciones incluyen la oportunidad para la transmisión de la enfermedad a partir de un ave a otra, así como a través de aerosoles. Primer encierro y casas sucias aumentan la posibilidad de propagación de la enfermedad.

Salud pública La viruela aviar no es de importancia para la salud pública. No causa la infección productiva en especies de mamíferos. Sin embargo, un virus de la viruela aislado a partir de un rinoceronte por Mayr y Mahnel se caracterizó como el virus de la viruela aviar.

Reglamentación oficial “ACUERDO mediante el cual se enlistan las enfermedades y plagas de los animales, exóticas y endémicas de notificación obligatoria en los Estados Unidos Mexicanos.” Artículo 4o.- El grupo 3 está constituido por aquellas enfermedades que se encuentran presentes en territorio nacional consideradas como enzoóticas pero que representan un menor riesgo desde el punto de vista epidemiológico, económico, de salud pública y de comercio nacional e internacional son de notificación mensual obligatoria a las autoridades competentes de sanidad animal del país, siendo las siguientes:

2) AVES ANEMIA INFECCIOSA DE LAS AVES (Gyrovirus); BRONQUITIS INFECCIOSA (Coronavirus cepas Connecticut y Massachusetts); CLOSTRIDIOSIS (Clostridium spp); COCCIDIOSIS (Eimeria spp); COLERA AVIAR (Pasteurella multocida); CORIZA AVIAR (Avibacterium paragallinarum); ENCEFALOMIELITIS AVIAR (Enterovirus); ENFERMEDAD DE GUMBORO (Alvibirnavirus); ENFERMEDAD DE MAREK (Lyfulphocryptovirus); HEPATITIS CON CUERPOS DE INCLUSION (Adenovirus); LARINGOTRAQUEITIS AVIAR (Gallid herpesvirus 2); LEUCOSIS AVIAR (Oncornavirus); MICOPLASMOSIS AVIAR (Mycoplasma gallisepticum y synoviae); SALMONELOSIS AVIAR (Salmonella spp); TUBERCULOSIS AVIAR (Mycobacterium avium), y VIRUELA AVIAR (Avipoxvirus).

Bibliografía: