Fermentacion Enzimatica 6s2c3p

UNIVERSIDAD CATOLICA DE SANTA MARIA FACULTAD DE CIENCIAS E INGENIERIAS BIOLOGICAS Y QUIMICAS P.p DE INGENIERIA DE INDUSTRIA ALIMENTARIA

TEMA: RUTAS ALTERNAS A LA GLICOLISIS: FERMENTACION ENZIMATICA CURSO: BIOQUIMICA DE ALIMENTOS 1 PROF: Ing. CARLOS MORI NUÑEZ ENTREGADO POR: CLAUDIA STEPHANIE PICHA ESQUICHE KERLLY ZEGARRA ZEGARRA SEMESTRE: III AREQUIPA- PERU 2012

1. INTRODUCCION En términos generales, la biotecnología se puede definir como un conjunto de técnicas en el que se utilizan organismos vivos, partes de ellos o moléculas derivadas de organismos vivos para fabricar o modificar productos. Además, comprende aquellas técnicas de modificación genéticas de variedades de plantas, animales o microorganismos para su utilización con un propósito específico. El objetivo fundamental de la biotecnología de alimentos es la investigación acerca de los procesos de elaboración de productos alimenticios mediante la utilización de organismos vivos, o procesos biológicos o enzimáticos, así como la obtención de alimentos genéticamente modificados mediante técnicas biotecnológicas (Lucas, 2003). Uno de los campos de aplicación de la biotecnología es la catálisis fermentativa, la cual se basa en la utilización de complejos enzimáticos obtenidos a partir de microorganismos, en procesos industriales. Las enzimas son biocatalizadores únicos por sus cualidades y sin utilizadas en la práctica mundial para intensificación de procesos tecnológicos en los cuales se usa material de origen animal y vegetal. Uno de los campos de mayor futuro para la biotecnología es la industria de alimentos y la agroindustria en general. En Venezuela, la industria ha utilizado biotecnologías tradicionales aplicadas por ejemplo a las bebidas fermentadas, a la fabricación de quesos, entre otras. Sin embargo, las nuevas biotecnologías registran avances recientes: la ingeniería de fermentación y la ingeniería enzimática que aumenta su productividad y bajan los costos de producción y el consumo de energía gracias al uso de nuevas cepas de bacterias y otros microorganismos, y de biorreactores en continuo. Actualmente, se registra un avance considerable en la industria farmacéutica. Sin embargo, los avances de la ingeniería de fermentación y enzimática permiten la valorización de esquilmos vegetales y animales fuertemente desaprovechados en el país. Mediante procesos mejorados de fermentación y utilización de nuevas enzimas se podría dar un amplio uso a esquilmos agrícolas y subproductos, como los de azúcar (bagazo, melaza, bagacillo, cachaza, etc.) no sólo para fabricar por ejemplo proteína unicelular, sino además para evitar efectos contaminantes. Las posibilidades que tienen las nuevas biotécnicas para obtener productos industrializados de segunda, tercera y hasta cuarta y quinta transformación, a partir de los productos agrícolas y de la biomasa en general, es otra parte de la biotecnología que se hace necesario estudiar con mucha prioridad, ya que permitiría industrializar al sector agropecuario, y por lo tanto darle otra dimensión y valorización a los diferentes subsistemas agrícolas. Además, la industrialización de la agricultura con las técnicas de la ingeniería enzimática y la ingeniería de la fermentación, podría convertir a casi todos los sub-sistemas agrícolas en fuente importante de proteínas. La ingeniería enzimática consiste en utilizar enzimas para facilitar y acelerar las reacciones químicas, lo cual permite aumentar la eficiencia de los procesos. Cuando éstas son fijadas en un soporte mecánico se logra conservarlas y hacer circular en continuo la solución a través de las enzimas inmovilizadas. Actualmente se utilizan 20 enzimas, principalmente en la producción de alimentos. Las posibilidades concretas que estas biotécnicas permiten prever en la

industrialización de la agricultura, se pueden observar con más detalle en la industrialización de la caña para azúcar, banano, productos forestales, yuca, etc.

2. MARCO TEORICO A. Enzimas Las enzimas son proteínas constituidas por una larga cadena de aminoácidos y su estructura básica esta unida por enlaces péptidicos, pueden presentar tres configuraciones espaciales especificas (secundaria, terciaria o cuaternaria) y tienen un peso molecular entre 12.000 y 300.000 daltons. En general las enzimas comparten las propiedades de la mayoría de las proteínas globulares que son: solubilidad en agua pero no en solventes orgánicos y desnaturalización por temperatura extrema, pH e hidrólisis por acción de proteasas (Stauffer, 1994). Las enzimas son catalizadoras de reacciones químicas que se unen a una o más sustancias llamadas sustratos, produciendo una disminución en la cantidad de energía de activación necesaria para dicha reacción, además las enzimas incrementan el rango de reacción química sin degradarse y sin tener ningún cambio en su estructura, las enzimas no son consumidas en la reacción y por lo tanto pueden continuar catalizando la reacción siempre y cuando el sustrato este presente (Muurray, 2001). Las enzimas se caracterizan por dos fenómenos:  

La especificidad: se refiere cuando una enzima cataliza una o varias reacciones siempre y cuando los sustratos tengan la misma estructura básica. La inhibición competitiva: consiste en que un sustrato y un inhibidor semejante al sustrato compiten por los sitios de enlace de la enzima (Muurray, 2001).

B. Fermentación enzimática Las enzimas son obtenidas por el proceso de fermentación en condiciones controladas, para la producción de estas se utilizan cepas de alto rendimiento. Muchas de las enzimas son extracelulares, es decir, que la célula las expulsa al medio, es por esta razón que se hace necesaria la separación de las células y las enzimas por medio de filtración o centrifugación. El filtrado o sobrenadante que contiene la enzima se concentra o se precipita, seca y muele para obtener la enzima en forma de polvo.

Existen cinco condiciones previas para una fermentación:     

El microorganismo debe producir un producto útil, propagarse con facilidad y mantener características biológicas y bioquímicas uniformes para dar rendimientos consistentes. Debe ser posible disponer de materias primas económicas, de fácil adquisición y de composición uniforme. Rendimientos aceptables Intervalo de fermentación rápido El producto debe ser fácil de recuperar y purificar. 2.B.1. Parámetros de fermentación El pH, la temperatura y la concentración de sustrato son determinantes en el funcionamiento de las enzimas, es decir, que cada enzima tiene un rango de pH y temperatura óptima y la concentración de sustrato debe estar relacionada con la concentración de la enzima presente. Como muchas enzimas son proteínas, su estructura ternaria es fundamental para su funcionamiento, un aumento de temperatura puede destruir los puentes de hidrógeno, y distorsionar zonas de la estructura ternaria. La mayoría de las enzimas trabajan a pH de 6 a 8 que es donde se presenta el mayor rango de eficacia, hay excepciones como la pepsina que trabaja a pH de 2 y la lipoxigenasa que trabaja a pH de 9. La concentración de sustrato debe ser alta comparada con la concentración de la enzima esto implica que la totalidad de la enzima va a estar acoplada al sustrato provocando una velocidad de reacción alta.

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Cofactores. Muchas enzimas necesitan la presencia de sustancias, no proteicas adicionales, para su funcionamiento, a estas sustancias se les denomina cofactores, que pueden ser iones como el magnesio, que participa en las reacciones en las que se transfiere un grupo fosfato de una molécula a otra, y otros iones como potasio, calcio, zinc, cobre, manganeso, hierro y sodio. En otros casos la unión entre aminoácidos e iones mantiene la estructura ternaria en ciertos pliegues y en otros la estructura cuaternaria. Coenzima. Las coenzimas son moléculas orgánicas pequeñas, muchas son vitaminas como es el caso de la riboflavina (B2), tiamina (B1) y nicotinamida. Estas coenzimas pueden reciclarse y volver a ser usadas, por eso el organismo sólo necesita pequeñas cantidades de estas sustancias (Izquierdo, 2003). Otros parámetros. La fuerza iónica del medio, la presión (especialmente si uno de los reactivos es gaseoso), las soluciones tampón (buffers) empleados, la pureza de los reactivos y de la enzima (Parra et al., 1996).

C. Aislamiento y purificación de enzimas Para la extracción de la enzima se hace necesario conocer su localización, si la enzima es intracelular se hace necesario un método que requiera algún grado de ruptura de la célula, hay que considerar el mecanismo menos destructivo pero que a su vez libere una buena porción de enzima, si por el contrario la enzima es extracelular no hay necesidad de realizar ningún proceso de ruptura celular. No existe un procedimiento único, o un conjunto de procedimientos mediante los cuales todas y cada una de las enzimas puedan aislarse, se siguen una serie de etapas de separación para cualquier enzima, con lo que se podrá obtener un alto grado de purificación y rendimiento. Para obtener este objetivo es necesario eliminar el material inactivo o de las enzimas no deseadas, mientras se consigue un alto rendimiento. En la extracción se debe obtener una síntesis adecuada del tejido que contiene la enzima sin provocar pérdidas de actividad. En el caso de las de origen microbiano, la proteína se libera en el medio de cultivo y se separa de las células mediante centrifugación. En el proceso de purificación se tienen en cuenta cinco etapas básicas:     

Desarrollo de los métodos de análisis adecuados. Selección de la mejor fuente a partir de la cual se puede purificar la proteína. Solubilización de la molécula deseada. Estabilización de la molécula repetidamente en cada etapa de su purificación Desarrollo de una serie de procesos de aislamiento y concentración Normalmente el proceso de purificación comprende seis etapas: eliminación de ácidos nucleicos, eliminación de restos celulares, purificación preliminar, concentración, purificación final, concentración y envasado.

D. Tratamiento de los residuos Al considerar las aplicaciones enzimáticas en el tratamiento de los residuos, se debe hacer hincapié entre las situaciones donde el residuo de un proceso es el material crudo y los siguientes, por ejemplo, conversión de almidón, y procesos que ayudan a reducir los costos asociados del tratamiento. Existen un amplio número de industrias de procesamiento de alimentos que producen residuos que necesariamente deben ser posteriormente tratados. Las aplicaciones de grupos de enzimas dependen de la necesidad de hidrolizar polímeros complejos para incrementar su posterior degradación microbiológica. Entre los diversos

ejemplos se puede incluir el empleo de las lipasas asociadas con cultivos bacterianos para eliminar los depósitos de grasa procedentes de las paredes de las tuberías que transportan el efluente. Otras enzimas degradantes de polímeros utilizadas de forma similar son las celulasas, proteinasas y amilasas. Una aplicación particular que puede describirse como tratamiento de residuos, es el ejemplo de proteinasas en las preparaciones comerciales de detergentes, denominadas como polvos de lavado biológico (Barfoed, 1983). Además de estas hidrólisis de materiales poliméricos, existen también aplicaciones de enzimas capaces de degradar compuestos altamente tóxicos que podrían inhibir procesos de tratamiento basados en el empleo microbiológico. Un ejemplo específico es el uso de la peroxidasa de la cola de caballo para iniciar la degradación de fenoles y aminas aromáticas que se presentan en muchas industrias con aguas residuales (Klibanov et al., 1983). En el término más amplio es posible anticipar que los procesos basados en el empleo de organismos construidos genéticamente para degradar los compuestos indicados anteriormente, podría representar un proceso mucho más económico.

E. Estudios realizados de fermentación enzimática (Antecedentes) Cárdenas-Díaz (2000), estudiaron la fermentación de sotol; tratamiento enzimático de residuos. El sotol es una planta silvestre de la República Mexicana, pertenece a la familia Nolinacea, formada por más de 200 géneros y 2500 especies, es cultivada en regiones con climas áridos y semiáridos. Diferentes estudios indican que Coahuila presenta un alto potencial de plantas de sotol; de los siete millones de hectáreas que representan el hábitat de la planta, tres son reconocidas como buenas para su aprovechamiento. No obstante solo dos especies resultan de gran importancia en este estado, Dasylirion cedrosanum y Dasylirion duranguensis. A partir de la cocción y fermentación de las piñas de esta planta es preparada la bebida alcohólica del mismo nombre. Las piñas poseen carbohidratos como fructosa y celulosa siendo ésta última el componente más abundante. Sin embargo, en el proceso comercial, las fibras de celulosa no se hidrolizan en su totalidad, aportando una cantidad mínima de sustrato para realizar la fermentación, por lo que una alternativa biotecnológica atractiva es la adición de un complejo enzimático celulolítico que promueva la hidrólisis total. El objetivo de la presente investigación fue realizar un tratamiento previo a la cocción del jugo y del bagazo de sotol, mediante la adición de un complejo enzimático celulolítico con la finalidad de incrementar la concentración inicial de de azúcares. Realizaron un estudio sobre el efecto del complejo enzimático Rhizozyme en la producción de alcohol etílico mediante la fermentación de melazas con S. Cerevisiae. Se construyó un dispositivo a escala piloto de 220L, que cercanamente representa las características dinámicas, térmicas, químicas y biológicas de un fermentador industrial de 240000 L. Se preparó un diseño experimental para estudiar el efecto de la adición del complejo enzimático en la evolución del grado alcohólico, los azúcares reductores totales y la

demanda química de oxígeno resultantes de la fermentación alcohólica. Se observaron incrementos en el grado alcohólico hasta de un 8%, a una concentración de enzima de 35ppm, sin aumento significativo de la demanda química de oxígeno en la vinaza resultante. La utilización de este complejo enzimático constituye una manera sencilla de aumentar el rendimiento de la producción de alcohol etílico en fermentación de melazas. Hipotéticamente, el complejo enzimático actuaría sobre las sustancias no fermentables presentes en la melaza, convirtiéndolas en monosacáridos, aminoácidos libres o simplemente moléculas más sencillas que podrían ser fácilmente asimilables por la levadura, otorgándole de este modo una nutrición más completa y mayor vitalidad. De esta manera, la adición del complejo enzimático al proceso fermentativo podría tener un impacto significativo en la economía del proceso al inducir la producción de mayor cantidad de alcohol por unidad de materia prima. Hoyos et al., (2003), desarrollaron un complejo enzimático por fermentación de sustrato sólido con Rhizopus niveus, para la optimización de la producción de alcohol etílico a partir de melaza. La caña de azúcar es un excelente cultivo para producir energía por su elevado nivel de eficiencia en el proceso fotosintético, condición que lo ubica en la primera opción para la producción de etanol combustible. Normalmente se obtiene el alcohol de la caña de azúcar mediante la fermentación de sus melazas empleando levaduras, particularmente cepas de Saccharomyces cerevisiae. Esta fermentación produce entre 8 y 10% v/v de alcohol etílico partiendo de un sustrato fermentable de 20-22% p/p de azúcares reductores totales; de esta manera queda un residuo de carbohidratos sin fermentar que hace parte de la carga orgánica de las vinazas y que finalmente se destina a la planta de tratamiento de aguas residuales. La investigación propone el estudio de la producción de alcohol etílico a partir de melaza, utilizando una mezcla de enzimas denominado complejo enzimático, aplicado como coadyudante al proceso de fermentación llevado a cabo por la levadura, para establecer si se logra un incremento en la producción de alcohol. Inicialmente se estandarizan los procesos de fermentación con la levadura y la obtención del complejo enzimático. Posteriormente se evalúa la incidencia del complejo enzimático sobre el proceso de fermentación. Para la obtención del complejo enzimático se evalúa la producción del mismo en diferentes sustratos por acción del hongo Rhizopus niveus empleando la técnica de fermentación de sustrato sólido (FSS). Hanssen et al., (2007), estudiaron la obtención de dextrano y fructosa, utilizando residuos agroindustriales con la cepa Leuconostoc mesenteroides NRRL B512-F. Debido al gran potencial biotecnológico que presentan los residuos agroindustriales, se desarrolló el presente trabajo para la obtención de oligosacáridos, utilizando como materia prima residuos de cáscaras de naranja, piña y cachaza de caña era, a escala de laboratorio. Por medio de un diseño experimental se evaluó la concentración y tipo de sustrato y la temperatura del proceso con tres niveles, para lograr la mayor producción. El desarrollo experimental se llevó a cabo con un volumen de 100 mL y 250 mL. En la etapa final se obtuvo como resultado una producción de 3,4 g/L de dextrano y 5,04 g/L de fructosa,

utilizando como sustrato cáscaras de naranja con estas condiciones: temperatura de 30 ºC y concentración de sustrato de 20g/L; durante el proceso se midieron el consumo de sustrato y la concentración de biomasa y productos. Se observó el desarrollo del microorganismo con los sustratos empleados en la experimentación, sin adición de nutrientes, con una adaptación favorable a éstos. Finalmente, se realizó una caracterización preliminar del polímero obtenido, con lo que se concluyó que puede obtenerse dextrano de grado técnico para su uso como espesante en la industria de alimentos y en el área de tratamiento de aguas residuales como floculante. El dextrano se produce generalmente en cultivos de bacterias lácticas como Streptococcus, Acetobacter o Leuconostoc, en medios que contienen sacarosa; las células en crecimiento secretan una enzima inducible llamada dextransucrasa que convierte el exceso de sacarosa hidrolizándola en dextrano y liberando fructosa al medio. En términos generales, se demostró que es posible obtener dextrano y fructosa en todos los sustratos evaluados. En el análisis fisicoquímico, los resultados mostraron para cada sustrato concentraciones por encima de 20 g/L de sacarosa, característica adecuada para llevar a cabo el proceso de fermentación sin necesidad de adición de nutrientes como sacarosa u otra fuente de carbono. Lo anterior convierte los residuos en una fuente potencial para el surgimiento de investigaciones encaminadas a su aprovechamiento. Mejía et al., (2007), llevaron a cabo un estudio que consistió en el aprovechamiento del residuo agroindustrial del mango común (Mangifera indica L.) en la obtención de azúcares fermentables. El residuo del mango común (Mangifera indica L.) es un material vegetal que contiene gran cantidad de tejido lignocelulósico, el cual puede ser aprovechado para la obtención de metabolitos fermentables y productos de la fermentación. En este trabajo se aplicaron tratamientos de hidrólisis al residuo del mango común con el fin de hacer la conversión de sus polisacáridos a unidades de azúcares fermentables. Se aplicó hidrólisis ácida a tres concentraciones diferentes de ácido sulfúrico diluido. También, se aplicó hidrólisis enzimática con dos tipos de enzimas comerciales a diferentes concentraciones en las condiciones de trabajo estándar. De igual manera se aplicó hidrólisis térmica a dos temperaturas diferentes. A cada tratamiento aplicado se le efectuaron pruebas de concentración de azúcares totales, concentración de azúcares reductores, porcentaje de celulosa y hemicelulosa residual, datos con los cuales se determinaron los mejores tratamientos y se procedió a efectuar combinaciones de los mejores tratamientos de hidrólisis. El tratamiento más significativo de las pruebas individuales fue el de hidrólisis ácida a 0,50% v/v de ácido sulfúrico a 80ºC por una hora. En los tratamientos combinados el resultado más significativo fue el tratamiento en el que se combinaron la hidrólisis enzimática (como pretratamiento) más una hidrólisis térmica e hidrólisis ácida. Por razones de seguridad en el uso de reactivos, así como eliminación de efectos colaterales adversos para la fermentación alcohólica posterior, se seleccionó el procedimiento que involucra la hidrólisis térmica como pretratamiento y la hidrólisis enzimática como tratamiento principal, como el tratamiento de mejor aplicación en la producción de

metabolitos fermentables a partir de residuos de mango común con finalidad producción de alcohol posteriormente. Ibarra-Junquera et al., (2008), llevaron a cabo el estudio de la extracción enzimática de jugo de banano y su fermentación. La investigación sobre la tecnología de extracción del jugo de banano para hacer una bebida nutritiva, rica en minerales, representa una alternativa para el aprovechamiento del banano. El estudio se realizó con tres variedades de banano: dos híbridos FHIA-17 y FHIA-23, tolerantes a la Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis) y resistentes al mal de Panamá (Fusarium oxysporum f.s.p. cubense) así como el enano gigante. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la extracción del jugo mediante enzimas así como su cinética de fermentación. El uso del complejo enzimático Macerex mostró que es posible obtener un jugo de banano con alto contenido en azucares y un rendimiento superior al 70%. Además se encontró que la fermentación alcohólica de jugo de banano presenta inhibición por sustrato. Albán et al., (2009), llevaron a cabo un estudio donde se evaluó la producción de etanol a partir de hidrólisis y fermentación simultánea (HFS) de residuos generados en el procesamiento de mango común (Mangifera indica L.) utilizando dos cepas de levadura comercial Saccharomyces cerevisiae recombinante RH 218. Mediante tratamientos preliminares de hidrólisis y fermentación se seleccionaron las siguientes condiciones de trabajo: hidrólisis térmica a 98ºC por una hora, hidrólisis enzimática mediante la aplicación de CelluclastMR 1,5 L; aplicación de 3% de levadura y tiempo de fermentación de cinco días, monitoreando las variables pH, ºBrix, fibra residual, biomasa, azúcares reductores y etanol. La levadura comercial marca A, presentó el menor contenido de etanol (0,58%) y el más alto contenido de azúcares reductores (1,93 mg de azúcar/g de materia seca) y la levadura recombinante RH 218 presentó un contenido de alcohol de 0,76% y azúcares reductores de 1,38 mg de azúcar/g de materia seca. Rivera et al., (2009), estudiaron la producción de enzimas lignocelulolíticas por fermentación sumergida a partir de residuos sólidos orgánicos para tecnologías limpias. La producción de papel se lleva a cabo mediante dos procesos, pulpaje mecánico y/ o químico. Las fibras se someten a cocción con hidróxido de sodio y sulfuro de sodio, la pulpa obtenida se lava con agua y se envía a la etapa de blanqueo, en la cual se utilizan compuestos clorados, que dan como resultado la contaminación. Por lo anterior, el uso de tecnologías limpias como el uso de enzimas tiene una serie de ventajas con respecto al tratamiento tradicional. Las enzimas de interés para el tratamiento del papel son: ligninolíticas, xilanolíticas y celulolíticas que proceden de hongos de pudrición blanca. En la actualidad la degradación de los materiales lignocelulósicos se interpreta como la actuación conjunta de grupos de enzimas junto a la intervención de una serie de moléculas de bajo peso molecular que actúan como mediadores y que acceden más fácilmente al interior de la madera. Las actividades enzimáticas fueron determinadas del sobrenadante de las fermentaciones sumergidas, las actividades enzimáticas máximas se obtuvieron a los 7 días aprox. para los tres tipos de enzimas, sin embargo el mejor productor de

xilanasas y celulasas fue Aspergillus niger en salvado y plátano respectivamente, por otra parte el mayor productor de lacasas fue Phanerochaete chrysosporium con valores similares de producción en salvado y bagazo de caña como substrato. Se obtuvieron actividades enzimáticas satisfactorias usando residuos como substratos. El mayor productor de xilanasas y celulasas fue Aspergillus niger y Phanerochaete chrysosporium en cuanto a lacasas. Araya et al., (2010), llevaron a cabo un estudio que consistió en la síntesis de ácido láctico, a través de la hidrólisis enzimática simultánea a la fermentación de un medio a base de un desecho de piña (Ananas comosus), para su uso como materia prima en la elaboración de ácido poliláctico. Se evaluó el potencial de un desecho agroindustrial de piña para su utilización en la producción de ácido láctico por fermentación, utilizando Lactobacillus casei subespecie rhamnosus. Se realizaron fermentaciones del sustrato de piña como tal e hidrolizado enzimáticamente con invertasa. El tratamiento enzimático permitió aumentar el rendimiento de 84 a 98% (m/m) y la concentración de ácido láctico de 64 a 75 g/L, al obtenerse un consumo total de los azúcares presentes en el medio hidrolizado, en comparación con la fermentación del medio sin hidrólisis que presentó una concentración residual de sacarosa de 15 g/L. La productividad total del proceso de fermentación del medio sin hidrólisis fue de 5,4 g/h de ácido láctico, mientras que la fermentación del medio invertido obtuvo una productividad menor de 4,3 g/h; esto producto del aumento en el tiempo total de fermentación de 35 a 40 h al hidrolizar la sacarosa. La productividad máxima disminuyó de 5,5 a 3,9 g/L*h de ácido láctico, al realizar el tratamiento enzimático. Debido a la alta eficiencia obtenida en la conversión de los azúcares en ácido láctico, la hidrólisis enzimática del medio es la mejor opción para obtener una concentración mayor de este compuesto y para su potencial aplicación en la producción de plásticos biodegradables.

3. DESARROLLO A. Producción de jarabe a partir de residuos de tubérculos (papa, patata, boniato y ñame) con fructosa elevada (HFCS). El propósito de este proceso es obtener un material de poder edulcorante semejante a la sacarosa a partir de residuos agroindustriales con conchas de tubérculos de bajo precio (almidón de tubérculos). Los procesos encaminados a la producción de edulcorantes están basados en la degradación del almidón y han sido empleados durante muchos años, aunque originalmente se llevaba a cabo mediante hidrólisis catalizada por ácidos. La elevada especificidad de estas reacciones enzimáticas, acopladas con la gran actividad de las preparaciones disponibles, ha permitido directamente el que pueda ser incrementada y además la formación de derivados indeseables se ha minimizado (Coker y Venkatasubramanian, 1985).

a) Descripción del proceso La materia prima (residuos agroindustriales de tubérculos; conchas de papa, patata, boniato y ñame), se aplica un pretratamiento hasta obtener un jugo para el proceso, este pretratamiento consiste en recolectar cada uno de los residuos por separado para aplicarle un lavado, molido y filtrado para la extracción de los jugos de proceso; a continuación fueron pasteurizados, para garantizar una reducción sustancial de los microorganismos y la preservación del contenido de azúcares; luego se pulveriza y los granos de almidón resultantes se suspenden formando una suspensión 30-35% (peso/volumen). Este material obviamente es difícil de manipular (debido a su elevada viscosidad y a la presencia de material particulado en suspensión), por ello la etapa siguiente en el proceso es la licuefacción del almidón suspendido. Se mezcla la enzima con la suspensión de almidón y se mantiene a una temperatura de 80-110ºC por un periodo de 2-4 horas a un pH de 6-6,5. En esta etapa se añaden iones calcio para activar la enzima αamilasa. Esta enzima cataliza la hidrólisis de los enlaces α1-4 entre unidades de glucosa siendo incapaz de provocar la ruptura de cadenas ramificadas, y asi, la degradación se encuentra limitada por la cantidad de ramificaciones presentes en la cadena. La “dextrina límite” resultante tiene que hidrolizarse mediante el empleo de una segunda enzima, la pululanasa. Antes de añadir la glucoamilasa, la solución del almidón licuada debe ser enfriada a 60ºC y el pH ajustado entre 4-5. El tiempo necesario en esta etapa para el material en el reactor será entre 24 y 90 horas, el tiempo requerido depende de la cantidad de enzima que se añade. Al final de este tiempo, se requiere que el producto contenga una concentración de dextrosa entre 94-96% para que la fase de isomerización sea viable. Ya que el HFCS se emplea como material en la alimentación, existen criterios de pureza gubernamentales estrictos sobre su composición. Por esto, el material sacarificado tiene que ser depurado con anterioridad a la etapa de isomerización. Un stock adecuado de material es también importante si se desea mantener la catálisis óptima en la isomerasa inmovilizada del reactor. El proceso de depurado implica una filtración para eliminar material particulado y proteínas precipitadas. Aunque es mínima la formación de subproductos coloreados por la hidrólisis enzimática es posible eliminar las pequeñas cantidades que se producen mediante el uso de un método de absorción sobre carbón activo. El pH óptimo para la reacción de isomerización se encuentra comprendido entre 7,5 y 8,2 y por ello el pH tiene que ser elevado desde los valores de 4-5 empleados durante la segunda etapa de la sacarificación. Los ajustes de pH indicados tienden a incrementar la concentración de sales inorgánicas en el medio y por esta razón se requiere desionizar en este momento del proceso. Finalmente, la concentración se ajusta mediante evaporación y se añaden iones magnesio como activadores.

La concentración de sólidos se mantiene entre un 40-45% para alimentar a la isomerasa del reactor. La constante de equilibrio para la reacción es de 1 a 60ºC, pero en tiempo real, la conversión está limitada produciendo un 42% de fructosa. Inicialmente, este compuesto era el único producto en el mercado, aunque en el caso de algunas aplicaciones se requería un contenido de fructosa más elevado. Mediante experiencias más recientes, utilizando cromatografía de adsorción se ha conseguido la concentración selectiva de fructosa de tal modo que puede disponerse de una solución cuyo contenido de carbohidratos (fructosa) es del 90%. Este material, se denomina como “jarabe a partir de residuos agroindustriales de tubérculos muy enriquecido en fructosa” (VEFCS), el cual puede mezclarse con el producto de la reacción de isomerización con un 42% para obtener una solución con un 55% de fructosa que es ideal como edulcorante comercial.

B. Ventajas y desventajas socioeconómicas y ambientales de la fermentación enzimática. 

Ventajas socioeconómicas: - Es preferible la hidrólisis enzimática del almidón al comenzar el proceso de fermentación. Esto permite aumentar el rendimiento, reducir el nivel de nutrientes residuales y por lo tanto reducir el costo de producción de obtener jarabe de fructosa puro. - Permite dar valor agregado a los desechos agroindustriales, que presentan un alto contenido de carbohidratos fermentables. - El uso de enzimas en la alimentación requieren que un producto de valor bajo se obtenga con un coste menor que otras alternativas ya existentes. - Emplear concentraciones bajas de sustrato y monitorizar las reacciones a temperatura ambiente 25ºC o fisiológica 37ºC. - Para producir HFCS de forma económica los procesos itidos están basados sobre concentraciones de sustrato del 50% (peso/volumen). - La preparación de glucosa isomerasa debería tener una vida media operativa superior a 30 días. - La fermentación enzimática convierte los residuos agroindustriales en una fuente potencial para el surgimiento de investigaciones encaminadas a su aprovechamiento. - Representa una disminución en los costos de consecución de materias primas para los bioprocesos. - Permite construir dispositivos a escala piloto, que cercanamente representa las características dinámicas, térmicas, químicas y biológicas de un fermentador industrial. - Aumenta el rendimiento de la producción de alcohol etílico en fermentación de residuos agroindustriales como la melaza. - El complejo enzimático empleado en la fermentación enzimática actúa sobre las sustancias no fermentables presentes en la materia prima, convirtiéndolos en

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monosacáridos, aminoácidos libres o simplemente moléculas más sencillas que pueden ser fácilmente asimilables por la levadura. De igual manera; permite la conversión de sus polisacáridos a unidades de azucares fermentables. - Impacto significativo en la economía del proceso al inducir la producción de mayor cantidad de alcohol por unidad de materia prima. - El periodo de fermentación enzimática es rápido, puede tardar 48 horas aproximadamente. - La concentración del complejo enzimático utilizada para los experimentos es baja alrededor de 35-60ppm. Lo cual indica que la concentración del complejo enzimático hace que el proceso sea económicamente factible. - Se pueden usar enzimas extracelulares e intracelulares, aunque la mayoría de las enzimas utilizadas en la industria son enzimas extracelulares de origen microbiano. - La utilización del complejo enzimático constituye una alternativa técnica y económicamente factible para el mejoramiento de la productividad de etanol a escala industrial y constituye un método sencillo de incrementar la producción de alcohol en fermentación alcohólica. Desventajas socioeconómicas: - Las enzimas empleadas en este proceso se pueden considerar que son inusualmente estables, por ejemplo, la vida media operativa de la glucosa isomerasa inmovilizada se encuentra entre 70 y 120 días a 60ºC. - Originalmente el coste de la aplicación de las enzimas inmovilizadas sobre el producto final se estima alrededor de 14,00 dólares USA por tonelada. - En los casos donde los factores limitantes del proceso son la solubilidad del sustrato y producto, el empleo de solventes no-acuosos podrían ser aplicables. - Una de las restricciones más importantes para la utilización de enzimas es el requerimiento de cofactores enzimáticos con un coste elevado en muchas reacciones de síntesis. - La gran mayoría de las enzimas microbianas extracelulares se utilizan en forma de enzimas solubles libres y no se recuperan para su reutilización. - El trabajo todavía continúa para resolver los problemas de regeneración de coenzimas, estos procesos representan aún los problemas más preocupantes. - Factores que pueden inhibir la actividad del complejo enzimático: presencia de hongos en la fermentación, adición de antibióticos, concentración de glucosa en el alimento, concentración del complejo enzimático y tipo de materia prima. - La adición del antiespumante puede tener un efecto detectable sobre el progreso de la fermentación en presencia del complejo enzimático. El antiespumante puede ejercer un efecto inhibitorio a la fermentación alcohólica suplementada con el complejo enzimático, es decir, el antiespumante puede inhibir la actividad del complejo enzimático. - Los costos globales de producción de las enzimas intracelulares son substancialmente mayores que los de las enzimas extracelulares, debido a los mayores costos de

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aislamiento y purificación y en consecuencia, con frecuencia es económicamente rentable la reutilización de la enzima en forma inmovilizada. Ventajas ambientales: - La ingeniería de fermentación y la ingeniería enzimática aumentan su productividad, bajan los costos de producción y el consumo de energía gracias al uso de nuevas cepas de bacterias y otros microorganismos, y de biorreactores en continuo. - Permite la valorización de esquilmos vegetales y animales fuertemente desaprovechables en el país. - Las investigaciones en búsqueda de mayor productividad en la producción de alcohol carburante a partir de materias primas considerados desechos agroindustriales se convierte en una necesidad para suplir satisfactoriamente la demanda de otras fuentes de energía de manera sostenible. Además constituyen una fuente abundante y segura de recursos renovables y energía. - Los residuos agroindustriales producidos por las industrias de jugos y pulpas son en su mayoría materias primas ricas en carbohidratos de bajo costo y fuente abundante de azúcares fermentables. - Los productos obtenidos a partir de fuentes reciclables, tales como los residuos agroindustriales, han merecido un interés creciente, debido a que permiten aminorar el impacto ambiental y los costos en el tratamiento y disposición de dichos residuos en las industrias. - Maximiza la producción de alcohol, y minimiza el impacto ambiental del proceso. - Mejoramiento de los procesos tradicionales y desarrollo de caminos totalmente nuevos basados en el estudio de las propiedades de las enzimas. - La utilización de diversos residuos agrícolas es una propuesta lo suficientemente importante para producir biocombustibles y así reducir la dependencia exclusiva en este sentido de la caña de azúcar, generando con ello valor agregado, permitiendo el desarrollo social de las comunidades comprometidas con el uso racional de materias primas y los residuos. - Estos residuos son materiales constituidos en su mayor parte por tejidos lignocelulósicos, los cuales se deben someter previamente a diferentes tipos de tratamientos hidrolíticos para poder aprovecharlos favorablemente en la producción de compuestos susceptibles de fermentación (glucosa, fructosa, manosa, xilosa, entre otros) elementos esenciales para la producción de diferentes compuestos de alto valor agregado. Desventajas ambientales: - Aumento significativo de la demanda química de oxigeno en la vinaza resultante. - Fermentaciones en continuo pueden generar derrame del sustrato y causar daños ambientales. Por ello es preferible realizar fermentaciones en discontinuo a escala piloto. - El sistema de fermentación debe ser cerrado para evitar la evaporación del alcohol etílico.

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Formación de compuestos indeseados al finalizar la fermentación, pueden entorpecer los resultados esperados. Hay que tener en cuenta que las enzimas son altamente sensibles a los factores externos y se pueden inhibir fácilmente. Los residuos lignocelulósicos están siendo subutilizados, lo cual causa serios problemas de contaminación ambiental por su deficiente disposición final, a pesar de que son potencialmente buenos para ser utilizados como materia prima en la producción de azúcares, alimento para animales, biomasa microbiana, producción de ácidos orgánicos, entre otros.

4. BIBLIOGRAFIA - Acevedo A., Godoy R., Bolaños G. 2003. Incremento de la producción de alcohol en fermentación de melazas mediante la utilización del complejo enzimático Rhyzozyme. - Arias P. Salvador. 1994. Campos y perspectivas de la biotecnología - Arroyo, G. 1989. Colección Agricultura y Economía - Cárdenas-Díaz D. I., Castro E., Aguilar C. N., Soto C. O., Garza-Toledo H. 2000. Fermentación de sotol; tratamiento enzimático de residuos. Estudio de la extracción enzimática de jugo de banano y su fermentación - Gacesa P. y Hubble J. 1990. Tecnología de las enzimas. Editorial Acribia, S. A. Zaragoza – España. - Hoyos C. J. L., Carrera J. E. 2003. Desarrollo de un complejo enzimático por fermentación de sustrato sólido con Rhizopus niveus, para la optimización de la producción de alcohol etílico a partir de melaza. - Ibarra-Junquera V., Escalante-Minakata P., Chávez R. A. M., Puente-Preciado J.H., Pérez-Martínez J. D. 2008. Estudio de la extracción enzimática de jugo de banano y su fermentación. Congreso Nacional de biotecnología y bioingeniería - Izquierdo M. Biología. 2003. - Muurray R. Mayes P. Bioquímica de Harper. Tercera edición. Editorial El Manual Moderno. México DF, México 2001 - Ward O. P. 1989. Biotecnología de la fermentación. Editorial Acribia, S. A. Zaragoza – España.