Cromatografia 733qb

Cromatografia Un processo cromatografico è un processo di migrazione differenziata di una miscela di sostanze che ha lo scopo di garantire la separazione delle sostanze stesse. In ogni tipo di cromatografia vi sono sempre due fasi distinte immiscibili fra loro ovvero una fase fissa o stazionaria (solida o liquida) con la quale le molecole presenti nella miscela possono interagire e una fase mobile (liquida o gassosa) che ha la funzione di trascinare con sé le componenti della miscela che non si sono legate alla fase fissa.

Un processo cromatografico può essere effettuato su colonna o può essere planare ovvero effettuato su carta o su strato sottile. Le interazioni che si instaurano tra le componenti che ho caricato e fase fissa e fase mobile sono quelle che determinano la migrazione differenziata. Le strutture delle due fasi determinano i meccanismi che governano una determinata separazione cromatografica. Quali sono le basi su cui si deve tenere conto per separare le componenti di una miscela? Bisogna sfruttare le proprietà fisico-chimiche delle sostanze. Quali proprietà? DIMENSIONI; FORMA; CARICA; SOLUBILITA’, FUNZIONE BIOLOGICA.

IDROFOBICITA’,

Cromatografia su colonna classica Le colonne impiegate sono generalmente in vetro e possono essere di varie dimensioni secondo le esigenze. Il riempimento della colonna può essere costituito da materiale solido adsorbente, finemente suddiviso, asciutto e scelto opportunamente in base alla separazione da effettuare (per LSC) oppure la colonna viene riempita con o granulare inerte, generalmente gel di silice, che viene impregnato con solvente opportuno e che costituirà la fase fissa (per LLC) o ancora una resina a scambio ionico per cromatografia ionica.

Il solvente scelto, contenente la miscela da separare, viene fatto eluire attraverso la colonna. I componenti che tendono ad essere trattenuti nella fase stazionaria si muoveranno più lentamente di quelli che tendono a rimanere nella fase mobile, pertanto cui si realizzerà una migrazione differenziale, con separazione dei componenti in bande. Una volta che tutta la soluzione contenente il campione è eluita dalla colonna, si farà scendere solo il solvente che trascina e ridiscioglie le sostanze separate fino a portarle all’uscita della colonna dove verranno raccolte in recipienti separati, per poterne effettuare la determinazione quantitativa.

Battente di liquido

Separazione bande

Recupero soluto 1

Recupero soluto 2

METODI CROMATOGRAFICI PIU’ USATI ADSORBIMENTO RIPARTIZIONE SCAMBIO IONICO GEL-FILTRAZIONE AFFINITA’ INTERAZIONE IDROFOBICA

Cromatografia per Scambio Ionico Nella cromatografia per scambio ionico, la ritenzione si basa sull’attrazione tra gli ioni del soluto e i siti carichi legati alla fase stazionaria. La fase stazionaria è costituita da una resina a scambio ionico, ossia un o organico al quale sono legati dei gruppi ionici o ionizzabili (ad esempio –SO3-, -COO-, -NR3+). I gruppi ionici della resina trattengono per mezzo di interazioni elettrostatiche, controioni di carica opposta che possono essere scambiati con gli ioni presenti nella fase mobile. Il meccanismo di separazione è basato perciò sulla diversa affinità che i diversi soluti (ionici) presentano nei confronti dei gruppi attivi della resina.

Sephadex Sepharose Biogel Sephacril

CROMATOGRAFIA PER INTERAZIONE IDROFOBICA Il processo che interessa questo tipo di cromatografia consiste in deboli interazioni idrofobiche tra le molecole proteiche ed una fase stazionaria che si ottiene legando gruppi non polari ad una matrice di tipo saccaridico. I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d’ acqua ordinate le proteine tendono così ad interagire fra loro (“salting out”). Nella HIC queste regioni così esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici.

Gascromatografia In gascromatografia la fase mobile è un gas che fluisce in una colonna in cui è posta la fase stazionaria (solida o liquida). I meccanismi di separazione dei componenti la miscela sono determinati dalla fase stazionaria, poiché quella mobile funziona solamente da gas di trasporto (carrier). Condizione indispensabile per operare un’analisi gascromatografica su una miscela, è che essa sia in grado di are in fase vapore alla temperatura di lavoro.

Schema a blocchi di un gascromatografo

1) Sistema di alimentazione del carrier (bombola) 2) Sistema di alimentazione dei gas per il rivelatore (bombola) 3) Iniettore 4) Colonna

5) Rivelatore 6) Camera termostatatica 7) Dispositivo per la programmazione della temperatura durante l’analisi 8) Raccolta ed elaborazione dati

Gas carrier: H2, Ne, N2. Colonne: di acciaio o di vetro. Possono avere dimensioni diverse (diametro da 10 cm a 500 mm) e lunghezze mai inferiore a 10 m.

Applicazioni Alcooli Esteri Steroidi Colesterolo

Barbiturati Zuccheri

Cromatografia liquida su colonna Vantaggi

Svantaggi

•Si trattano grandi quantitativi di campione

•Tempi di impaccamento ed esecuzione elevati

•Uso di colonne “usa e getta” per campioni di piccole dimensioni (< 20 ml)

•Fasi stazionarie non riutilizzabili •Impiego di grandi volumi di solvente

Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) L’HPLC rappresenta l’evoluzione strumentale della cromatografia liquida su colonna. Con questa tecnica è possibile fare tutti i tipi di cromatografia: cambiano le colonne che sono di acciaio inossidabile e pre-impaccate dalla ditta produttrice così da sopportare pressioni elevatissime.

Schema di un’apparecchiatura HPLC

Il filtro e la precolonna presenti nel circuito servono ad evitare danneggiamenti della colonna analitica, per l’eventuale presenza di solidi sospesi nel solvente.

Solvente e sostanza in esame ano attraverso la colonna nella quale avviene la separazione. I componenti separati, vengono quindi convogliati nella zona di misura del rivelatore e quindi in un recipiente di raccolta degli scarti. Il segnale prodotto dal rivelatore, opportunamente elaborato, viene registrato.

Le colonne utilizzate permettono tempi di analisi ottimali, hanno un’efficienza elevatissima e un numero di piatti teorici che va dai 30000 ai 40000. CROMATOGRAFIA IN FASE NORMALE (NP-HPLC). Fase fissa: silice (solida) Fase mobile: solvente organico (esano)  acqua Ordine di eluizione: molecole apolari  molecole polari

CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA (RP-HPLC). Fase fissa: catene idrocarburiche (liquida) legate a silice (matrice inerte) Fase mobile: acqua  solvente organico (acetonitrile, metanolo, propanolo) Ordine di eluizione: molecole polari  molecole apolari

Eluizione isocratica e a gradiente

Con 1 solo solvente o con una miscela di solventi di composizione costante.

Variazione continua della composizione del solvente per aumentare la forza eluente. Una forza eluente crescente è necessaria per eluire i soluti più fortemente trattenuti e per migliorare le separazioni.

Iniezione e rivelazione in HPLC:

Rivelatori

•

Sensibilità adeguata al problema

•

Buona stabilità e riproducibilità

•

Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di grandezza

•

Tempi di risposta rapidi

•

Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più classi di soluti Rivelatore

LOD (ng)

Selettività

Utilizzabile in gradiente?

0.1-1

selettivo

SI

Indice di rifrazione

100-1000

generale

NO

Fluorescenza

0.001-0.01

selettivo

SI

Elettrochimico

0.01-1

selettivo

NO

Conduttimetrico

0.5-1

selettivo

NO

Assorbimento IR

1000

selettivo

SI

Spettrometro di massa

0.1-1

generale

SI

Assorbimento UV

Applicazioni Separazione di composti polari quali farmaci e loro metaboliti, peptidi, vitamine, polifenoli, steroidi, oligopeptidi e proteine.