Principi Cromatografia 2b26a

Principi di cromatografia La cromatografia è una tecnica di migrazione differenziata che permette la separazione e il recupero dei costituenti di una miscela di sostanze affini. La cromatografia può essere di tipo ANALITICO O PREPARATIVO

Principi di cromatografia In ogni tecnica cromatografica devono essere identificabili due fasi immiscibili tra di loro :  Una FASE STAZIONARIA solida o liquida  Una FASE MOBILE liquida o gassosa La separazione delle molecole dipende dalle interazioni delle molecole stesse con la fase stazionaria e con la fase mobile.

Principi di cromatografia Fondamento di tutte le tecniche di cromatografia è il COEFFICIENTE di RIPARTIZIONE o di DISTRIBUZIONE

Kd Che descrive il modo con cui un composto si distribuisce tra due fasi immiscibili.

Principi di cromatografia In ogni istante del processo cromatografico ,le sostanze tendono a distribuirsi tra le due fasi in modo specifico . Supponiamo che le condizioni sperimentali permettano il raggiungimento di equilibri dinamici successivi del tipo :

CM

CS

DOVE

CM = concentrazione di una sostanza nella fase mobile CS = concentrazione di una sostanza nella fase stazionaria

Principi di cromatografia A questi equilibri dinamici corrisponde una costante di equilibrio o coefficiente di distribuzione (Kc) :

Kc = CS / CM Che dipende solo dalla natura della fase mobile e della fase stazionaria , oltre che dalla temperatura di lavoro, e quindi è una grandezza termodinamica.

FASE MOBILE KCA > KCB

A+B

FASE STAZIONARIA

Durante l’eluizione le sostanze tendono a separarsi perché A ,più affine alla fase stazionaria, viene trattenuta più a lungo.

FASE MOBILE

A

B

FASE STAZIONARIA

A e B sono separate e danno due bande distinte.

FASE MOBILE

A

B

FASE STAZIONARIA

FASE MOBILE

B raggiunge il limite della fase stazionaria, la parte del componente B disciolta nell’eluente esce dal sistema cromatografico , mentre la parte del componente B nella fase stazionaria si trasferisce rapidamente in quella mobile

A

FASE STAZIONARIA

B

Principi di cromatografia • MECCANISMO PRINCIPALE DI SEPARAZIONE • MECCANISMI SECONDARI Le diverse tecniche cromatografiche vengono classificate sulla base del meccanismo principale di separazione.

CLASSIFICAZIONE in base al meccanismo principale  Liquido solido o di adsorbimento

Liquido-liquido o di ripartizione Scambio ionico

Esclusione Affinità

Principi di cromatografia Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) non sono perfettamente note. I meccanismi che agiscono sono molti e di natura molto diversa

Principi di cromatografia • INTERAZIONI DEBOLI - LEGAMI IDROGENO - INTERAZIONI DIPOLO-DIPOLO - LEGAMI DI VAN DER WAALS • COMPOSTI DI COORDINAZIONE • INTERAZIONI STERICHE • MECCANISMI DI SCAMBIO IONICO

LIQUIDO-SOLIDO (LSC) O DI ADSORBIMENTO La fase stazionaria è un materiale solido costituito da particelle. Sulla superficie dei granuli si trovano dei siti attivi che possono stabilire legami deboli (legami idrogeno, dipolo-dipolo, forze di van der Waals etc.) con le molecole della miscela da separare. Durante l’eluizione le molecole di ciascuna sostanza si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi, mobile e stazionaria, in misura variabile secondo l’entità dell’adsorbimento.

Meccanismo di adsorbimento L’ adsorbimento di una specie S ,proveniente dalla fase mobile sposterà dalla superficie della fase stazionaria un certo numero n di molecole del solvente M (la fase fissa risulta sempre ricoperta da molecole di solvente : la superficie della fase stazionaria, in assenza di soluto, si “solvata”). Aggiungendo un solvente che venga adsorbito più fortemente del precedente , il soluto fissato sulla fase stazionaria si stacca e a nel nuovo solvente. Scendendo lungo la colonna, raggiunta la zona libera della fase fissa , il soluto viene nuovamente adsorbito.

Fase mobile (liquido o gas)

Siti attivi

Meccanismo di adsorbimento. La fase stazionaria è un solido,in genere un composto inorganico o un polimero organico, con dei siti attivi superficiali che possono interagire con alcuni gruppi funzionali delle molecole da separare.

Fase stazionaria (solido)

LIQUIDO-LIQUIDO (LLC) O DI RIPARTIZIONE

La fase stazionaria è un liquido, immiscibile con la fase mobile, che impregna un o solido inerte. Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la diversa solubilità di ciascuna di esse.

Fase mobile (liquido o gas)

La fase stazionaria è un liquido che ricopre un o solido. Ogni componente della miscela si solubilizza nelle due fasi, mobile e stazionaria, e si ripartisce secondo la solubilità in ciascuna di esse.

Fase stazionaria (liquido)

o (solido)

SCAMBIO IONICO (IEC) La fase stazionaria è costituita da una resina a scambio ionico, ossia un o organico al quale sono legati dei gruppi ionici o ionizzabili (-SO3-,-COO- ,ecc.).

I gruppi ionici della resina trattengono per mezzo di interazioni elettrostatiche, controioni di carica opposta che possono essere scambiati con gli ioni (dello stesso segno dei controioni) presenti nella fase mobile.

SCAMBIO IONICO Fase mobile

controione

-

-

-

+

+

+

Fase stazionaria

Sito attivo

SCAMBIO IONICO Fase mobile

-

-

controione

-

-

-

+

+

+

Fase stazionaria

sito attivo

SCAMBIO IONICO Fase mobile

-

-

controione

-

-

-

+

+

+

Fase stazionaria

Sito attivo

ESCLUSIONE (SEC) La fase stazionaria è un solido poroso o un gel con pori Il meccanismo di separazione è determinato esclusivamente dalle dimensioni dei soluti. Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori del gel mentre le molecole troppo grandi vengono escluse dai pori ed escono dalla colonna in tempi molto brevi.

AFFINITA’ Mediante una reazione reversibile ,le molecole da separare si legano a gruppi funzionali specifici della fase stazionaria. Con l’Eluizione si rompono i legami con la fase stazionaria e si recuperano le molecole. La cromatografia di affinità può essere considerata una variante della cromatografia di adsorbimento.

Cromatogramma Tutte le separazione cromatografiche (eccetto la separazione su strato sottile nella versione più semplice) si concludono con la registrazione di un CROMATOGRAMMA

Il tracciato che descrive l’andamento del segnale del rivelatore in funzione del tempo a partire dall’istante in cui la miscela viene introdotta nella colonna (t = 0)

Cromatogramma Il tracciato completo che si ottiene per ciascuna sostanza eluita è detto picco cromatografico. In condizioni ideali il picco ha la forma simmetrica di una curva gaussiana, perché dovuto all’inevitabile processo di dispersione zonale che ogni sostanza subisce mentre scorre nella colonna. Matematicamente una curva gaussiana viene descritta dal punto di massimo e nella distanza tra i punti di flesso che divisa per 2 non è altri che la deviazione standard σ.

Cromatogramma

Cromatogramma

L’area totale sottesa alla curva del picco è proporzionale alla concentrazione di sostanza separata e ,di conseguenza, viene utilizzata come parametro di riferimento nell’analisi quantitativa.

CROMATOGRAFIA – LETTURA DEL CROMATOGRAMMA

tM

t picco della FASE MOBILE

picco dell’ ANALITA

Il tempo impiegato dalla fase mobile (specie non ritenuta) a fuoriuscire dalla colonna è detto tempo morto (tM), ed esprime il tempo impiegato dal fronte di fase a percorrere l’intera circuitazione che collega reservoir che lo

contiene al sistema di rivelamento

CROMATOGRAFIA – LETTURA DEL CROMATOGRAMMA

tR

tMo

t picco della FASE MOBILE

picco dell’ ANALITA

Il tempo impiegato dal soluto per eluire dalla colonna è detto tempo di ritenzione (tR), e rappresenta il tempo impiegato dall’analita a raggiungere il rivelatore, misurato dal momento in cui la miscela viene introdotta nel flusso di fase mobile

fino all’istante in cui si registra il massimo del tracciato cromatografico.

CROMATOGRAFIA – LETTURA DEL CROMATOGRAMMA

tR

t’R tMo

t picco della FASE MOBILE

picco dell’ ANALITA

Il tempo di ritenzione corretto (t’R) corrisponde al tempo speso dall’analita per attraversare il letto cromatografico, e corrisponde alla differenza

t’R = tR - tM

Cromatogramma Il tempo di ritenzione di una sostanza che praticamente non viene trattenuta dalla fase stazionaria è detto TEMPO MORTO (tm). Qualsiasi sostanza, per giungere al rivelatore, deve trascorrere nella colonna un tempo almeno uguale al tempo morto.

Cromatogramma

In alternativa al tempo di ritenzione (tR) si può misurare il volume di ritenzione VR, entrambi sono parametri importanti per l’analisi qualitativa dando indicazioni del grado di affinità della sostanza eluita nei confronti della fase stazionaria.

Cromatogramma

Analogamente parliamo di VM (detto anche volume interstiziale o volume della fase mobile) e che non è altri che il volume della colonna non occupato dalla fase stazionaria, e quindi a disposizione della fase mobile. Possiamo definire il volume di ritenzione corretto come: V’R = VR - VM

Cromatogramma La relazione tra il tempo di ritenzione e il volume di ritenzione è la seguente:

VR = tRFc dove : VR = volume di ritenzione TR = TEMPI DI RITENZIONE FC = flusso della fase mobile (mantenuto costante durante tutta la

separazione cromatografica).

Relazione analoga tra i parametri corretti : V’R = t’RFC