Monografia Sobre Cromatografía 204g5a

AGRADECIMIENTO

Esta monografía se empezó a realizar en julio del 2008 y se culminó en agosto del 2008. Durante todo este tiempo fue necesario tener mucha dedicación y paciencia para la composición, diagramación y revisión de los contenidos, sin duda una tarea verdaderamente invalorable, por lo que nos sentimos agradecidos de la colaboración de nuestros profesores:



VICTOR MELÉNDEZ GUERRERO

Así mismos a todos quienes contribuyeron de alguna u otra forma en la elaboración de la monografía, pero muy especialmente quien figura en la lista de colaboradores.

DEDICATORIA

1

Dedicamos este trabajo a nuestro profesor Víctor Meléndez Guerrero, por iniciarnos en la investigación y por ser guía en nuestras primeras experiencias académicas universitarias.

Dedicamos el nuestros padres nuestros guías alcanzar nuestros anhelos.

trabajo a porque son y luz para más grandes

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN……………………………………………………………..….. …………………………………… 04 CAPÍTULO I: HISTORIA Y DEFINICIÓN. 1. Antecedentes históricos…………………. …………………………………………………….. 07

2

2. Premio Nóbel…….……..………………….…………….…... …………………………………… 14 3. Definición………………………………………………………………… …………………………… 14 CAPÍTULO II: CLASIFICACIÓN DE CROMATOGRAFÍA 1. Cromatografía de reparto ……………………………………... ………………………………… 2. Cromatografía de adsorción………………………………………………………………………. 3. Cromatografía en gel…………………………………………………………………………………. 4. Cromatografía en gel de capa fina…………………………………………………………….. 5. Cromatografía de intercambio iónico………………………………………………………… 6. Cromatografía de afinidad………………………………………………………………………… 7. Cromatografía de penetrabilidad……………………………….................................. 8. Cromatografía de interacción hidrofóbica…………….. …………………………………

18 21 24 32 34 42 50 59

CAPÍTULO III: MÉTODOS DE CROMATOGRAFÍA 1. Cromatografía plana……………………………………………........................................63 1.1. Cromatografía en papel.... .... ………………………………………………..………....63 1.2. Cromatografía de capa fina...................................................................67 2. Cromatografía en columna..............................................................................71 3. Cromatografía de gases…………………………………………………………………………..... 80 4. Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)......................................85 CAPÍTULO IV: FUNDAMENTO TEORICO….…………………...........................…. ………………………………………88 IMORTANCIA DE LA CROMATOGRAFIA…. ………………………………………………………………..…90 APLICACIONES AL ANALISIS DE ALIMENTOS... …………………………………………………………….91

3

APLICACIONES GENERALES…………………………………………………………………………… ……………93 CONCLUCIONES……………………….. ………………………………………………………………………………..95 ANEXOS………………………………………………………………………………… ……… ……… ……… ……… …..96 GLOSARIO……………………………………………………………………………… …………………………………103 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………… …………………………….....107 LINKOGRAFIA………. …………………………………………………………………………………………… …….108

INTRODUCCIÓN Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se llevaban a cabo por métodos clásicos como son la precipitación, destilación y extracción. Los crecientes esfuerzos por conocer más sobre la composición y función de las proteínas han obligado a los científicos

a

buscar

técnicas,

cada

vez,

más

precisas.

Para elegir una técnica de separación, además de tener en cuenta los criterios económicos y de accesibilidad, hay que atender a dos

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tipos de consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades físicas y estructurales de las moléculas que se pretende separar, o de las características de la matriz en que se encuentran; otras se derivan de los objetivos del análisis (sensibilidad, resolución, tiempo de análisis, necesidad de una detección especifica). El método de selección incluye los pasos necesarios para la obtención, preparación y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicación de la técnica analítica adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos. Las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes grupos: técnicas de separación y técnicas

espectroscópicas.

Las

técnicas

espectroscópicas

proporcionan, para cada compuesto analizado, una información compleja,

relacionada

con

sus

características

estructurales

específicas, por otro lado las técnicas de separación se utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse con fines analíticos cuantitativos o cualitativos. Actualmente

las

separaciones

analíticas

se

realizan

fundamentalmente por cromatografía y electroforesis.

La cromatografía es un proceso de separación muy común en ingeniería química y bioquímica. Es un procedimiento altamente selectivo,

capaz

de

distinguir

y

separar

componentes

con

características físicas y químicas muy similares. Esta técnica se considera importante tanto a nivel de producción como de análisis. La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino también su identificación y

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cuantificación. Se pueden separar moléculas en función de sus cargas, tamaños y masas moleculares. También a través de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc. El análisis cualitativo

está

basado

en

la

medida

de

parámetros

cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la concentración. Las tres clases de cromatografía desde un ángulo más general son cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. Como su nombre lo indica, la fase móvil en las

tres

técnicas

son

líquido,

gas

y

fluido

supercrítico

respectivamente. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. Solo la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse acabo en columna o sobre superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de fluidos supercríticos están restringidas a los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna contienen la fase móvil.

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CAPITULO I

HISTORIA Y DEFINICIÓN 1. ANTECEDENTES HISTORICOS

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1848 Way y Thompson: Reconocieron el fenómeno de intercambio iónico en sólidos. 1850 Runge, Schoenbein, y Goeppelsroeder: Estudiaron el análisis por capilaridad en papel. 1876 Lemberg: Ilustró la reversibilidad y estequiometría del intercambio iónico en minerales como el silicato de aluminio. 1892 Reed: Separación en columna en tubos de kaolín usados para la separación de FeCI3 y el CuSO4. 1906 Tswett: Inventó la cromatografía en columna con el uso de solventes

puros

para

desarrollar

un

cromatograma,

usó

adsorventes suaves para resolver una mezcla de pigmentos, (ver más detalles abajo). 1930 Karrer, Kuhn, y Strain: Usó adsorventes como hidróxido de calcio activado, aluminio y magnesio 1935

Holmes

y

Adams:

Sintetizó

resinas

orgánicas

para

intercambio iónico. 1938 Reichstein: Introdujo la cromatografía líquida o fluida, así extendió las aplicaciones de la cromatografía a sustancias sin color. 1938 Izmailov y Schraiber: Describieron el uso de la capa fina de alumina extendida sobre un vidrio. 1939 Brown: Primero que usó la cromatografía circular en papel. 1941 Martin y Synge: Introdujo la cromatografía por partición en columna. 1944 Consden, Gordon, y Martin: Primeros que describieron la cromatografía de partición en papel. 1947

Boyd,

Tompkins,

Spedding,

Rieman,

y

otros:

Cromatografía de intercambio iónico aplicada a varios problemas analíticos. 1948 M. Lederer y Linstead: Cromatografía en papel aplicada a compuestos inorgánicos. 1951 Kirchner: Introdujo la cromatografía de capa fina como es practicada ahora.

8

1952 James y Martin: Desarrollaron de la cromatografía de gas. 1956 Sober y Peterson: Prepararon las primeras celulosas para intercambio iónico. 1956 Lathe y Ruthvan: Usaron almidón natural y modificado como tamiz para la estimación del peso molecular. 1959 Porath y Flodin: Introdujeron al dextrán entrecruzado como tamiz molecular 1964 J. C. Moore: Desarrolló la cromatografía de permeación en gel. En 1906 el botánico ruso Mikhail Semenovich Tsvett (1872-1919) empleó por primera vez el término "cromatografía" (que proviene del griego χρομα y γραφω que significan a su vez respectivamente "color" y "escribir"). A comienzos del año 1903, Mikhail Tswett usó columnas de adsorción de líquidos para separar pigmentos vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las disoluciones se hacían pasar a través de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido de un material poroso que interacciona de forma diferente con los componentes de la mezcla, de forma que éstos se separaban en distintas bandas a lo largo de la columna. Tswett recopiló y estudió en profundidad la intensa investigación existente

sobre

el

tema

realizada

por

sus

predecesores

y

contemporáneos, lo que se tradujo en una revisión de los principales periodos, métodos de estudio y descripciones de la clorofila. De aquella revisión ya se entreveía que algunos autores de la época se planteaban las posibles modificaciones de la clorofila cuando era extraída de las plantas con la ayuda de reactivos químicos para purificar el compuesto en estado sólido. Los esfuerzos de Tswett se encaminaron a eliminar las razones que podrían hacer cambiar la naturaleza del pigmento verde, por lo que utilizó hojas frescas y eliminó la calefacción. Esta búsqueda de un

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método más racional para la investigación de los pigmentos de las plantas llevó a Tswett a su principal logro científico: el desarrollo de la cromatografía, que abrió una nueva era en el estudio de estos pigmentos, y sobre todo, de la clorofila. Su trabajo entre 1898 y 1900, con 14 publicaciones en revistas británicas y rusas, se recopiló en un trabajo titulado “Composición fisico-química de la partícula de clorofila. Investigación experimental y crítica”, que constituyó su Tesis Magistral en 1901. Durante sus experimentos para intentar extraer la clorofila de las hojas sin modificar, Tswett justificó la falta de resultados cuando se utilizaba éter de petróleo y los resultados positivos cuando se añadía una pequeñísima cantidad de etanol a la presencia de fuerzas de adsorción entre los pigmentos y la matriz de los cloroplastos y encaminó sus esfuerzos a nuevos métodos físicos que permitieran el estudio de la clorofila en su estado natural. Esta idea de competir con las fuerzas de adsorción dio lugar a los experimentos sobre la identificación de materiales capaces de adsorber pigmentos existentes en las hojas verdes, desorbiendo de forma diferencial los componentes de la mezcla. En 1901 llegó a la conclusión que los compuestos cristalinos obtenidos por investigadores del prestigio de Borodin o Monteverde eran sólo artefactos y en realidad consistían en la mezcla de clorofilas a y b derivatizadas con alcohol etílico. Esta afirmación fue considerada insolente y sus datos dudosos. El 21 de marzo de 1903 fue un día memorable para la historia de la cromatografía. En la Sección de Biología de la Sociedad de Ciencias Naturales de Varsovia, Tswett presentó un trabajo titulado “Sobre la nueva categoría de fenómenos de adsorción y sus aplicaciones al análisis bioquímico”. En ella, por primera vez, se establece una clara definición del proceso en el que se basa la nueva técnica analítica: “En la actualidad, bajo el término adsorción se combinan varios

fenómenos,

naturaleza,

que,

corresponden

aunque a

la

posiblemente siguiente

diferentes

definición

en

básica:

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concentración de gases, vapores, líquidos o compuestos disueltos sobre la superficie de cuerpos sólidos”. En una posterior publicación en alemán en 1906, Tswett describió con detalle cómo obtenía los pigmentos de hojas frescas trituradas con éter de petróleo al que añadía pequeñas cantidades de alcohol, que posteriormente eran eliminadas por agitación con agua destilada.

El

extracto

de

pigmentos

se

separaba

en

sus

componentes con ayuda del “cromatógrafo”. En su primera versión fue tan simple como el que se encuentra en la figura 1 (todavía utilizado en cromatografía preparativa) y después evolucionó al sistema de la figura 2 para aumentar el número de experimentos. En sus trabajos hasta 1910 Tswett examinó hasta 128 adsorbentes en los que describió diferentes comportamientos. Tras anunciar la invención de esta nueva técnica en 1903, Tswett la empleó para

obtener

muestras

químicamente puras

de las

clorofilas a y b, y aportó la prueba incuestionable de la heterogeneidad del pigmento verde de las plantas, aunque no fue el primero en proponer esta heterogeneidad. Además descubrió una tercera forma de clorofila en algas, la clorofila c. A Tswett se le ha considerado posteriormente el descubridor de todas las formas de clorofila, aunque él siempre atribuyó al científico inglés Sorby este descubrimiento, realizado treinta años antes. De hecho, por este empeño, Tswett entró en polémica con L. Marchlewski, el principal investigador europeo de la hemoglobina y la clorofila al principio del siglo XX, quien, junto con C. Schunk, se arrogó el descubrimiento de las dos formas principales. Tswett afirmó que los experimentos de Marchlewski y Schunk no eran sino meras reproducciones de los experimentos de Sorby, y en defensa de la novedad de su método y de sus resultados, Marchlewski declaró que Tswett mentía e incluso que los artículos de Tswett no merecían

ninguna

atención

y

además

que

el

método

cromatográfico sería algo que no tendría ninguna utilidad en el futuro.

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En los años siguientes se mantuvo una agria polémica entre los dos investigadores, centrada en la existencia de las distintas formas de las clorofilas, que pareció zanjada cuando Marchlewski aceptó que la metodología de Tswett era adecuada y que Sorby había descrito previamente resultados como los suyos. Las discusiones más intensas de Tswett fueron con el químico orgánico R. Willstäter, que sería premio Nobel en 1915, principal discípulo del fundador de la moderna química orgánica alemana, A. Baeyer, premio Nobel de 1905. Willstäter siguió una aproximación química para el estudio de la composición y naturaleza de los pigmentos vegetales, analizando y estudiando la estructura de varios derivados de esos pigmentos mediante la acción de determinados reactivos como ácidos, álcalis, etc. La discusión se mantuvo durante muchos años, dado que Tswett mantenía que no se podía hacer ese análisis orgánico puesto que las sustancias no estaban suficientemente purificadas, porque las técnicas empleadas no permitían la total separación de los compuestos, mientras que Willstäter afirmaba que no se podía considerar purificación un proceso que no se basaba en la cristalización para dar lugar a un compuesto sólido. A pesar de estas polémicas, Tswett logró en vida un cierto reconocimiento a su trabajo, pues le llegaron a conceder en 1912 el premio Akhmatov (consistente en 1000 rublos), y fue incluso propuesto para la obtención del Premio Nobel de 1918. El mentor destacó en su informe los trabajos realizados sobre la adsorción. A partir de 1910 su salud, que nunca había sido muy buena, empezó a deteriorarse y por si ello fuera poco Rusia, en plena Revolución, decidió tomar parte en la Primera Guerra Mundial. En una época convulsionada por profundos cambios, Tswett perdió todos sus archivos y fases adsorbentes, ya cuidadosamente recopiladas por entonces.

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El 16 de junio de 1919 murió, a los 47 años, víctima de su debilitado corazón y de una vida siempre en condiciones de precariedad económica. La actitud enormemente crítica hacia la investigación de Tswett sobre clorofilas y carotenoides por parte de sus colegas demuestra que sus innovaciones no encontraron gran apoyo. Las actitudes mayoritarias

en

aquellos

años

fueron

predominantemente

negativas y durante la primera década tras la muerte de Tswett el número de publicaciones en los que se usaba la cromatografía disminuyó radicalmente, principalmente porque los resultados obtenidos

por

el

primer

cromatografista

del

mundo

fueron

ignorados. Uno de los motivos aducidos para esta falta de reconocimiento fue que la principal publicación de Tswett no fue accesible para los científicos de la Europa Occidental porque estaba escrito en ruso, y además porque era una rareza bibliográfica, una edición de su tesis doctoral. Aunque esto pueda ser cierto, no es menos cierto que Tswett publicó numerosos artículos en revistas de otros países, y realizó demostraciones de su técnica en las distintas sociedades científicas europeas, pues sus conocimientos de francés, ruso, inglés y alemán le permitieron estar en o con las sociedades internacionales de mayor prestigio. También se ha aducido para justificar esta falta de reconocimiento el que las publicaciones de Tswett fueran mayoritariamente dedicadas al campo de los pigmentos vegetales en revistas de botánica, pero también presentó sus resultados en revistas de química sas y alemanas. El olvido en el que se mantuvo el descubrimiento de Tswett es posible que se deba sobre todo a la falta de confianza que alguno de los principales científicos de su tiempo mantuvo acerca de la cromatografía, fundamentalmente Willstäter. Mientras vivió, nadie excepto Tswett se atrevió a desafiar a Willstäter cuando afirmaba que él había sido el primero en obtener las clorofilas a y b

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químicamente puras, y tras la muerte de Tswett en 1919, la investigación sobre los pigmentos de las plantas fue prácticamente monopolizada por la escuela de Willstäter. Como Ettre y Horváth escribieron mucho más tarde, “…en este periodo Willstäter era el Papa (sic) en este campo” (el de las crorofilas), por lo que Synge llegó a afirmar en 1970 que “…el peso de la autoridad científica de Willstäter hizo que la sociedad científica ignorara las ideas de Tswett”. En los años treinta revivió el interés por la técnica, y fue “redescubierta” por Winterstein y Stein en Alemania para separar los distintos carotenoides de las plantas. Existe una frase que Tswett escribió varias veces, cuya autoría ha sido atribuida a distintos personajes: “Cualquier avance en la ciencia es un avance del método”. Resume muy bien lo que fue su vida y su principal descubrimiento: una técnica poderosísima para conocer más acerca de los pigmentos vegetales. Varios años tras su muerte, a su lápida se añadió el siguiente epitafio: “Destinado a descubrir la cromatografía, la ciencia que separa moléculas y une personas” Los primeros equipos de cromatografía de gases aparecieron en el mercado a mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) comenzó a desarrollarse en los años 1960, aumentando su importancia en las décadas siguientes, hasta convertirse en la técnica cromatográfica más empleada. Sin embargo esto se ira modificando con el paso de los años.

14

1.1 ASPECTOS HISTÓRICOS DE LOS DISTINTOS TIPOS DE CROMATOGRAFÍA Cromatografía en papel Fue desarrolla por Martin. Tiene como soporte un papel de celulosa. Adquirió una gran extensión por su sencillez y presenta la ventaja de poder utilizar miligramos y microgramos, además presenta la opción de utilizar tanto la técnica descendente (en columna, etc...) como la técnica ascendente. Cromatografía en capa fina Fue originada por los trabajos de los investigadores rusos Izmailov y Schraiberen en 1938 al separar mezclas de tinturas farmacéuticas. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria se extiende sobre un soporte inerte, la dificultad que presentaba el método era el crear una capa homogénea, sin ningún tipo de rugosidad. La cromatografía en capa fina tuvo valor limitado hasta que Stahl estandarizó el método para elaborar capas finas por métodos mecánicos. Cromatografía de intercambio iónico Esta técnica apareció durante la II Guerra Mundial y en principio tenía la finalidad de separar las tierras raras y los elementos de transición. En 1938 Taylor y Urey utilizan este método para separar isótopos de Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita. En 1939 Samuel logra sintetizar resinas de intercambio iónico. Cromatografía de gel-filtración Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como fase estacionaria geles se consigue separar polímeros sintéticos de alto peso molecular. Cromatografía de afinidad. Ideada por Porath en 1967, usando como fuente un péptido o proteína unida covalentemente a un ligando y se utiliza para la separación de moléculas proteicas. Cromatografía de gas.

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Es una de las técnicas más utilizadas e importantes, de forma que ha revolucionado el campo de la química analítica.

2. PREMIOS NOBEL EN CROMATOGRAFÍA  Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica, y obtienen el premio Nobel por sus trabajos en 1937,

1938, 1939

respectivamente.  En 1952 Archer J. P. Martin y Richard L. M. Synge por la invención de la cromatografía de reparto sobre papel. 3. DEFINICIÓN La palabra Cromatografía significa "Escribir en Colores" ya que cuando

fue

desarrollada

los

componentes

separados

eran

colorantes. La cromatografía es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla y en algunos casos identificar estos si es que no se conoce su composición. Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria y con la fase móvil. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Después de haber pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado pasan por un detector

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que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de compuesto. En 1906 Tswett definió la cromatografía como: Método en el cual los componentes de una mezcla son separados en una columna adsorbente dentro de un sistema fluyente. Recientemente la I.U.P.A.C define la cromatografía de forma más amplia como: Método

usado

principalmente

para

la

separación

de

los

componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc. Se utiliza el término general de lecho para definir las distintas formas en que puede encontrarse la fase estacionaria. Las separaciones

cromatográficas

se

consiguen

mediante

la

distribución de los componentes de una mezcla entre la fase fija y la fase móvil. La separación entre dos sustancias empieza cuando una es retenida más fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más rápidamente en la fase móvil. Las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos fases y que pueden ser: 1.-La adsorción, que es la retención de una especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. 2.- La absorción, que es la retención de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla

con

la

primera,

absorción

pura,

o

a

reaccionar

químicamente con la misma, absorción con reacción química, considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial.

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Según Keulemans ha definido la cromatografía como: Un método físico de separación en el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye la fase estacionaria, de gran área superficial, y la otra es un fluido (fase móvil) que pasa a través o a lo largo de la fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte, de gran área superficial. La fase móvil es un fluido (puede ser gas, líquido o fluido supercrítico) que se usa como portador de la mezcla. En la cromatografía ocurren dos fenómenos muy importantes y que son prácticamente los rectores del proceso de separación: la adsorción y la absorción. La adsorción es la retención de una especie química en los sitios activos de la superficie de un sólido, quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. Esta retención superficial puede ser física o química. La adsorción depende de la naturaleza de la substancia adsorbida, de la temperatura, de la naturaleza y estado de subdivisión del adsorbente, y de la concentración. La absorción es la retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o reaccionar químicamente con la misma.

18

19

CAPITULO II

CLASIFICACIÓN DE CROMATOGRAFIA Para

clasificar

globalmente

los

procesos

cromatográficos

es

necesario atender a dos criterios básicos: 

Fundamento del proceso cromatográfico, lo que conduce a los

tipos de cromatografías.

20



Forma de realizar el proceso cromatográfico, es decir, lo que

constituye las distintas técnicas cromatográficas. 1. CROMATOGRAFÍA DE REPARTO Sustancias muy diferentes, como las limaduras de hierro y las partículas de vidrio, pueden separarse con facilidad utilizando un imán; la arena y el azúcar; pueden separarse disolviendo el azúcar en agua. No obstante, si las sustancias presentan propiedades físicas y químicas similares, los métodos de separación tendrán que ser más complejos y sutiles. En la cromatografía de reparto las sustancias

se

colocan

en

un

sistema

que

consta

de

dos

componentes distinguibles por métodos físicos —una fase móvil y otra estacionaria— y las diferentes moléculas se separan debido a diferencias (muchas de ellas, pequeñas) de distribución entre las dos fases citadas. El movimiento relativo de cada molécula es el resultado de un equilibrio entre la fuerza de transmisión (es decir, el movimiento de la fase móvil) y las fuerzas que tienden a frenar este desplazamiento. Las fuerzas de frenado que se van a considerar a continuación, son el reparto y la adsorción. La teoría de la cromatografía de reparto se basa en que, en general, si dos fases se encuentran en o una con otra y si una o las dos fases contienen un soluto, éste se distribuirá entre las dos fases. Este fenómeno recibe el nombre de reparto y viene descrito por el coeficiente de reparto, o sea, la relación entre las concentraciones del soluto en las dos fases. La cromatografía de reparto se describirá en términos del funcionamiento de una columna —es decir, un tubo lleno de un sorbente y un disolvente. Una disolución que contiene el soluto se coloca en la parte superior del sorbente y puede penetrar en su interior. A continuación se permite fluir el disolvente a través de la columna. Aunque el sorbente y el disolvente adoptan una disposición continua a todo lo largo de la columna, ésta puede considerarse formada por un gran número de capas individuales

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(«láminas teóricas») que contienen, cada una, las dos fases. Considérense

256

moléculas

idénticas

que

se

distribuyen

igualmente entre las dos fases, estacionaria y móvil, y una columna con dieciocho láminas (figura 8-1). En la placa superior (u origen) las 256 moléculas están distribuidas de forma que 128 se encuentran en cada fase. Cuando las 128 moléculas móviles de la lámina 1 entran en la segunda lámina, se redistribuyen en 64 y 64; de las 128 que permanecen en la lámina 1 también se distribuyen 64 y 64 según se indica en la figura 8-1. Si la fase móvil vuelve a avanzar otra vez una lámina más, vuelve a tener lugar una redistribución de las moléculas. Después de 20 transferencias sucesivas se consigue la situación que se indica en el gráfico. Si se supone que inicialmente también había 256 moléculas idénticas de un tipo diferente al anterior (se indican por números en trazado fino), que se distribuyen en una proporción de tres a uno en la fase estacionaria con respecto a la móvil, la figura 8-1 también indica la distribución

de

este

tipo

de

moléculas

después

de

20

transferencias. Las distribuciones de estos dos tipos de moléculas son diferentes y a lo largo del procesó se separa una fracción sustancial de las moléculas. A medida que aumenta el número de láminas teóricas (es decir, según aumenta la longitud de la columna) se conseguirá una mayor separación. Debe observarse que, según aumenta el número de láminas, el material se extiende a través de una zona cada vez mayor de la columna. En una situación real en la que el número de moléculas total sea muy elevado (es decir, > 1016), el numero final en la lámina 1 no llegará a cero. Por otra parte, el grado de difusión disminuirá en el sentido de que un porcentaje cada vez mayor del material se .encuentra en un número reducido de láminas. Por ejemplo, en la figura 8-1, el 40 % de las moléculas que se distribuyen en una proporción, después de 8 transferencias se encuentran contenidas en 4/8 de Tas láminas. Al cabo de las 20 transferencias el 40 % se encuentra en un 6/16 o en un -3/8 de las láminas. Estas considera-

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ciones ponen dé manifiesto que en un caso ideal en el que la distribución venga únicamente determinada por el reparto, la resolución de dos sustancias mejorará con el aumento de la longitud de la fase estacionaria. 1.1 Ejemplos de cromatografía de reparto Los dos tipos de cromatografía de reparto más corrientes son la cromatografía en papel y la de capa fina. En los dos casos la matriz contiene un líquido, en la cromatografía en papel se trata de las moléculas de agua unidas a la celulosa y en la cromatografía de capa fina el líquido unido al soporte es el disolvente utilizado para formar la capa fina (véanse las páginas 195-199). (Estas técnicas a veces se consideran como tipos de cromatografía de adsorción, porque los efectos de adsorción entran dentro de la consideración de separación; sin embargo, el principal tipo de acción que tiene lugar es el reparto.) La cromatografía de reparto también puede realizarse en columnas, utilizando una matriz que no adsorba los solutos. Los materiales de soporte más corrientes son la tierra de diatomeas (p. e., Celita), el gel de sílice, la celulosa en polvo y algunos dextranos que forman tramas (p. e., Sephadex -LH20). La fase estacionaria se crea suspendiendo el soporte o lavando la columna con el sorbente adecuado. De esta forma, el sorbente recubre las partículas del soporte y es retenido por adsorción o simplemente penetra en los intersticios de las partículas y es retenido allí por capilaridad. Es importante notar que la fase estacionaria no ocupa los espacios situados entre las partículas; este espacio será ocupado por la fase móvil. Los materiales típicos de la fase estacionaria son disolventes hidrófobos como el benceno, cuando se trate de separar materiales no polares, o disolventes hidrófilos como un alcohol, cuando se trabaja con materiales polares. Obsérvese que los materiales de la fase estacionaria son líquidos.

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La cromatografía de reparto se utiliza, sobre todo, para moléculas de bajo peso- molecular. Para reducir la extensión por difusión (es decir, el ensanchamiento de los picos), son necesarias zonas de iniciación muy pequeñas y una separación rápida. En los apartados que tratan de cromatografía en papel y en capa fina, se describirá con detalle cómo se realizan estos procesos.

2. CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN Considérese una superficie sólida que contenga una amplia variedad de sitios de unión --por ejemplo, regiones con una densidad electrónica elevada (cargadas negativamente), con una densidad electrónica baja (cargadas positivamente), no polares, y así sucesivamente— y un líquido que contiene un soluto, en o con la superficie. Si la unión es reversible, el número de moléculas unidas a la superficie dependerá de la concentración de soluto. Esta dependencia (existen tres tipos posibles) se muestra en la figura 8-2. Las curvas de este tipo reciben el nombre de isolíneas de adsorción. El tipo más corriente es la curva convexa, es decir, los sitios de unión con una afinidad elevada son rellenados en primer lugar, de modo que las cantidades adicionales de soluto se unen con menos fuerza. La isolínea de unión es característica de cada molécula concreta y de cada sorbente. Si se aplica a la superficie una concentración dada de una molécula (que en la práctica es, por lo general, un conjunto de partículas en una columna o sobre un soporte sólido) y se deja fluir un disolvente a través de la superficie, una cantidad fija de moléculas se unirá a la superficie y el resto se desplazará a lo largo de la misma. El material que avanza podrá volverse a enlazar con dos diferencias: (1) la fuerza de retraso es la unión o adsorción y (2) la fracción que

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se une no es una fracción constante, sino que disminuye a medida que disminuye la concentración. La velocidad con que se mueve la sustancia está relacionada con la fuerza de unión, siendo más lento el movimiento cuanto más firme es la unión. En consecuencia, las moléculas pueden separarse si tienen isolíneas de adsorción diferentes, debido a que sufrirían un grado diferente de retraso. Tabla 1. Materiales de uso corriente en la cromatografía de adsorción. Material Alúmina

Sustancias separadas Pequeñas moléculas

Gel de sílice Carbón activado

orgánicas, proteínas. Esteroles, aminoácidos. Péptidos, aminoácidos,

Gel de fosfato cálcico Hidroxiapatito

glúcidos. Proteínas, polinucleótidos Ácidos nucleicos.

2.1 Tipos de cromatografía de adsorción La cromatografía de adsorción utiliza una fase líquida móvil y una fase estacionaria sólida, con la única excepción de la cromatografía de gases. La separación puede tener lugar en columnas o en capa fina. La tabla 8-1 indica los adsorbentes más comunes y sus diferentes utilizaciones. Una importante variación de la cromatografía de adsorción, es la cromatografía de intercambio iónico. La diferencia principal estriba en la composición de la fase móvil; ésta es de tal naturaleza que cuando el material se aplica al adsorbente, el soluto queda inmovilizado. La migración no empieza hasta que se añade una fase móvil. No hay diferencias de principio, pero éste es un caso especial en el cual la adsorción es muy fuerte. Es importante comprender que las cromatografías de adsorción y reparto no son exclusivas entre sí, ya que los efectos de adsorción pueden estar presentes en la cromatografía en papel, de capa fina e incluso, a veces, en la cromatografía en gel.

25

2.2 Funcionamiento de las columnas Probablemente el método más corriente para contener la .fase estacionaria

o

soporte

es

una

columna.

Una

columna

cromatográfica consiste en un tubo que Se llena con el material de la fase estacionaria, más un disolvente. A continuación se coloca un pequeño volumen (es decir, una capa delgada) de la muestra sobre la fase estacionaria, y se le deja penetrar en la columna (lo que recibe el nombre de carga de la columna). El cromatograma se desarrolla entonces dejando fluir un disolvente (la fase móvil) a través de la columna (figura 8-3). Este último proceso recibe el nombre de elución de la columna. Según se van moviendo las diferentes sustancias a través de la columna, se van separando y aparecen en el efluente cuando han atravesado la columna unos volúmenes determinados de líquido. El volumen total de material de la columna, tanto sólido como líquido, recibe el nombre de volumen del lecho. El volumen de la fase móvil es el volumen vacío o de retención. La cantidad de líquido que debe añadirse para producir un pico de un soluto concreto en el efluente se llama volumen de elución. La forma en la que se prepara el lecho de una columna se denomina empaquetamiento. Es muy importante que el lecho sea homogéneo y no presente burbujas, grietas o espacios entre las paredes. El flujo desigual que resulta de la falta de homogeneidad, se

denomina

flujo

acanalado.

El

efecto

normal

de

éste

acanalamiento es la distorsión del patrón de elución, de forma que una sustancia aparece en picos múltiples. Ello es el resultado del movimiento' rápido de la fase móvil a través de la columna en estas desigualdades, y el restablecimiento del reparto o la adsorción en un nuevo punto. El líquido que abandona la columna (el efluente) se recoge, por lo general, en fracciones discretas utilizando un colector automático como se indica en la figura 8-4. Los componentes que ya están

26

separados se encuentran e identifican titulando alícuotas de cada fracción

—haciendo

mediciones

espectroscópicas,

pruebas

químicas, radiactividad, etc. En los casos en que el análisis se realiza

midiendo

la

absorción

de

la

luz,

se

utiliza

un

espectrofotómetro de registro continuo. La muestra pasa" á través de un tubo antes del fraccionamiento, se mide la absorbancia en la longitud de onda apropiada y se representan los valores en un registrador gráfico de forma continua. Las columnas pueden ser eluidas de tres formas: el método más sencillo consiste en un flujo continuo del disolvente a través de la columna. Este método es de uso corriente en la cromatografía de intercambio iónico y en la cromatografía en gel. La elución por pasos se utiliza, en general, cuando la columna funciona con propósitos preparativos. La columna es eluida con un disolvente

hasta

que

se

alcanza

un

volumen

previamente

determinado. A continuación se añade un segundo disolvente. Este método tiene la ventaja de que se pueden disponer las condiciones de forma que un material concreto pueda eluirse en un volumen bastante pequeño. Considérese, por ejemplo, una mezcla de sustancias en la que la sustancia X sufre un fuerte retardo cuando se emplea el disolvente A, mientras que las demás sustancias experimentan un retraso muy pequeño; además X experimenta "un retraso muy débil con el disolvente B. Por lo tanto, si se lava la columna con un exceso de disolvente A, la mayor parte del material es eluido de la columna, mientras que la mayor parte de X permanece unido a ella. Si a continuación se lava la columna con el disolvente B, se eluye X con rapidez y en un volumen relativamente pequeño. El tercer método es la elución en gradiente, que consiste en cambiar la relación de dos disolventes o en elevar la concentración de uno o más de los componentes del disolvente (p. e., la concentración de sales). Este último método es el más utilizado en las columnas de adsorción y de intercambio iónico. Los gradientes

27

se preparan por medio de aparatos del tipo que se muestra en la figura 8-5. Estos aparatos constan de dos recipientes, un depósito y una cámara de mezcla, que están conectados por sus bases. El depósito contiene el disolvente más concentrado. El líquido sale de la cámara de mezcla y entra en la columna. Como los niveles hidrostáticos deben corresponderse (las alturas de los líquidos no tienen que ser necesariamente iguales, porque las densidades de los líquidos en ambos recipientes puede variar), el liquido fluye simultáneamente del depósito a la cámara de mezcla. Si las cámaras tienen la misma forma el gradiente es lineal; también pueden prepararse gradientes cóncavos o convexos, según se muestra en la figura 8-5. 3. CROMATOGRAFÍA EN GEL La cromatografía en gel (que algunas veces recibe el nombre de cromatografía

de

tamiz

molecular)

es

un

tipo

especial

de

cromatografía de reparto, en la que la separación se basa en el tamaño molecular. La base de la cromatografía en gel es bastante sencilla. Se prepara una columna de partículas muy finas de una sustancia inerte, que contenga poros muy pequeños. Si se hace pasar una disolución con moléculas de distintas dimensiones a través de la columna (figura 8-18), las moléculas con un tamaño mayor que el de los poros se moverán sólo en el espacio que queda entre las partículas y, por lo tanto, no sufrirán retraso en su recorrido a través del material de la columna. Sin embargo, las moléculas con un tamaño menor que el de los poros difunden hacia el interior y el exterior de las partículas con una probabilidad que aumenta a medida que disminuye el tamaño molecular. Debido a ello, su movimiento de descenso a través de la columna se hace más lento. La probabilidad de penetración es el factor principal que determina la velocidad de movimiento a través de la columna, puesto que el material que forma las partículas (es decir, el gel) no adsorbe las moléculas.

28

Por lo tanto, las moléculas son eluidas de la columna por orden de tamaños decrecientes, o, si la forma es relativamente constante (por ejemplo, globular o cilíndrica), por orden de pesos moleculares decrecientes. En un análisis detallado de la cromatografía en gel, queda claro que este efecto estérico, aunque es el principal factor, no explica por si sólo el comportamiento cromatográfico de todas las moléculas. Otro factor importante es la carga de la molécula, aunque ésta se manifiesta sólo en condiciones de baja fuerza iónica, en las que las moléculas

pequeñas,

fuertemente

cargadas,

parecen

quedar

excluidas de los poros, independientemente de que su tamaño sea lo suficiente pequeño. Este efecto se debe, con probabilidad, a la repulsión electrostática entre las moléculas, que limita el número de moléculas en un poro en cualquier momento dado. Cuando la fuerza iónica es muy pequeña, también parecen existir efectos de adsorción, al menos en apariencia y en algunos tipos de geles. 3.1 Materiales para la cromatografía en gel Un gel es un retículo tridimensional cuya estructura se dispone, por lo general, al azar. Los geles que se utilizan como tamices moleculares constan de polímeros entrecruzados, por lo general, inertes, que no se unen ni reaccionan con el material analizado y que no presentan carga eléctrica. El espacio del interior del gel está ocupado por un líquido que rellena la mayor parte del gel. Los geles de uso corriente son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida. Se utilizan para disoluciones acuosas. El dextrano es un polisacárido compuesto por restos de glucosa y producido a partir de sacarosa por la bacteria Leuconostoc mesenteroides. entrecruzamiento

Se para

prepara controlar

con el

diversos tamaño

del

grados poro

de y

es

suministrado en forma de granos secos, con diversos grados de finura, que se dilatan cuando se les añade agua. El proceso por el que los poros quedan llenos del líquido utilizado como efluente,

29

recibe

el

nombre

de

hinchazón.

El

dextrano

se

obtiene

comercialmente con el nombre de Sephadex (Phannacia Fine Chemicals, Inc.). La agarosa (que se obtiene de ciertas algas marinas) es un polímero lineal de D-galactosa y 3,6-anhidro-1-galactosa y forma un gel

que

se

mantiene

compacto

sin

necesidad

de

entrecruzamientos, por medio de puentes de hidrogeno. Se disuelve en agua hirviendo y forma un gel cuando se enfría. La concentración del material en el gel determina el tamaño de los poros —que son mucho mayores que los de Sephadex—. Debido a ello, es útil para el análisis o la separación de grandes proteínas globulares o grandes moléculas lineales como el DNA. La agarosa es inservible como gel sólido, debido a que la velocidad de flujo es demasiado baja en esas condiciones; por ello, es suministrada en forma de granulos húmedos que reciben el nombre de Sepharosa (Pharmacia

Fine

Chemicals,

Inc.)

y

de

Bio-gel

A

(Bio-Rad

Laboratories). Los geles de poliacrílamida se preparan entrecruzando acrilamida con N.N’-metilén-bis-acrilamida. En este caso el tamaño de poro también viene determinado por el grado de entrecruzamiento. Estos geles se diferencian de los geles de dextrano y de agarosa en que contienen un grupo carboxilamida polar en átomos de carbono alternados. Sin embargo, sus propiedades de separación son casi las mismas que las de los dextranos, Los geles de poliacrilamida, los cuales reciben el nombre de Bio-gel A (Bio-Rad Labora-tories), parecen ser tan útiles como los dextranos, aunque se han usado con menor frecuencia. Tienen la ventaja sobre los dextranos de poder obtenerse comercialmente en un amplio margen de tamaños de poro. Recientemente

se

han

utilizado,

para

disoluciones

acuosas,

gránulos de vidrio poroso (Bio-Glas, Bio-Rad Laboratorios), pero de momento los datos experimentales de que se dispone son muy limitados.

30

Los geles descritos hasta el momento se dilatan en agua y en unos pocos disolventes orgánicos: glicol, formamida y dimetiisulfóxido. No sufren hinchazón en alcohol puro, hidrocarburos y la mayoría de los disolventes orgánicos, tanto polares como no polares. No obstante, sustancias como lípidos, esferoides y algunas vitaminas, se manejan con mayor facilidad en estos disolventes. Se han desarrollado algunos geles para conseguir este propósito. Existe un gel entrecruzado de poliestireno (Styragel, Dow Chemical Co.; Biobeads S, Bio-Rad Laboratorios) para cromatografía en gel" con disolventes orgánicos no polares, que ha sido utilizado con éxito. Para

los

disolventes

orgánicos

polares

existe

un

Sephadex

motilado. También existe un derivado hidroxipropilo de dextrano entrecruzado (Sephadex LH) que puede utilizarse tanto con disolventes polares como no polares. Por lo general, el tamaño de poro determina el margen de pesos moleculares en los que tiene lugar el fraccionamiento. La tabla 8-2 muestra

los

valores

representativos

para

algunos

de

estos

materiales. Normalmente no existen dificultades para seleccionar el material apropiado. Sin embargo, los gránulos de gel vienen en diversos tamaños: grueso, medio, fino y superfino. Cuanto mayor es el tamaño, mayor es la velocidad de flujo y menor la resolución. Por lo tanto, se utiliza el granulo superfino si se precisa una resolución máxima —por ejemplo, para un trabajo analítico—. El gránulo fino se recomienda para la mayoría de los trabajos preparativos en los que las columnas son bastante largas y la velocidad de flujo es de cierta importancia. Las medidas más gruesas se utilizan en preparaciones muy extensas, en las que la resolución es de menos importancia que el tiempo. 3.2 Ventajas de la cromatografía en gel La cromatografía en gel es insuperable para la separación de moléculas que se diferencian en su peso molecular, por las siguientes razones:

31

1. Debido a que el comportamiento cromatográfico de casi todas las sustancias en los geles es independiente de la temperatura, pH, fuerza iónica y composición de los lampones, se pueden realizar separaciones prácticamente bajo cualquier condición. Cuando se trabaja con materiales muy lábiles (p. e., enzimas) esto significa que pueden mantenerse las condiciones para una estabilidad máxima. 2. Muchas

sustancias

lábiles

no

resultan

afectadas

por

la

cromatografía en gel, puesto que no hay prácticamente adsorción. Por ejemplo, algunos enzimas resultan inactivados o alterados por la unión a superficies adsorbentes o resinas de intercambio iónico. 3. Existe menos dispersión de las bandas que con otras técnicas cromato-gráficas (por razones que no están claras). 4. El volumen de elución se relaciona de forma sencilla con el peso molecular.

Tabla 2. Materiales de uso corriente en la cromatografía en gel. Material

y

nombre

Margen

comercial

fraccionamiento

Dextrano

molecular) 700

Sephadex G-10

1 000 – 5 000

Sephadex G-25

3 000 – 70 000

Sephadex G-75

5 000 – 800 000

de (peso

Sephadex G-200 Poliacrilamida Bio-gel P-2

200 -2 000

Bio-gel P-6

1 000 – 6 000

Bio-gel P-150

15 000 – 150 000 32

Bio-gel P-300 Agarosa

60 000 – 400 000

Sepharosa 2 B

2 x 106 – 25 x 106

Sepharosa 4 B

3 x 105 – 5 x 105

Bio-gel A-0,5 M

30 000 – 500 000

Bio-gel A-15 M

30 000 – 15 x 106

Bio-gel A-150 M

5 x 106 – 150 x 106

3.3 ESTIMA DEL PESO MOLECULAR Se ha observado, con distintos tipos de geles, que la representación de un parámetro K en función del log M (peso molecular) da como resultado una línea recta, excepto con las moléculas demasiado grandes o demasiado pequeñas (véase la figura 8-19). Las únicas desviaciones son las pequeñas moléculas aromáticas, moléculas fuertemente cargadas en condiciones de fuerza iónica muy baja (<< 0,01) y algunas moléculas de forma alargada como el colágeno y el fibrinógeno. El parámetro K se define como (Ve — V0)/Vs donde Ve es el volumen del disolvente que se necesita para eluir las moléculas de interés, V0 es el volumen vacío o bien el volumen que se precisa para eluir una molécula que nunca entra en la fase estacionaria y V, es el volumen de la fase estacionaria. En la cromatografía en gel, el volumen del gel (que es principalmente el volumen de sus poros) es Vs y V0 es el volumen para Una sustancia completamente excluida por el gel; V0 se mide normalmente haciendo pasar material de elevado peso molecular, excluido, como dextrano azul, a través de la columna, y V, se mide como V t—V0donde Vt es el volumen total de la columna. Para las proteínas globulares y para muchos carbohidratos, esta técnica es muy fiable cuando se utilizan varios tipos de Sephadex y Bio-gel P. La estima de M puede realizarse a partir de extractos celulares no fraccionados, siempre y cuando pueda medirse la proteína; casi todos los demás métodos requieren muestras muy puras. Por lo tanto, para determinar M sólo hay que incluir algunas 33

moléculas de A conocido para definir la línea recta, calculándose entonces la M de la muestra por interpolación. La precisión de estas determinaciones es de cerca de un 10 %. Una variación algo más precisa de esta técnica se describe en la sección de cromatografía en gel de capa fina. La determinación de la distribución de pesos moleculares es, con frecuencia, importante en la caracterización de polímeros naturales y sintéticos. De nuevo, con métodos físicos como la centrifugación, se requiere un material relativamente puro. Sin embargo, con la cromatografía en gel es posible determinar la distribución midiendo simplemente la cantidad de sustancia en función del volumen de elución. Esto se hace preparando una curva de calibración y utilizando una corrección matemática relativamente simple para la extensión de la muestra en una zona del gel. 3.4 Aplicaciones de la cromatografía en gel La cromatografía en gel es básicamente un método de separación y se ha utilizado ampliamente en la purificación de enzimas y otras proteínas, y en el fraccionamiento de ácidos nucleicos. Los geles de dextrano son especialmente útiles para proteínas inestables, como se ha explicado anteriormente. En trabajos preparativos, tanto los dextranos como las poliacrilamidas se han utilizado en volúmenes que van desde unos pocos mililitros a varios litros. Para fines industriales se ha llegado a emplear columnas de 1000 litros. Se han fraccionado y purificado con éxito diversos tipos de RNA y virus, utilizando geles de agarosa. En las purificaciones de macromoléculas en gran escala, en las que se necesitan diversos tipos de fraccionamiento, a menudo es necesario eliminar sales, cambiar lampones, concentrar y eliminar sustancias como el fenol y los detergentes utilizados en el aislamiento

y

purificación

de

ácidos

nucleicos.

Con

los

procedimientos habituales, es un proceso que consume mucho tiempo (p. e., por precipitación o diálisis), y por esta razón puede

34

dar como resultado la pérdida de las muestras inestables. No obstante, la cromatografía en gel proporciona un camino rápido para realizar este proceso. Por ejemplo, las sales y las moléculas pequeñas pueden eliminarse con rapidez debido a que resultan retrasadas en todos los geles. El intercambio de tampones puede realizarse haciendo pasar una disolución de macromoléculas a través de una columna equilibrada previamente con el tampón deseado. Como las macromoléculas se mueven con más facilidad a través del gel que los componentes del tampón original, podrán ser eluidas en el tampón en el qué se ha equilibrado el gel. La concentración de macromoléculas se logra con facilidad añadiendo partículas secas de gel y utilizando un tipo cuyo tamaño de poro sea menor que el de las moléculas con la que se esté trabajando. A medida que se hinchan los gránulos, absorben el agua pero no las macromoléculas, concentrándose éstas últimas. La mayor parte de los métodos de concentración de macromoléculas presenta el problema de que también concentran las sales y una concentración excesiva de sales puede alterar (e incluso disociar y desnaturalizar) algunas macromoléculas. Este problema no existe si se utilizan geles que absorban el agua y las sales. A continuación se describen algunos ejemplos específicos de cromatografía en trabajos preparativos: 1. En la síntesis química de algunos reactivos es necesario, en general, separar el producto de las sustancias iniciales. Por ejemplo, cuando se preparan anticuerpos fluorescentes haciendo reaccionar los anticuerpos con isotiocianuro de fluoresceína, la proteína conjugada debe separarse del colorante que no ha reaccionado. Esto puede realizarse con Sephadex, utilizando geles que permitan el paso de grandes proteínas por el espacio vacio. Por supuesto, no se separa la proteína que no ha reaccionado de la proteína conjugada, pero ello no es necesario en la técnica de los anticuerpos fluorescentes.

35

2. En la titulación de enzimas o en la determinación de los requerimientos de cofactores, la preparación de enzimas contiene a veces inhibidores de pequeño tamaño molecular o los mismos cofactores. También en los estudios físicos de algunas moléculas (p. e., en la espectroscopia de fluorescencia) pueden estar presentes sustancias de interferencia. Estas moléculas pequeñas pueden eliminarse con facilidad utilizando geles de dextrano o de poliacrilamida. 3. De forma similar, pueden existir contaminantes de gran tamaño molecular en mezclas en las que están analizando moléculas pequeñas. En estos casos pueden utilizarse dextranos de poro pequeño. También en ocasiones deben separarse ácidos nucleicos de proteínas; esto puede hacerse algunas veces mediante el empleo de geles de agarosa, que impiden el paso a las proteínas y permiten el paso a los ácidos nucleicos por el volumen vacío. 4. En la mayoría de los análisis físicos de ácidos nucleicos, la muestra debe estar libre de proteínas. Esto puede hacerse con facilidad. Un ejemplo de interés en mi propio laboratorio es la preparación de DNA a partir de extractos celulares en crudo, para el análisis con el microscopio electrónico, utilizando la técnica del citocromo c de Kleinschmidt (véase el capítulo 3). Se hacen pasar pequeñas muestras de extractos celulares (25-50l) que contienen DNA a través de columnas delgadísimas de Sepharosa, que han sido equilibradas con la disolución que se necesita para la microscopía electrónica. El DNA pasa a través de la columna en el volumen vacío con el tampón apropiado, mientras que el resto del material queda retenido. Después de la adición de citocromo c, la muestra queda lista para la preparación de microscopía electrónica. 5. El uso más corriente de la cromatografía en gel es en la purificación de proteínas. Para purificar una proteína a partir de un extracto celular, es necesario, por lo general, utilizar una secuencia de procedimientos de separación basada en parámetros como la solubilidad en ciertas disoluciones, la carga, el peso molecular y

36

demás. El paso en el que tiene lugar la separación por tamaños utiliza, casi invariablemente, la cromatografía en gel. La cromatografía en gel es también un valioso instrumento analítico. La determinación de pesos moleculares que se ha citado anteriormente" es un ejemplo importante. Otros ejemplos son: 1. En el estudio del metabolismo del RNA, algunas fracciones del RNA se distinguen, en general, por centrifugación zonal, o aún mejor,

por

electroforesis

en

geles

de

poliacrilamida.

La

cromatografía en gel de agarosa es también muy utilizada. En la figura 8-20 se muestra un ejemplo. 2. Las fracciones proteicas del plasma deben ser, a menudo, determinadas cuantitativamente para- el diagnóstico de algunas enfermedades humanas. Puede hacerse directamente en geles de dextrano y se ha desarrollado como una prueba de utilidad en la macroglobulinemia e hipergiobulinemia. 3. El intercambio de tritio para el examen de la estructura de la proteína o el DNA, requiere que la macromolécula sea separada con rapidez del

3

H2O. Esto puede hacerse en unos 10 segundos

utilizando geles cargados, debido a que el

3

H2O sufre grandes

retrasos en todos los geles. Si se utiliza el menor tamaño de poro, la macromolécula atraviesa con rapidez el gel a través del volumen vacío. En la figura 8-21 se muestra un ejemplo. 4. La cromatografía en gel puede utilizarse para el estudio de la unión entre proteínas y moléculas pequeñas, bien por separación del producto de las sustancias de reacción o bien haciendo pasar la proteína a través de una columna equilibrada con la molécula pequeña. Un cálculo sencillo permite la determinación de las constantes de unión. La mejor cualidad de la cromatografía en gel en los estudios de equilibrios químicos es que puede funcionar bajo un amplio margen de concentraciones, pH, fuerza iónica y temperatura, debido a que el tamaño del poro del gel no es afectado por esos factores.

37

4. CROMATOGRFIA EN GEL DE CAPA FINA La cromatografía en capa fina tiene las ventajas de una rápida separación, el empleo de un equipo sencillo y una fácil elución; como método analítico, está reemplazando a la cromatografía en papel. La cromatografía en gel de capa fina (TLG, «thin-layer gel») ofrece

las

mismas

ventajas,

además

de

todas

aquellas

proporcionadas por la utilización de geles. La cromatografía en gel de capa fina es similar a la cromatografía en capa fina, en la que se extiende una fina capa de material sobre una placa de vidrio, se coloca una gota de la muestra y una fase móvil atraviesa la capa fina. Sin embargo, existen diferencias importantes: 1. En la cromatografía en capa fina el soporte es deshidratado antes de colocar la muestra. Sin embargo, en la cromatografía en gel de capa fina, la muestra se coloca sobre una lámina húmeda equilibrada con el disolvente apropiado, porque los gales no pueden ser deshidratados y rehidratados con facilidad. 2. La cromatografía en capa fina se realiza con una fase móvil ascendente

(véase

la

figura

8-11),

mientras

que

en

la

cromatografía en gel de capa fina se utiliza el método descendente. La lámina se coloca en una cámara cerrada herméticamente y conectada con dos depósitos; los dos extremos de la conexión están formados por puentes de papel de filtro (figura 8-22). El líquido fluye a través de la lámina a una velocidad determinada por el ángulo (normalmente unos 20°). Al igual que en la cromatografía en capa fina, el proceso termina antes de que el material que interesa llegue al depósito inferior. Sin embargo, hay un flujo continuo de líquido, de modo, que, a diferencia de la cromatografía en capa fina, no existe frente del disolvente. Por consiguiente, no se miden valores de R, y las posiciones deben determinarse respecto a estándares añadidos. 4.1 Aplicaciones de la cromatografía en gel de capa fina

38

Mientras que la cromatografía en capa fina se utiliza, sobre todo, con aminoácidos, azúcares, oligosacáridos, lípidos, esferoides y otras moléculas pequeñas, la cromatografía en gel de capa fina se aplica a proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, nucleótidos y otras sustancias hidrofílicas de gran tamaño. El principal uso de la cromatografía en gel de capa fina se encuentra en la determinación de los pesos moleculares de proteínas y péptidos. Se obtienen representaciones similares a las que se encuentran en la figura 8-19, en las que se representa en el eje y la distancia relativa de migración. Éstas proporcionan valores bastante

precisos,

sobre

todo,

si

se

efectúan

varias

determinaciones. La cromatografía en gel de capa fina se utiliza en el diagnóstico clínico para detectar proteínas patológicas en el suero sanguíneo, líquido cerebroespinal y orina. También es de gran utilidad en la medida de la pureza de las proteínas, enzimas, etc. También se está desarrollando como una modificación de la inmunodifusión, inmunoelectroforesis y electroenfoque. La bibliografía sobre la cromatografía en gel de capa fina es muy limitada, pero la utilización de este método aumenta con rapidez. 5. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Un intercambiador iónico es un sólido que tiene enlazados químicamente grupos cargados, a los que se unen iones por fuerzas electrostáticas; puede intercambiar estos iones por iones de una disolución acuosa. Los intercambiadores iónicos pueden utilizarse en columnas de cromatografía para separar moléculas de acuerdo con su carga. El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que las moléculas cargadas se adsorben a los intercambiadores de forma reversible, de modo que dichas moléculas pueden ser unidas o desunidas cambiando el ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores iónicos se realiza, por lo general, en dos fases: en

39

la primera, las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unión fuerte y estable; a continuación, se eluye la columna con tampones de diferente pH o diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del tampón con el material, por los sitios de unión. 5.1 Propiedades de los intercambiadores iónicos Un

intercambiador

iónico

es,

por

lo

general,

un

retículo

tridimensional o matriz que tiene grupos cargados unidos. Si un grupo está cargado negativamente, podrá intercambiar iones positivos y será un intercambiador de cationes o catiónico. Un grupo típico que se utiliza en los intercambiadores de cationes es el grupo sulfónico, SO3- . Si se une un H+ al grupo, se dice que el intercambiador se encuentra en forma acida, y puede, por ejemplo, intercambiar un H+ por un Na+ o dos H+ por un Ca2+. El grupo ácido sulfónico es un intercambiador de cationes -fuertemente ácido. Otros grupos -de utilización corriente son el carboxilo y el hidroxilo fenólico, dos Ínter-cambiadores catiónicos débilmente ácidos. Si el grupo cargado es positivo —por ejemplo, un grupo amino cuaternario—

es

un

intercambiador

de

aniones

o

amónico

fuertemente básico. Los intercambiadores aniónicos débilmente básicos más corrientes son grupos amino alifáticos o aromáticos. La matriz puede estar hecha de diferentes materiales. Los de uso más corriente son el dextrano, la celulosa y copolímeros del estireno y divinilbenceno, en los que el divinilbenceno contiene los grupos cargados y se entrecruza con las cadenas de poliestireno. La tabla 8-3 da la composición de varios intercambiadores iónicos de uso corriente. La capacidad total de un intercambiador iónico es una medida de la captación de iones intercambiables y se expresa, por lo general, como miliequivalentes de grupos intercambiables por miligramo de peso seco. Este número es suministrado por el fabricante y es

40

importante debido a que, si se excede en su capacidad, los iones pasarán a través de la columna sin unirse.

Tabla 3 Propiedades de algunos intercambiadores iónicos. Matriz Dextrano

Intercambiad

Grupo funcional

Nombre

or* FC

Sulfopropilo

comercial SP-Sephadex

DC

Carboximetilo

CM-

FA

Dietil-(2-

Sephadex

hidroxipropil)

QAE-

aminoetilo

Sephadex

Dietilaminoetilo

DEAE_Sepha

DA

41

Celulosa

C

Carboximetilo

dex CM-celulosa

C

Fosfo

P-cel

A

Dietilaminoetilo

DEAE-

A

Poliletilenimina

celulosa

A

Dietilaminoetilo,

PEI- celulosa

benzoilado-

DEAE (BND)-

naftolilado

celulosa PAB

Estireno-

–

FC

Ácido sulfónico

celulosa AG50

DC FC DA

Carboxílico Ácido sulfónico Amino terciario

Bio-Rex 70 Bio –Rex 40 AG-3

divinilbenceno Acrílica Fenólica Epoxiamina

La capacidad aprovechable es la capacidad bajo unas condiciones experimentales determinadas (es decir, pH, fuerza iónica). Por ejemplo, la extensión con la que un intercambiador iónico está cargado depende del pH (el efecto del pH es menor con los intercambiadores iónicos fuertes). Otro factor es la fuerza iónica, debido a que los iones pequeños situados cerca de los grupos cargados compiten con las moléculas de la muestra por estos grupos. Esta competición es bastante eficaz si la muestra es una macromolécula, debido a que el elevado coeficiente de difusión del ion implica un mayor número de encuentros. Por lo tanto, conforme aumenta la concentración del lampón, la competición se hace, más intensa. La porosidad de la matriz es una característica importante, debido a que los grupos cargados se encuentran dentro y fuera de la matriz. Las moléculas mayores pueden ser incapaces de penetrar en los poros, de forma que la capacidad disminuye según aumentan las dimensiones moleculares. La porosidad de las resinas basadas en el poliestireno se determina por la cantidad de

42

entrecruzamientos producidos por el divinilbenceno (la porosidad disminuye según aumenta la cantidad de divinilbenceno). Con las series Dowex, el porcentaje de divinilbenceno viene indicado por un número situado después de una X; por lo tanto, Dowex-50-X8 significa que contiene un 8 % de divinilbenceno. Los intercambiadores iónicos vienen en distintos tamaños de partícula que reciben el nombre de tamaño de malla. Las mallas más finas presentan una mayor relación superficie-volumen y, por lo tanto, aumentan la capacidad del intercambiador. Por otra parte, las mallas finas implican una velocidad de flujo menor, con lo que puede aumentar la extensión por difusión. De entre tal conjunto de intercambiadores iónicos con propiedades tan diferentes —carga, capacidad, porosidad, malla— se puede hacer la selección del más apropiado para realizar una separación particularmente difícil. En los siguientes apartados se describe cómo decidir el tipo de material de la columna y las condiciones para la unión de los iones y la elución de los mismos. 5.2 Elección del intercambiador iónico La primera elección que se debe hacer es si el intercambiador será aniónico o catiónico. Si los materiales que se deben unir a la columna tienen una única carga (es decir, más o menos) la elección es clara. No obstante, muchas sustancias (p. e., proteínas) presentan cargas positivas y negativas y su carga neta depende del valor del pH. En tales casos el factor principal es la estabilidad de la sustancia a diversos valores de pH. La mayoría de las proteínas son estables dentro de un margen de pH determinado (es decir, hay un margen en el que no se desnaturalizan), en el que están cargadas positiva o negativamente. Por lo tanto, si una proteína es estable a valores de pH por encima del punto isoeléctrico, se debe utilizar un intercambiador aniónico; si es estable a valores de pH Situados por debajo del punto isoeléctrico, debe utilizarse un intercambiador catiónico. La elección entre

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intercambiadores fuertes o débiles también está basada en el efecto del pH sobre la carga y la estabilidad. Por ejemplo, si se va a cromatografiar una sustancia débilmente acida que necesita pH muy altos o muy bajos para su ionización, se requiere un intercambiador fuerte debido a que éste funciona a pH extremos. No obstante, si la sustancia es lábil, es preferible la utilización de intercambiadores

débiles.

Los

intercambiadores

débiles

son

también excelentes para la separación de moléculas con una carga elevada de aquellas con poca carga, debido a que los iones débilmente cargados no se unen, por lo general, al intercambiador. Los intercambiadores débiles permiten, asimismo, una mayor resolución de las sustancias si las diferencias de carga son muy pequeñas. Los intercambiadores Sephadex y Bio-gel ofrecen particulares ventajas para su utilización con macromoléculas inestables en condiciones de baja fuerza iónica. Como los entrecruzamientos en estos materiales mantienen la insolubilidad de la matriz aunque ésta sea muy polar, la densidad de los grupos ionizables puede hacerse varias veces mayor en estos intercambiadores que en los de celulosa. El aumento de la densidad de carga significa un aumento de la afinidad, de modo que la adsorción se puede realizar a valores más elevados de la fuerza iónica. Por otra parte, estos intercambiadores retienen parte de sus propiedades de tamizado molecular, de modo que algunas veces las diferencias de peso molecular anulan la distribución ocasionada por las diferencias de carga. 5.3 Elección de la porosidad y el tamaño de malla Las moléculas pequeñas se separan mejor sobre matrices con tamaño

de

poro

pequeño

(o

sea,

un

elevado

grado

de

entrecruzamientos) debido a que la capacidad disponible es grande, mientras que las macromoléculas necesitan un tamaño de poro mayor. No obstante, excepto con el Sephadex, la mayoría de

44

los intercambiadores no deparan la oportunidad de aparejar la porosidad con el peso molecular. Los intercambiadores de celulosa han probado ser los mejores para la

purificación

de

moléculas

grandes

como

proteínas,

y

polinucleótidos. Ello es debido a que la matriz es fibrosa, por lo que todos los grupos funcionales se encuentran en la superficie y disponibles, incluso, para las moléculas mayores. La selección del tamaño de malla es dificultosa. Los tamaños de malla pequeños mejoran la resolución pero disminuyen la velocidad de flujo, lo que incrementa la dispersión zonal y disminuye la resolución. Por lo tanto, el tamaño de malla se determina, por lo general, de forma empírica. 5.4 Elección del pH, tampón y condiciones iónicas Debido a que los lampones están formados por iones, también pueden intercambiar y como resultado puede afectarse el equilibrio del pH. Para evitar estos problemas se adopta la llamada regla de los tampones: se deben utilizar tampones catiónicos con los intercambiadores

amónicos

y

tampones

amónicos

con

los

intercambiadores catiónicos. Debido a que la fuerza iónica es un factor a tener en cuenta para la unión, debe escogerse un tampón con elevada capacidad de tamponación, de modo que su fuerza iónica pueda ser lo suficientemente baja. Además, para obtener una buena resolución se ha encontrado que, por lo general, las condiciones iónicas utilizadas para coló-' car la muestra en la columna

(las

denominadas

condiciones

iniciales)

deben

ser

aproximadamente las mismas que las que se utilizan para la elución de la columna. 5.5 Equilibrio de intercambio de iones Cualquier intercambiador de iones tendrá sus grupos cargados unidos electrostáticamente a contratónos, de forma que el conjunto sea eléctricamente neutro. Los distintos intercambiadores pueden

45

mostrar diferente afinidad por unos contraiones u otros. Así, un conjunto de contraiones de uso frecuente en bioquímica, ordenados de mayor a menor afinidad, para un intercambiador de aniones genérico, es cífralo > oxalato > Cl- > formiato > acetato > OH-, o, para un intercambiador de cationes genérico, Ca2+ > Mg2+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+. Los otros iones a tomar en cuenta en el proceso de intercambio son los propios solutos de la mezcla á separar. La mayor parte de las biomoléculas son de naturaleza iónica. Los grupos ácidos desprotonados aportarán carga negativa, mientras que la protonación de los básicos dará carga positiva. En el caso particular de los biopolímeros, la presencia de varios grupos funcional de uno u otro tipo, da cuenta de su carácter de polielectrólifos, por lo que se podrán comportar como cationes o como aniones, según que el pH del medio sea inferior o superior a su pI, respectivamente. Supuesto un soluto S de estas características, a un valor de pH tal que presente una carga neta, por ejemplo positiva, se podrá escribir para el mismo la siguiente ecuación de intercambio iónico: Resina - Na + S

Resina - S + Na

donde se ha considerado que el soluto catiónico viaja a través de una resina intercambiadora de cationes, cuyo contraión es Na+. El equilibrio anterior vendrá gobernado por una constante

K

 Re sin a  S  Na    Re sin a Na  S  

cuyo valor concreto estará dictado por las afinidades de la fase estacionaria por cada uno de los iones en juego, S + y Na+. En estas afinidades intervienen factores como la carga del ion, su radio de solvatación o su polarizabilidad. Considerando constantes estos dos últimos factores (sobre los que se tiene poco control), la conclusión

46

primera es que las variaciones del pH del medio que alteren la carga del soluto, modificarán la posición del equilibrio anterior, desplazándolo a la derecha o a la izquierda según que adquiera más o menos carga. Por otra parte, dicho equilibrio podrá ser desplazado en un sentido u otro según sea la concentración de Na + en el medio (ley de acción de masas). Así, si el valor de K fuese muy elevado, el soluto S quedará unido a la resina desplazando a los iones Na+. Si establecido este equilibrio, se pasa por la columna una fase móvil con una concentración muy elevada de Na+ (fuerza iónica elevada), el anterior equilibrio se desplazará a la izquierda, con el resultado de liberación del soluto antes retenido. Para que esta liberación se produzca, no es imprescindible que el eluyente contenga una concentración elevada del mismo ion que actuaba como contracción cuando se aplicó el soluto. Bastará con pasar un eluyente con una concentración suficientemente elevada de otro ion (ej.: K+), tal que el nuevo equilibrio que se establezca, Resina - S + K

Resina _ K + S

esté desplazado a la derecha. En definitiva, el equilibrio de intercambio iónico puede ser considerado como una competencia entre los iones que se desplazan por la fase móvil por unirse a los grupos

cargados

del

intercambiador.

Cuanto

mayor

sea

la

concentración de un ion dado en la fase móvil, más grupos cargados del intercambiador ocuparán, desplazando al ion que se encuentra en minoría. De lo expuesto se deriva que el pH y la fuerza iónica de los eluyentes son las dos variables experimentales a considerar con vistas a controlar el equilibrio de cambio de ion. Así, aumentando la fuerza iónica del eluyente, van disminuyendo los factores fe de todos los solutos retenidos. Se puede comprobar que hay una relación lineal entre fe y la recíproca de la fuerza iónica, siendo esta relación característica de cada uno de los solutos retenidos en un

47

intercambiador. En el límite, cuando la fuerza iónica sea muy elevada, todos los solutos tendrán fe = O (exclusión de la fase estacionaria), por lo que no podrán ser resueltos, pero, si se emplean fuerzas iónicas compatibles con la retención, será posible resolver los distintos solutos sin más que ir modificando la fuerza iónica. En suma, que la elución con fuerzas iónicas programadas (elución en gradiente), permite al experimentador un control fino de la resolución. De hecho, se pueden separar biopolímeros con muy pocas diferencias en su carga neta (ej.: resolución de dos proteínas que difieran sólo en uno de sus aminoácidos ionizables). 5.6 Aplicaciones de la cromatografía de intercambio iónico En

principio,

cromatografiada

cualquier con

un

sustancia

cargada

intercambiador

iónico.

puede Las

ser

resinas

intercambiadoras son las más útiles para las moléculas orgánicas pequeñas y pueden utilizarse incluso para separar iones metálicos (p. e., Ca2+ de Mg2+). Las proteínas y los polisacáridos se separan mejor

con

los

intercambiadores

da

celulosa,

dextrano

y

poliacrilamida. Los intercambiadores de dextrano y poliacrilamida se han utilizado también extensamente en la separación de nucleótidos,

aminoácidos

y

otras

moléculas

pequeñas

de

importancia biológica.

6. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD La

cromatografía de afinidad es un tipo de cromatografía que

utiliza la afinidad específica entre la sustancia que debe aislarse y una molécula a la que ésta puede unirse de forma específica (un ligando). El material de la columna se sintetiza por unión covalente del ligando (que puede ser una macromoléculas o una molécula pequeña) con una matriz insoluble. A partir de este momento la columna es capaz de adsorber de manera específica, a partir de la disolución, la sustancia que va a ser aislada. La elución se realiza

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cambiando las condiciones, de forma que la unión ya no tenga lugar. Para poder llevar a cabo la cromatografía

de afinidad deben

comunicarse varias condiciones: (1) la matriz no debe adsorber por sí misma moléculas de forma significativa; (2) el ligando debe unirse a la matriz sin alteración de sus propiedades de unión; (3) debe escogerse un ligando cuya unión se fuerte, porque aunque una unión débil consiga retrasar la elución puede no resultar adecuada para la separación; (4) debe ser posible elución la elución sin destrucción de la muestra. La matriz más útil es la agasa (Sepharosa, Pharmacia Fine Chemicals, Inc.), debido a que presenta una adsorción mínima, mantiene unas buenas propiedades de flujo después del enlace químico con el ligando y tolera los extremos de pH y fuerza iónica, así como el cloruro de guanidinio 7M y la urea, que se necesitan a menudo para una elución efectiva. Es posible adquirir agarosa a la cual estén unidos covalentemente reactivos que

puedan

enlazar

proteínas,

membranas

y

esteroides;

o

concavalina A, un adsorbe; que preparado para polisacáridos y glucoproteínas

que contengan

residuos

α-D-manosilo

y a-D-

glucosilo (p. e., membranas celulares y células enteras), lo cual es una ayuda adicional. El principal uso de la cromatografía de afinidad hasta el momento ha sido la purificación de proteínas, membranas y polisacáridos. A continuación se indican algunos ejemplos: Purificación de enzimas: Se puede acoplar a la matriz el sustrato, un inhibidor que se una con fuerza o un cofactor. Si se hace pasar a través de la columna una mezcla de proteínas o un extracto celular crudo, sólo permanecerán en la columna los materiales que se unan al ligando. En algunos casos los enzimas pueden purificarse sustancialmente a partir de mezclas muy complejas. Sin embargo, debido a que muchos enzimas pueden unirse al mismo sustrato, sólo se consigue una purificación parcial.

49

Purificación de anticuerpos: Se ha realizado principalmente con bromuro de cianógeno-Sepharosa, a los que se han enlazado diversos antígenos como proteínas, virus o albúmina de suero bovino unida a haptenos; éste es el método de elección para la purificación de anticuerpos. Purificación de proteínas de transporte: Se utiliza Sepharosa a la que se acopla la sustancia transportada (p. e., globulinas que enlazan tiroxina, proteínas que enlazan estradiol y receptores de hormonas y drogas). Purificación de membranas y partículas que contienen sustancias conocidas: Las membranas a las que se une una hormona

pueden

purificarse

utilizando

Sepharosa

con

dicha

hormona unida; el virus de la gripo, que contiene neuraminidasa, ha sido purificado utilizando Sepharosa, a la cual se han unido los inhibidores químicos de la neuraminidasa. Purificación de glucoproteínas: El proceso es eficiente utilizando concavalina A-Sepharosa. Separación de células animales específicas: Se ha realizado utilizando aglutininas unidas a la matriz como concavalina A, aglutina del germen de trigo o fitohemaglutinina. Por ejemplo, algunas células tumorales inducidas por virus pueden separarse de las células normales debido a que las células tumorales se unen con más fuerza a la concavalina A-Sepharosa.

6.1 Preparación de la fase estacionaría La operación de anclar covalentemente un ligando a una matriz cromatográfica consiste básicamente en los siguientes pasos: a) Activación de la matriz o soporte; b) anclaje covalente del ligando; y c) bloqueo de los grupos reactivos remanentes. En ocasiones, sobre todo cuando el ligando es de pequeño tamaño, su anclaje covalente a la matriz puede dejarlo poco accesible a los solutos que

50

viajan en la fase móvil. En esos casos es conveniente que el ligando no se ancle directamente, sino que quede separado de la matriz por un brazo espaciador. Se da este nombre a una cadena carbonada

(normalmente

de

seis

carbonos)

que

se

une

covalentemente a la matriz por un extremo, y por el otro al ligando. Es conveniente que este brazo espaciador tenga suficientes grupos polares, a fin de no aportar hidrofobicidad a la fase estacionaria. Su introducción ha de ser, lógicamente, un paso intermedio entre el a y el b. Aun cuando todos los pasos en la preparación de la fase estacionaria pueden ser llevados a cabo en el laboratorio, lo más cómodo es adquirir soportes cromatográficos ya activados, y, si se precisa,

provistos

de

brazo

espaciador.

De

esta

forma,

la

preparación de la fase estacionaria se limita a los pasos b y c antes mencionados. Si se decide preparar la fase estacionaria desde el paso de activación, lo normal es seguir las instrucciones detalladas que proporcionan los fabricantes de los soportes. Los soportes ya activados son, básicamente, el resultado de una reacción química por la que se introducen en la matriz grupos funcionales suficientemente reactivos. Tal reactividad ayuda a que el posterior anclaje covalente del ligando se pueda realizar en condiciones suaves, compatibles con el mantenimiento de la funcionalidad biológica. A este nivel, se utiliza mucho la activación de la agarosa con bromuro de cianógeno (Figura 6.29). En ocasiones, más que una activación como la comentada, lo que se hace es introducir en la matriz grupos funcionales menos reactivos (ej.: amino o carboxilo). En esos casos, la formación de un enlace covalente con el ligando en condiciones suaves de reacción, requiere el empleo de agentes condensantes del tipo de las carbodiimidas (Figura 6.29). En el Cuadro 6.7 se muestran los grupos de activación o funcionalización más frecuentes en las

51

matrices para cromatografía de afinidad, así como los tipos de ligandos unibles a cada una de ellas. El anclaje consiste básicamente en incubar, bajo agitación suave, la suspensión formada por la matriz activada y una disolución del ligando. A esta suspensión se le añade la carbodiimida si se precisa de un agente condensante. Las variables experimentales a controlar son, pH, fuerza iónica, temperatura y tiempo de incubación; estas dos últimas suelen estar inversamente relacionadas (ej.: para agarosa activada con CNBr, 2-4 horas a temperatura ambiente o 16 horas en cámara fría a 4 °C). Es imprescindible que en la unión covalente del ligando no queden involucradas regiones de su molécula que sean cruciales para la interacción biológica, o que, por encontrarse tan próximas al centro de interacción, dejen a éste inaccesible. Muchas veces, este objetivo no se consigue, lo que impide la realización de este tipo de cromatografías. Otras veces, para preservar la capacidad de interacción del ligando, se hace preciso reducir su concentración en la mezcla de incubación con la matriz activada. En el mismo sentido

suele

resultar

efectivo

trabajar

con

matrices

cuya

proporción de grupos activos sea reducida, bien porque se adquieren con un bajo índice de activación, bien porque se someten a un proceso previo de desactivación lenta y controlada. Cualquiera que sea la opción, el objetivo es reducir la extensión del anclaje covalente, fundamentalmente para evitar las uniones del ligando por múltiples sitios. Estas uniones multipunto suelen ser las principales responsables de la inactivación de los ligandos, en especial cuando se trata de ligandos macromoleculares. Terminada la incubación entre el ligando y la matriz cromatográfica, se procede a eliminar el exceso de ligando y reactivos por decantación o filtración del sobrenadante, seguido de lavado con lampón. Será inevitable que una proporción indeterminada de grupos activos de la matriz hayan permanecido sin reaccionar.

52

Éstos deben ser eliminados para evitar interacciones inespecíficas con los solutos de la muestra. Para ello se suelen bloquear con aminas o ácidos en concentraciones suficientemente altas (0,1 a 1,0 M). La incubación con lampones catiónicos basados en Tris, o amónicos basados en ácido acético, suele ser suficiente. En esencia, se trata de unir en los sitios remanentes otros NH2 ó COOH distintos a los del ligando. Tras el bloqueo, un lavado eficiente, seguido de equilibrado en el lampón adecuado, dejará a la fase estacionaria lista para ser empaquetada en la columna. 6.2 Aplicación de la muestra y elución Por

regla

general,

el

volumen

de

lecho

cromatográfico

empaquetado es el necesario para trabajar según la modalidad 1 descrita en el apartado 6.7.2, o en una modalidad intermedia entre 1 y 2. Cuando se emplean fases estacionarias basadas en ligandos específicos de grupo (Cuadro 6.6) puede ser necesario trabajar con columnas más largas, a fin de resolver diferentes solutos del mismo grupo que muestren afinidades parecidas por la fase estacionaria. El lampón de equilibrado se habrá escogido de forma que se favorezca la interacción biológica de interés, a la vez que se reduzcan al mínimo otras interacciones inespecíficas. Dada la elevada

afinidad

interaccionantes,

lo

que normal

suelen es

mostrar

trabajar

con

las

moléculas

fuerzas

iónicas

relativamente elevadas (ej.: NaCl 0,2 M). Una vez aplicada la muestra, se continuará pasando tampón de equilibrado hasta lavar todos los contaminantes. El flujo de la columna, durante la aplicación de la muestra y su posterior elución, puede ser una variable crítica en aquellos casos en que las constantes de velocidad de las reacciones de asociación y disociación sean bajas. Con carácter general, es recomendable emplear flujos bajos durante la aplicación y la elución, mientras que en los lavados se podrán utilizar flujos altos.

53

En ocasiones, la unión del soluto de interés es tan fuerte que su elución sólo es posible bajo condiciones incompatibles con la funcionalidad biológica, con lo que habrá que excluir el empleo de este tipo de cromatografía. En situaciones menos extremas, se podrá acudir a eluciones específicas o inespecíficas. Una elución específica es la que se consigue cuando la fase móvil tiene algún agente que compite por unirse al ligando anclado. Como ejemplo se puede citar la frecuente utilización de eluyentes basados en -alquilglucósidos para la elución de glicoproteínas purificadas mediante cromatografía en Con A-agarosa. Este tipo de elución específica será el preferido siempre que resulte factible. Obviamente, la columna quedará contaminada por el agente eluyente empleado, pero éste se podrá eliminar por medios más drásticos, cuando ya la función biológica no sea una limitación. En las eluciones inespecíficas se suele acudir a alterar la fuerza iónica del eluyente, o el pH, o incluso la temperatura. A veces es necesario combinar estos tres recursos, o siendo más drástico, alterar la conformación del ligando, en caso de que éste sea macromolecular. Como última opción, en caso de que todo lo anterior fallase, se puede acudir al empleo de agentes caotrópicos (ej.: KSCN o urea), buscando la desnaturalización del sistema biológico.

Ello

estará

indicado

en

los

casos

en

que

esta

desnaturalización sea reversible, o cuando la conformación nativa no sea un requisito para los estudios posteriores. En resumen, son pocas las reglas generales sobre cómo disminuir la afinidad entre dos biomoléculas interaccionantes. Éste es un terreno dominado por el empirismo, que requerirá tomar en consideración las peculiaridades de cada sistema biológico. Para ilustrar lo expuesto, en la Figura 6.30 se recoge un ejemplo de purificación de una proteína inhibidora de una enzima, la cual se utilizó como ligando anclado covalememente. 6.3 Tipos especiales de cromatografía de afinidad

54

A continuación se describen tres sistemas cromatográficos que presentan peculiaridades suficientes para recibir un tratamiento conceptual diferenciado. Cromatografía de afinidad sobre metales inmovilizados. Esta variedad

cromatográfica

no

se

basa

en

el

concepto

de

funcionalidad biológica que subyace en otras cromatografías de afinidad; de ahí que muchos autores prefieran englobarla dentro de otros tipos cromatográficos, en concreto, dentro del intercambio iónico, en una subvariedad que podría llamarse intercambio de ligandos. Lo cierto es que la denominación que aquí se emplea es la más aceptada en Bioquímica, y justifica la abreviatura por la que también se la conoce: IMAC (del inglés Immobilized Metal Affinity Chromatography; también conocida como MCAC de Metal Chelate Affinity Chromatography). Conviene mencionar que se trata de una cromatografía indicada para la separación de proteínas. Así, explota las propiedades quelantes de muchas proteínas, capaces de formar compuestos de coordinación con metales de transición (ej.: Cu2+, Zn2+, Ni2+, Co2+). Son las cadenas laterales de histidina, cisteína, y triptófano, actuando como dadores de electrones, las principales responsables de la capacidad quelante que se comenta. La puesta a punto de estos sistemas cromatográficos consiste en inmovilizar cationes como el Zn2+, el Cu2+ o el Ni2+ en fases estacionarias provistas de agrupaciones quelantes muy potentes. Para ello se emplean matrices cromatográficas con grupos como el ácido iminodiacético (IDA) o el nitrilotriacético (NTA) (Figura 6.31). El empaquetado de una matriz de este tipo, seguida del paso de un eluyente conteniendo alguno de los cationes anteriores, deja la columna cargada con el metal de transición. La posterior aplicación de la muestra conteniendo las proteínas de interés se traducirá en la retención de éstas, siempre que la afinidad del metal por el grupo quelante de la matriz sea superior que por las proteínas. Tal retención

se

muestra

muy

dependiente

del

pH,

debiendo

55

asegurarse un pH en torno a la neutralidad. A pH alcalinos los grupos amino de las proteínas se encontrarán desproto-nados, convirtiéndose en los principales responsables de la unión al metal. Esta situación ha de evitarse en IMAC, ya que se trata de favorecer a las histidinas como principales responsables de la interacción. Adicionalmente,

como

forma

de

eliminar

interacciones

electrostáticas inespecíficas, los lampones de aplicación y lavado suelen tener fuerzas iónicas elevadas (0,5-1,0 M de NaCl). La elución de las proteínas retenidas puede llevarse a cabo como en cromatografía de afinidad, de forma específica o inespecífica. En el primer caso, el lampón eluyente ha de contener un agente que compita con la(s) protefna(s), desplazando-la(s); por ejemplo, imidazol, histamina o glicocola. Con vistas a separar diferentes proteínas se puede emplear un gradiente de concentración de estos agentes, que introduzca la selectividad adecuada. El pH del lampón de elución se suele mantener constante a lo largo de todo el proceso. En el caso de elución inespecífica, se emplean gradientes de pH decrecientes, que irán protonando los residuos de histidina. La selectividad vendrá entonces determinada por los particulares valores de pK de las histidinas. Se puede conseguir una elución inespeetfica rápida añadiendo agentes quelantes a los lampones de elución. En este caso la selectividad será nula, y eluirán conjuntamente todas las proteínas retenidas, quedando la conmina descargada del metal. Con la adecuada selección del metal con que se carga la columna, y de las condiciones de elución, se pueden conseguir separaciones excelentes de mezclas complejas de proteínas. Una aplicación muy práctica

es

en

el

terreno

de

la

purificación

de

proteínas

recombinantes. Éstas pueden expresarse con una secuencia apéndice de seis histidinas consecutivas ("6 x His tag"), sin afectar a sus propiedades funcionales o de secreción. Esta cola de histidina muestra

una

elevada

afinidad

en

IMAC-Ni2+,

que

puede

56

aprovecharse para purificar proteínas recombinantes en un solo paso. Cromatografía de afinidad por unión covalente. A diferencia de las cromatografías de afinidad, y en general de interacción, ésta se caracteriza por la retención de los solutos mediante unión covalente a la fase estacionaria. A pesar de ello la reversibilidad de la retención queda asegurada, ya que se trata de uniones por puentes disulfuro. Bajo condiciones reductoras suaves (ej.: 2mercaptoetanol o DTT 5-20 mM) se puede conseguir la elución. Generalmente, la fase estacionaria está constituida por una matriz cromatográfica a la que se ha anclado covalentemente un grupo tiopropilo o glutation (Figura 6.32). Estas columnas están indicadas para la purificación de proteínas con grupos SH, y en general, compuestos tiólicos. La aplicación de la muestra ha de llevarse a cabo a un flujo lento, compatible con la cinética de formación de puentes disulfuro. Cromatografía de afinidad de células. La misma filosofía que se aplica a la cromatografía de afinidad de moléculas en disolución, es aplicable a células en suspensión; con las limitaciones inherentes a la viabilidad celular. Se trata en este caso de trabajar con matrices cromatográficas

que

tengan

anclados

ligandos

capaces

de

interaccionar con receptores de membrana, o con glicoproteínas de membrana (ej.: ConA), o con anticuerpos unidos a la superficie celular (ej.: Proteína A). El grado de división de estas fases estacionarias ha de ser menor que el que se emplea para cromatografía de moléculas; así, se suele trabajar con partículas de diámetros comprendidos en el intervalo 250-350 m. De esta forma, se asegura que el tamaño de los intersticios sea adecuado para el paso de las células. Los flujos de elución han de ser significativamente menores que los empleados con moléculas, a fin de disminuir las fuerzas de cizalla. Generalmente se emplean eluciones específicas, ya que las variaciones de pH, fuerza iónica o

57

temperatura pueden ser incompatibles con la viabilidad de las células.

7. CROMATOGRAFIA DE PENETRABILIDAD Éste es el más simple, conceptual y metodológicamente, de todos los tipos de cromatografía. El nombre que se le ha dado es una propuesta más entre las muchas existentes; algunas de ellas son: cromatografía de filtración en gel, cromatografía de permeación en gel, cromatografía de tamizado molecular y cromatografía de exclusión por tamaño. Cuando este tipo de cromatografía se lleva a cabo en sistemas de alta presión, parece que existe un consenso en denominarla

como

cromatografía

de

exclusión

por

tamaño

(abreviado SEC, del inglés Size Exclusión Chromatography). Sin embargo, en cromatografía convencional a baja presión, los nombres mencionados siguen usándose, en especial el de filtración en gel. Tal denominación se considera inadecuada, conceptual e intuitivamente.

No

es

una

filtración,

sino

una

auténtica

cromatografía lo que tiene lugar. Además, al pensar en filtración se tiende a imaginar que lo más pequeño es lo primero que se filtra, y esto es justo lo contrario de lo que ocurre. La mayor parte de los soportes para esta cromatografía están basados en polímeros fuertemente hidrofílicos, que, al ser puestos en o con agua, adquieren el aspecto de un gel. En los soportes que se usan en Bioquímica, tales polímeros suelen ser polisacáridos (dextranos o agarosa) o poliacrilamida, o mezclas de ellos/ Los fabricantes de estos soportes someten a estos polímeros a reacciones con agentes bifuncionales que entrecruzan las fibras individuales/El sólido resultante lo fragmentan hasta quedar en forma de micropartículas esféricas. Finalmente, mediante una operación de criba, clasifican las micropartículas por intervalos de diámetro. En el Cuadro 6.4 se detallan los soportes de este tipo

58

más empleados en Bioquímica, especificando el nombre comercial por el que normalmente se los conoce. Las micropartículas en que están divididos estos soportes son esferas

formadas

por

enrejados

de

fibras

del

polímero

correspondiente. Los huecos o poros de estos enrejados tendrán un tamaño determinado por la concentración de fibras y su grado de entrecruzamiento. En suma, las micropartículas esféricas son como esponjas. Este símil es especialmente válido, ya que, además de ser huecas, al ponerse en o con el agua se hinchan considerablemente. En un lecho cromatográfico empaquetado con un soporte de estas características, habrá que considerar que hay líquido, no sólo en los intersticios entre partículas, sino también en el Interior de las mismas. Al abrir la salida del eluyente, el líquido en los intersticios se desplazará con la velocidad de la fase móvil. El líquido atrapado por las partículas del gel no, sufrirá este arrastre, protegido como se encuentra por el entramado de fibras que actúa como matriz de contención. En esencia, este líquido internó se comporta

como

la

fase

estacionaria

en

cromatografía

de

penetrabilidad. Para formarse una buena idea de la oquedad de las partículas, basta considerar que con ciertos tipos de geles, más del 85% del lecho empaquetado es líquido. En otras palabras, que el volumen ocupado por las fibras de polímero (lo único sólido dentro de la columna) es muy pequeño en comparación con el volumen total del lecho

cromatográfico

(Figura

6.15).

Este

volumen

total,

V T,

calculable a partir del diámetro de la columna, Φ, y de la altura del lecho, L, será  . 2 . L  V0  Vi  V g 4

Donde: V0, volumen de los intersticios entre partículas o volumen de exclusión; Vb, volumen interno de las partículas de gel, o

59

volumen de fase estacionaria; Vg, volumen ocupado por las fibras del polímero. Dado que Vg, es considerablemente menor que VT, es fácil intuir la gran esponjosidad de estos geles. En consecuencia, son geles blandos que sólo pueden emplearse con bajas presiones hidrostáticas, so pena de colmatación y deterioro de la matriz. En cromatografía de penetrabilidad hay que cambiar un poco los conceptos que se venían manejando. Así, no hay que considerar que la fase estacionaria permanece completamente estática durante el proceso cromatográfíco. El eluyente puede acceder al interior de las micropartículas; a fin de cuentas, la composición de la fase estacionaria y el eluyente es la misma. Pero, este del eluyente al volumen interno, Vi, no es la consecuencia del flujo dictado por la presión hidrostática o el bombeo peristáltico. Es la difusión de las moléculas del eluyente hacia el interior de las partículas del gel la que da cuenta de la progresiva renovación de la fase estacionaria. Por tal motivo, si se pretende desplazar todo el volumen interno o fase estacionaria de un lecho cromatográfico de este tipo, y para ello se empieza a pasar eluyente, caben dos opciones: o que el flujo de eluyente sea muy rápido en comparación con la velocidad de difusión al interior de las partículas, o que sea lento. En este segundo caso, es fácil ver que la renovación completa de la fase estacionaria se habrá producido cuando el volumen de eluyente pasado por la columna sea igual a V0 + Vi = Vt donde V, es el símbolo empleado para hacer referencia al volumen total de líquido contenido en el lecho cromatográfico. Obviamente, Vt = VT – Vg En el caso de que el flujo de eluyente sea muy rápido en comparación con la difusión de sus moléculas, puede resultar que la cantidad de eluyente necesaria para la renovación completa de la fase estacionaria sea superior a la calculada a partir de (6.23). En la práctica esto no es deseable, y obliga al empleo de flujos rela-

60

tivamente bajos, como corresponde a una técnica donde la distribución de los solutos en V, viene gobernada por la difusión. En efecto, piénsese en el caso de un soluto cuyas moléculas fuesen de un tamaño tan grande que no pudieran penetrar por el entramado de fibras de las partículas del gel. Tales moléculas no se distribuirían en absoluto en la fase estacionaria, viéndose en todo momento obligadas a viajar por los espacios intersticiales. Esta situación sería radicalmente distinta a la de un soluto de moléculas tan pequeñas que no encontraran restricción alguna, no sólo para desplazarse por los espacios intersticiales, sino tampoco para difundir a los espacios internos. En todo momento, la concentración de estas moléculas pequeñas seria la misma dentro y fuera de las partículas, ésto es, en los volúmenes V0 y Vi. Para diferenciar estas dos situaciones extremas se suele utilizar el coeficiente de reparto, Kav, definido como la proporción del volumen interno que le resulta accesible a una molécula de soluto:

K av 

Vacc Vi

donde Vacc es el volumen interior de las partículas de gel al que puede acceder un soluto dado. En el caso del soluto de gran tamaño antes mencionado, Vacc = 0 (Kav=0), mientras que para el soluto pequeño, Vacc =Vi (Kav = 1). En

la

práctica

podrán

encontrarse

situaciones

como

las

comentadas, o intermedias entre ellas. Por tanto, con carácter general, 0  Vacc  Vi y 0  Kav < 1. Es fácil ver que el volumen de elución de un soluto vendrá dado por Ve =V0 + Vacc y, de acuerdo con (6.25), Ve=V0 +Kav –Vi El soluto excluido de la fase estacionaria (Kav = 0) presentará un volumen de elución igual a V0, lo que explica que a este volumen

61

se le conozca como volumen de exclusión. Por su parte, un soluto tan pequeño que Kav = 1, eluirá con Ve = V0 + Vi=Vt. Para geles muy porosos Vg << VT, y, de acuerdo con la expresión (6.24), se puede asumir que V t  VT. Lo anterior tiene una inmediata aplicación práctica: en cromatografía de penetrabilidad se ha de cumplir que, una vez aplicada la muestra, el paso de un volumen de eluyente igual al volumen geométrico del lecho cromatográfico, debe traducirse en la elución de todos los solutos presentes en la muestra (Figura 6.16). Si tal circunstancia no se cumple, y se observa la aparición de picos con V e > Vt cabe pensar que alguno de los solutos se ha visto retrasado por factores ajenos a su penetrabilidad (ej.: adsorción sobre las fibras del polímero). A partir de las expresiones (6.23) y (6,26), la (6.25) se transforma en

K av 

Ve  V 0 Vt  V0

que permite el cálculo del coeficiente de reparto de un soluto cuyo pico de elución se centre en el volumen V, (Figura 6.17), siempre que se conozcan los valores de V0 y Vt. Tanto uno como otro dependen de las dimensiones del lecho cromatográfico, y habrán de ser determinados experimentalmente para cada columna. Una vez determinados, se puede asumir que sus valores permanecen constantes durante el tiempo de vida útil de la columna, con tal de que no se produzca ninguna alteración en el empaquetado, ni deterioro del soporte. Periódicamente convendrá reevaluar V g como forma de asegurar lo anterior. 7.1 Coeficiente de reparto y tamaño molecular En el apartado anterior, para explicar las diferencias en los coeficientes de reparto de diferentes solutos se ha acudido a los conceptos de exclusión o penetrabilidad en relación con el tamaño

62

de las moléculas. Un análisis en mayor profundidad obligaría a tratar la penetrabilidad como una función, no sólo del tamaño, sino también de la forma molecular. Ambos parámetros están presentes en lo que se conoce como diámetro hidrodinámico de una molécula. Para entender el concepto que hay detrás de este parámetro hay que recordar que las moléculas en disolución están en continuo movimiento traslacional y rotacional. Como consecuencia de sus rápidos movimientos rotacionales en las tres direcciones del espacio, las moléculas se comportan como si ocuparan más volumen que el definido por sus dimensiones geométricas. En concreto, ese volumen de influencia descrito por el volteo continuo tendría

forma

esférica,

cuyo

diámetro

seria

el

diámetro

hidrodinámico. Si una molécula fuese esférica, su diámetro sería el propio diámetro hidrodinámico, pero si la molécula fuese alargada» el diámetro hidrodinámico seria tanto mayor cuanto mayor fuera el tamaño de la .molécula y/o cuanto más alargada fuese. Se entiende pues, que el diámetro hidrodinámico informa sobre el tamaño y la forma. Cuando una molécula de soluto se acerca al enrejado de las partículas del gel para penetrar en su interior, lo hará con ese rápido movimiento de volteo en todas las direcciones. Si consigue traspasar el enrejado será porque su diámetro hidrodinámico es menor que el del poro. En suma, es el diámetro hidrodinámico el parámetro molecular que determina el coeficiente de reparto de un soluto. En el caso de muestras cuyos solutos constituyentes tuvieran todos la misma forma (ej.: una disolución de proteínas globulares, cuyas formas redondeadas fuesen similares a esferas), el diámetro hidrodinámico

de

cada

uno

de

ellos

estaría

directamente

relacionado con su tamaño. En otros términos, el coeficiente Kav estaría inversamente relacionado con la masa molecular de cada soluto. Se comprueba empíricamente que tal relación muestra un

63

perfil sigmoidal en las representaciones semilogarítmicas de masa molecular frente a Kav. (Figura 6.18) Sería predecible que el perfil fuese lineal en todo el intervalo definido por dos valores extremos de masa molecular; un valor máximo por encima del cual los solutos eluyesen a V 0 (Kav = 0), y un valor mínimo, por debajo del cual eluyesen a V t (Kav = 1). Este comportamiento teórico es el que se muestra en línea discontinua en la Figura 6.18. Los vértices de esta representación teórica definen el llamado intervalo de fraccionamiento de un gel. Es ésta una propiedad intrínseca de cada gel, que depende de cuál sea el tamaño promedio de sus poros y la distribución de tamaño de éstos.

En

el

Cuadro

6.4

se

muestran

los

intervalos

de

fraccionamiento de soportes comerciales para cromatografía de penetrabilidad. En la práctica, los perfiles sigmoidales como el de la Figura 6.18 tienen una porción central (Kav = 0.2 - 0.8) que puede ser considerada lineal. Ello tiene utilidad en la estimación de masas moleculares mediante cromatografía de penetrabilidad. 7.2 Estimación de masas moleculares La metodología a seguir es bien sencilla. Se procede primero a calibrar la columna, operación que consiste en aplicar una mezcla de solutos de masas moleculares conocidas, y que se encuentren dentro del intervalo de fraccionamiento de la columna a calibrar. El perfil de elución obtenido para esta mezcla conocida proporcionará los Ve de cada uno de los solutos. A partir de estos valores será posible calcular los respectivos coeficientes Kav (expresión 6.28), supuestos conocidos V0 y Vt. La representación semilogarítmica de los masas moleculares de los solutos frente a sus respectivos Kav proporcionará la recta de calibrado. El resto es sencillo; se aplica la muestra problema que contiene el soluto cuyo masa molecular se desea estimar, se determina su Ve, y a partir de él, Kav; se interpola este valor en la recta de calibrado, con lo que se determina la masa

64

molecular buscada. El conjunto de operaciones a realizar se resumen en el ejemplo práctico que se recoge en la Figura 6.19. Con frecuencia, estos análisis se llevan a cabo sin calcular los valores de

Kav, sino utilizando en su lugar los cocientes V e/V0, o

incluso utilizando sólo Ve. Tal forma de operar obliga a trabajar siempre con la misma columna (mismo V0, mismo Vt). La máxima utilidad de esta evaluación cromatográfica de masas moleculares de proteínas se obtiene cuando se combina con la correspondiente

determinación

mediante

PAGE-SDS).

La

comparación entre la masa molecular de la proteína nativa y la de la proteína desnaturalizada permite obtener conclusiones sobre su estructura cuaternaria. 7.3 Aplicaciones preparativas La cromatografía de penetrabilidad presenta una baja capacidad resolutiva. Ello se debe a que la difusión es la causa última de la separación, y, por tanto, la difusión axial (apartado 6.15) reviste una

importancia

considerable,

que

se

llega

a

traducir

en

ensanchamientos de las zonas de elución de hasta diez veces o más respecto al tamaño de la zona de aplicación. Frente a estas desventajas,

una

gran

ventaja

de

la

cromatografía

de

penetrabilidad es que impone muy pocas restricciones en cuanto a la composición de la fase móvil. Concretamente, las únicas de obligado cumplimiento son las relativas a los pH y temperaturas compatibles

con

la

estabilidad

del

gel.

Así,

la

elución

en

cromatografía de penetrabilidad se suele llevar a cabo en condiciones suaves (las más suaves de entre todos los tipos de cromatografía), lo que hace que sea la más compatible con la preservación del estado conformacional de los biopolímeros. La selección del soporte y de la longitud del lecho cromatográfico, vendrá determinada por la naturaleza del problema, esto es, por el diámetro hidrodinámico del soluto que se pretende purificar. Puesto que tales factores no se suelen conocer a priori, puede ser necesario llevar a cabo eluciones exploratorias, utilizando columnas

65

cuyo intervalo de fraccionamiento sea muy amplio, y a ser posible calibradas. El perfil de elución que se obtenga (ej.: A 280 de las fracciones recogidas, en el caso de mezclas de proteínas), informará sobre la distribución de tamaño de los componentes en la mezcla problema. Será de gran utilidad disponer de algún ensayo especifico (ej.: ensayo enzimático) para el biopolímero cuya purificación se pretende. Ello permitirá dilucidar qué relación guarda con el resto de componentes contaminantes (Figura 6.20). Finalmente, una precaución de tipo práctico a tener en cuenta, no sólo en cromatografía de penetrabilidad, sino en todos los tipos de cromatografías, es que el eluyente no absorba intensamente en el intervalo de longitudes de onda a emplear para la detección y cuantíficación espectrofotométrica de los solutos.

7.4 Criterio de pureza La forma del pico de elución de un soluto es el primer criterio para valorar la calidad con que se ha separado. Ésta ha de mostrar un perfil gaussiano simétrico, como corresponde a una distribución zonal ideal. Para un soluto puro, la falta de simetría en su pico de elución indica una baja calidad del empaquetado. La asimetría de un pico se suele cuantificar midiendo la separación de cada rama de la gaussiana respecto al eje central. Esta medida se lleva a cabo a una altura, desde la línea base, del 10% de la altura total. Si el cociente de las dos distancias (derecha/izquierda) es superior a 1,5, la columna debe ser reempaquetada. Si esto se puede descartar y, sin embargo, el pico es asimétrico, cabría pensar en la existencia de dos o más solutos eluyendo tan próximos que sus máximos no aparecen resueltos. Lo más normal es que estos solutos estén presentes en distintas concentraciones,

66

por lo que el perfil de elución que englobe sus distribuciones zonales podrá resultar asimétrico (Figura 6.21). En el supuesto de que casualmente dos solutos no resueltos estén presentes en la misma concentración, el perfil de elución conjunto podría resultar simétrico, pero probablemente presentará una anchura superior a la esperable. La cromatografía de penetrabilidad proporciona un criterio de pureza negativo más severo que otros tipos de cromatografía. Ello tiene que ver con la ausencia de interacciones entre solutos y fase estacionaria. En el resto de tipos cromatográficos, el pico de elución de un soluto puro puede presentar cierta asimetría (lo que se

conoce

atendiendo estacionaria

como a

la

con

cabeceo

o

dependencia la

coleo),

que

de

interacción

concentración

la de

puede

soluto.

explicarse soluto-fase

Cuando

esta

dependencia es lineal, el perfil de elución suele ser simétrico y resulta válido lo expuesto; sin embargo, para dependencias no lineales (lo que suele ocurrir con cierta frecuencia), la asimetría de los picos de elución está asegurada, tanto más cuanto mayor sea la concentración del soluto en la muestra aplicada. La conclusión es inmediata, la asimetría de un pico no puede emplearse como criterio para negar la pureza de una muestra, salvo que se pueda asegurar una interacción lineal en las cromatografías de adsorción, o cuando se trate de un pico de elución de cromatografías de penetrabilidad, donde la adsorción no ha de jugar ningún papel. Analizar la forma de los picos requiere disponer de un registro gráfico, por ejemplo medidas de absorbancia del eluido. Si este registro, que mide una propiedad general de los solutos (ej.: A280 de las proteínas), se combina con otro registro más específico (ej.: ensayo de una actividad enzimática en las diferentes fracciones del eluido), se podrá obtener un criterio de pureza más estricto. La Figura 6.22 ilustra la utilidad de estos registros combinados. 7.5 Desalado de muestras. Cambio de disolvente

67

Una útil aplicación de la cromatografía de penetrabilidad en el terreno preparativo es el desalado y/o cambio de disolvente. Aquí, el papel que ejerce el gel cromatográfico no es separar diferentes biopolímeros entre sí, sino separarlos del disolvente o las sales que le(s) acompañen. Determinados

geles

(Cuadro

6.4),

están

formados

por

un

entramado de fibras tan tupido, que sólo los solutos de pequeño tamaño podrán acceder al Vi. Casi cualquier biopolímero presentará un Kav = 0 en una columna empaquetada con estos geles. Si, en una columna de estas características, se aplica una disolución de biopolímeros

cuyo

disolvente

sea

un

tampón

salino,

los

biopolímeros eluirán con Vt, mientras que las sales (Kav = 1) eluirán con Vt. Los biopolímeros quedarán disueltos en la fase móvil en que se encontraba equilibrada la columna en el momento de la aplicación. Un efecto similar de desalado se habría conseguido mediante la clásica operación de diálisis, sólo que en ésta el tiempo requerido habría sido mayor. En efecto, la columna cromatográfica que se ha de emplear para un desalado como el descrito no ha de ser muy larga, pues se trata de separar dos componentes con K av, extremos. En la práctica basta con emplear columnas de unos pocos cm, cuya elución se produce en unos pocos minutos (5-10 min). Una lógica extensión de la aplicación anterior es el cambio de disolvente o tampón en el que está disuelto un biopolímero, o una mezcla de ellos.

8. CROMATOGRAFIA HIDROFÓBICA Tanto ésta, como el resto de cromatografías de interacción que se comentan

en

los

siguientes

apartados,

comparten

con

la

68

cromatografía de intercambio iónico los mismos planteamientos experimentales: retención de los solutos en la columna y posterior elución mediante cambios en la composición de los eluyentes. La interacción hidrofóbica no es una interacción en sí misma, sino el resultado de la asociación entre regiones apelares promovida por entornos acuosos. Esta agregación hidrofóbica está favorecida termodinámicamente por el aumento de entropía que supone. En efecto, la solvatación de las superficies hidrofóbicas requiere que las moléculas de agua implicadas adopten un orden estricto. Al interaccionar las regiones hidrofóbicas entre sí, su superficie expuesta disminuye, y con ello el número de moléculas de agua ordenadas; en suma, disminuye el orden global. De aquí se derivan dos conclusiones de importancia práctica: a) La solvatación iónica disminuye el número de moléculas de agua disponibles para solvatar

las

superficies

hidrofóbicas;

la

consecuencia

es

el

favorecimiento de las interacciones hidrofóbicas por las fuerzas iónicas altas, b) El carácter entrópico de las interacciones hidrofóbicas, justifica que se vean favorecidas por aumentos en la temperatura. En una columna de interacción hidrofóbica las muestras que se apliquen han de contener iones en suficiente cantidad para favorecer la retención de los solutos. Ahora bien, no todos los iones favorecen por igual las interacciones hidrofóbicas; incluso, determinados iones las desfavorecen. A continuación, se listan diferentes aniones y cationes en orden decreciente de su capacidad favorecedora de las interacciones hidrofóbicas: (PO4)3- > (SO4)2- > Acetato > Cl- > Br- > SCN(NH4)+ > K+ > Na+ > Mg2+ > Ca2+ En estas series, los iones más a la izquierda son los que mayor orden inducen en la estructura del agua (anticaotrópícos o cosmotrópicos), mientras que los de la derecha provocan desorden

69

(caotrópicos). Se entiende que cuanto menos caotrópico sea un ion más favorezca las interacciones hidrofóbicas, como forma de disminuir el urden molecular global de la disolución. En general, todos los biopolímeros tendrán un mayor o menor grado de hidrofobicidad, lo que hace que este tipo de cromatografía pueda ser utilizado para muy diversos problemas experimentales. Centrando

la

discusión

en

el

caso

de

las

proteínas,

su

hidrofobicidad global vendrá determinada por el número de aminoácidos apelares que tengan. Para una proteína plegada en su conformación nativa, la mayor parte de estos aminoácidos se encontrarán interaccionando hidrofóbicamente en el interior del glóbulo proteico. Sin embargo, siempre pueden quedar aminoácidos más o menos hidrofóbicos en la superficie, expuestos al medio acuoso. La hidrofobicidad de estos aminoácidos expuestos es la que da cuenta de la interacción en cromatografía hidrofóbica. En

otras

palabras,

se

trata

de

una

cromatografía

no

desnaturalizante, en la que se preservan las estructuras terciaria y cuaternaria de las proteínas. Uno de los factores que permiten hablar de la cromatografía hidrofóbica como una cromatografía no desnaturalizante, es el empleo de fases estacionarias de moderado carácter hidrofóbico, en

contraste

estacionarias

con

la

elevada

empleadas

en

hidrofobicidad

cromatografía

de

de

las

fase

fases inversa

(apartado 6.14.3). En cromatografía hidrofóbica se suele trabajar con fases estacionarias basadas en polímeros hidrofílicos (ej.: agarosa,

polímeros

acrílicos),

a

los

que

se

han

unido

covalentemente grupos hidrocarbonados como metilo, butilo o fenilo. Cuanto mayor sea la longitud de la cadena hidrocarbonada, mayores serán los factores k de los solutos. En el caso del grupo fenilo, éste puede afectar a la retención de los biopolímeros, no sólo por hidrofobicidad, sino también por interacciones  -  con sus residuos

aromáticos,

lo

que

puede

producir

inversiones

de

selectividad.

70

En cromatografía de interacción hidrofóbica, gran parte de las veces, las muestras que se aplican proceden de un paso previo de precipitación con sulfato amónico; de este modo se asegura que la muestra se encuentre en condiciones idóneas para su retención. Si no es así, se añadirá a la muestra dicha sal o NaCl, hasta alcanzar una fuerza iónica suficientemente alta y compatible con la solubilidad de los componentes (ej.: (NH4)2SO4 2M ó NaCl 4M). El pH, tanto de la muestra como de los tampones de equilibrado y elución suelen fijarse en torno a la neutralidad, como forma de preservar la conformación nativa. La elución se puede llevar a cabo mediante gradientes continuos o discontinuos de fuerza iónica decreciente, en general a base de (NH4)2SO4 (Figura 6.28). Alternativamente se puede acudir al empleo de sales caotrópicas (ej.: KSCN), si bien ello puede conducir a desnaturalizaciones. El empleo de gradientes de pH es otra alternativa. Se tratará entonces de variar el pH en el sentido de aumentar la carga neta de los solutos, haciéndolos más hidrofílicos. Finalmente,

la

disminución

de

temperatura

también

puede

emplearse con vistas a favorecer la elución. Las elevadas concentraciones salinas de los eluyentes introducen ciertos inconvenientes en cromatografía hidrofóbica. A saber: a) dificultad de detección mediante medidas de absorbancia en el UV; b) desviaciones en las líneas básales de los cromatogramas por las importantes variaciones en el índice de refracción de los eluyentes al pasar de alta a baja fuerza iónica; c) elevada viscosidad de los eluyentes, que se traduce en ensanchamiento de los picos (apartado 6.15); d) ensanchamientos adicionales por cambios en los estados de agregación y conformación de los biopolímeros al variar la fuerza iónica; e) necesidad de emplear sales de muy elevada pureza, dadas las elevadísimas concentraciones en que se manejan.

71

CAPITULO III 72

TECNICAS CROMATOGRAFICAS

1. CROMATOGRAFIA PLANA La cromatografía plana, la integran un conjunto de tecnicas ampliamente difundidas por la sencillez del equipo experimental requerido, que pueden considerarse incluidas dentro de la cromatografía liquida (LC) debido a que la fase móvil es liquida. En ella, la fase estacionaria no se encuentra en el interior de una columna sino extendido en una superficie plana y la fase móvil liquida se desplaza por capilaridad o por adsorción. En función del tipo de superficie que actue como soporte, e pueden distinguir dos tipos fundamentales de cromatografía plana: 

La cromatografía de papel



La cromatografía en capa fina

73

1.1 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL La cromatografía de reparto puede realizarse en columnas de celulosa. La cromatografía en papel es una variante de este método, en la que el soporte de celulosa adopta la forma de' una hoja de papel. La celulosa contiene una gran cantidad de agua enlazada, incluso cuando ha sufrido procesos de deshidratación. El reparto tiene lugar entre el agua y el disolvente de revelado. A menudo este disolvente es también agua, por lo que cabe preguntarse si realmente el modo de acción en este caso es por adsorción o no. Seguramente existen efectos de adsorción pero, debido a que la estructura física del agua enlazada es muy diferente de la del agua «libre», todavía puede producirse un reparto.

Método experimental de la cromatografía en papel Acompañando al cambio en la forma del soporte (de columna a papel) también tiene lugar un cambio en la metodología. En la cromatografía en papel no hay efluente y las sustancias se distinguen entre sí por sus posiciones relativas en él papel después de que el disolvente ha recorrido una distancia dada. Se coloca un volumen diminuto (aproximadamente de 10 a 20 ¡A) de la disolución de la mezcla que se debe separar, en un punto marcado en una tira u hoja de papel (figura 8-6) y se seca. El punto define el origen. A continuación, el papel se coloca en una cámara cerrada y uno de sus extremos se sumerge en un disolvente apropiado (la fase móvil): La capilaridad arrastra al disolvente a través del papel y disuelve la mezcla cuando pasa por el origen, con lo que los componentes se mueven en la dirección del flujo del disolvente. (Obsérvese que, debido a la disolución previa de la

74

muestra al comienzo de la migración de sus componentes, uno de los factores que determina la separación de los componentes es la velocidad de solubilización de los mismos dentro de la fase móvil.) Después de que el frente del disolvente haya alcanzado un punto situado cerca del otro extremo del papel (véase la figura 8-6), se saca la hoja de la cámara y se seca. Las manchas, que pueden ser visibles o no, se detectan a continuación y se marcan sus posiciones. La distancia relativa recorrida por una mancha con respecto a la distancia recorrida por el frente del disolvente, se denomina Rf. Los valores que adopta Rf dependen de la sustancia, del papel y del disolvente utilizado. Los cromatogramas en papel pueden ser revelados por flujos ascendentes o descendentes del disolvente. En la figura 8-7 se muestra la disposición experimental para cada uno de los dos tipos. Hay muy poca diferencia en la calidad de los cromatogramas y la elección, por lo general, es cuestión de preferencias personales. La cromatografía con flujo descendente tiene dos ventajas: (1) es más rápida debido a que la .gravedad ayuda al flujo. (2) en las separaciones cuantitativas de materiales que poseen valores de Rf muy pequeños y que, por lo tanto, requieren recorridos largos, el disolvente puede recorrer todo el papel. Presenta la desventaja de que el aparato debe montarse con cuidado, ya que la existencia de suciedad o un mal o en la zona en la que el papel pasa al otro lado de la varilla soporte, puede ocasionar un flujo no homogéneo y el subsiguiente flujo acanalado. Una variante muy útil es la cromatografía bidimensional en papel. En este método, después de haberse realizado la cromatografía en una dirección, se seca el papel y se vuelve a cromatografíar en ángulo recto con respecto a la dirección original del flujo, utilizando un disolvente diferente (figura 8-8). De esta forma las sustancias

75

que no se separan en el primer disolvente, pueden separarse en el segundo disolvente. Detección e identificación de las manchas Las manchas en los cromatogramas de papel pueden detectarse por su color, fluorescencia, por las reacciones químicas que tienen lugar tras pulverizar el papel con distintos reactivos, o por la radiactividad de las manchas (figura 8-9). La detección de las manchas por medio de la autorradiografía utilizando película de rayos X, se ha descrito en el capítulo 6. La identificación se basa, por lo general, en la comparación con estándar de R, conocido o por elución. La elución se realiza recortando la mancha y sumergiendo el papel en el disolvente apropiado; esto puede hacerse a menudo de una forma cuantitativa. Huellas

dactilares:

una

aplicación

especial

de

la

cromatografía en papel al estudio de las proteínas Un problema importante de la biología molecular consiste en identificar una proteína una vez aislada o en identificar el lugar donde ha cambiado un aminoácido en una proteína mutante. La técnica de la «huella dactilar», desarrollada por Vemon Ingram, permite realizar identificaciones de una forma relativamente sencilla. Si se digiere una proteína bajo condiciones definidas con varias proteasa

(enzimas

que

rompen

los

enlaces

peptídicos),

se

producen péptidos pequeños. El número y los tipos de péptidos dependen de la proteína y de la proteasa utilizadas (p. e., una proteasa dada hidroliza los enlaces sólo junto a un aminoácido o una

clase

de

aminoácidos

concreta).

Los

péptidos

pueden

separarse por cromatografía bidimensional en papel dando una distribución de manchas, que raramente puede estar duplicada por una proteína distinta. Estos mapas de péptidos reciben el nombre de huellas dactilares —en la figura 8-10 se muestra un ejemplo. 76

La huella dactilar de una proteína mutante con un único cambio de aminoácidos se diferencia de la huella de la proteina normal (figura 8-10). Si el cambio de aminoácido no afecta al lugar de rotura de enlaces por la proteasa, puede desaparecer una mancha en la huella dactilar y aparecer una nueva mancha. Si el cambio afecta al lugar de rotura de los enlaces, pueden sufrir alteraciones varias manchas. Por elución de las manchas original y mutante y por determinación de la composición de aminoácidos de cada una (que puede realizarse mediante una hidrólisis enzimática seguida por cromatografía en papel), pueden determinarse los aminoácidos intercambiados. La técnica de huellas dactilares ha tenido aplicaciones importantes en la biología molecular; entre ellas, pueden mencionarse las siguientes: Prueba de que una proteína es un producto de la degradación de otra proteína mayor. Si todas las manchas de la huella dactilar de la proteína A se encuentran en la de la proteína B, es probable que la proteína A sea una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína B. Por lo tanto, o la proteína B se origina a partir de la A por adición de aminoácidos o la proteína A aparece por hidrólisis de la proteína B. En general, los estudios de la cinética "de la síntesis de A y B permiten distinguir entre estas posibilidades. Identificación de los aminoácidos insertados por diversos RNA de transferencia supresores. Algunas mutaciones ocasionan una terminación prematura de la secuencia de aminoácidos en las proteínas. Tal terminación puede ser revertida por la presencia de moléculas de tRNA-supresoras. Estas moléculas insertan un aminoácido en el lugar de terminación y permiten, por lo tanto, la continuación de la síntesis hasta su final natural. El resultado es una proteína con un cambio en un aminoácido. Las huellas dactilares de .tales proteínas permiten la

77

identificación del aminoácido insertado por cada i uno de los tRNA supresores conocidos. Identificación de los cambios de bases producidos por mutágenos determinados. Debido a que se conoce la clave genética, es posible identificar los cambios de bases que producen una mutación en particular. Supóngase que se sabe que un mutágeno produce con frecuencia cambios de fenilalanina a isoleucina. Los tripletes que corresponden en el DNA a la fenilalanina son AAA y AAG y los de la isoleucina son TAA, TAG y TAT. Debido a que la mayoría de las mutaciones cambian sólo una base, este mutágeno particular debe producir cambios frecuentes de A y T. 1.2 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Este

modo

cromatográfico

(TLC,

del

inglés

Thin

Layer

Chromatography) se puede considerar como una optimización de la cromatografía en papel. La idea subyacente es la misma: hacer avanzar,

por

capilaridad,

una

fase

móvil

sobre

una

fase

estacionaria plana, de forma que los solutos de la muestra aplicada se separen por su diferente Rf. El soporte de la fase estacionaria ya no es una estructura fibrosa, como la del papel, sino un sólido pulverizado, el cual se encuentra extendido en forma de una fina capa (0.15-0.5 mm de espesor) sobre una plancha de vidrio, plástico o metal. Para conseguir la cohesión del conjunto, el sólido pulverizado suele incluir un agente cementante, normalmente sulfató cálcico alcohol polivinflico. En comparación con la cromatografía en papel, las ventajas derivadas del uso de sólidos pulverizados y extendidos en capas finas

son

múltiples

(Cuadro

6.2).

Al

trabajar

con

sólidos

pulverizados se asegura que la superficie específica (m 2/g) sea muy elevada, y, por tanto, también la interfase de o entre fases móvil y estacionaria. Es frecuente trabajar con sólidos pulverizados en los que el diámetro promedio de las partículas se

78

sitúa en el intervalo de 10-45 m, con lo que se pueden conseguir superficies especificas de hasta 400 m2/g. Además, mientras en cromatografía en papel el soporte es normalmente un papel de filtro, o lo que es lo mismo, las fibras de celulosa que lo forman, en TLC son muchos los sólidos que pueden actuar como soporte, una vez pulverizados y extendidos: celulosa, poliamida, alúmina o gel de sílice. Este último, también llamado sílica-gel o sílica, es, con diferencia, el que más se utiliza. Se obtiene a partir de silicato sódico, y debe su nombre al aspecto de gel que toma cuando se suspende en medios acuosos. En la rnanufacturación de este soporte

cromatográfico

se

le

somete

a

un

proceso

de

fragmentación y criba, de forma que el gel de sílice comercial se caracteriza por estar formado por partículas de forma y tamaño muy homogéneos (ver Cuadro 6.11). Cuadro 1. Cromatografía en capa fina versus cromatografía en papel Características de la cromatografía en capa fina

Efecto Elevada acción capilar

Soporte/Fase estacionaria finamente dividido

Ausencia de estructura fibrosa

Elevada superficie de contracto entre fase móvil y fase estacional. Reducida dispersión de los solutos en la aplicación de la muestra y durante el desarrollo cromatográfico.

Ventajas frente a la cromatografía en papel Mayor rapidez de desarrollo Mayor eficiencia cromatografía Mayor sensibilidad en la detección Mayor versatilidad

Válida cualquier fase estacionaria que pueda ser finamente dividida.

79

La estructura química en la superficie de estas partículas se caracteriza por presentar grupos silanoles (SiOH), que son los que confieren a la sílica su carácter fuertemente polar. Ello posibilita la utilización de la sílica para la cromatografía de adsorción de solutos polares. Para este uso es preciso eliminar el agua que normalmente tiene retenida la sílica, precisamente por interacciones polares con sus grupos silanoles. De no tomar esta precaución, la separación cromatográfica de los diferentes solutos sería la consecuencia de un doble proceso. Por una parte se produciría un reparto por solubilidad, similar al comentado para cromatografía en papel, y por otra un proceso de adsorción sobre superficies polares. La extensión con que se darían uno y otro dependería de la humedad

de

la

placa,

y,

en

definitiva,

los

resultados

cromatográficos serían poco reproducibles. Para eliminar este inconveniente, se procede a activar las placas de sílica-gel antes de la aplicación de la muestra. Esto consiste en someterlas a temperaturas superiores a 100 °C durante más de una hora. La aplicación de muestras y el desarrollo cromatográfico en TLC es algo similar a lo descrito para la cromatografía en papel, con la diferencia de que la TLC siempre se desarrolla en sentido ascendente. En el caso de muestras complejas, puede ser difícil o imposible encontrar una única fase móvil que permita la adecuada separación de todos los solutos. En estos casos se puede acudir a desarrollos bidimensionales (Figura 6.2). Tras emplear una fase móvil en una dirección, se utiliza Otra para el segundo desarrollo en dirección perpendicular a la del primero. En estos casos la placa ha

de

secarse

antes

de

proceder

al

segundo

desarrollo

cromatográfico. Cuando la TLC se utiliza con fines preparativos, los solutos se han de extraer de la capa fina después del desarrollo cromatográfico. Ello es tan simple como raspar la capa fina (normalmente con la 80

punta de una espátula) en la posición donde se encuentre un soluto que se desee extraer. El polvo, o fase estacionaria, raspado se suspende en algún disolvente adecuado, con lo que el soluto embebido en él se disolverá. Mediante una simple filtración o centrifugación se dispondrá de una disolución de tal soluto, separado del resto de contaminantes que le acompañaban en la muestra

inicial.

Para

esta

utilización

de

la

TLC

con

fines

preparativos suele ser deseable cromatografiar un volumen de muestra mayor (" 200 /¡I) al que se cromatografía en aplicaciones analíticas (1-10 jid). Se hace preciso, entonces, trabajar con capas más gruesas (de hasta 2 mm de espesor), así como aplicar la muestra en bandas en lugar de en puntos discretos (múltiples aplicaciones puntuales de la misma muestra, una al lado de otra, hasta formar una banda). Para que lo anterior sea válido, el soluto debe ser visible, bien porque sea coloreado, bien porque se haya aplicado algún método de detección. Uno sencillo, utilizado con frecuencia, y que permite la inmediata visualización de muchos solutos, se basa en el empleo de placas de TLC cuya fase estacionaria contenga un agente fluorescente. Al finalizar la separación cromatográfica, se coloca la placa bajo una fuente de luz UV, observándose cómo toda ella emite radiación visible (generalmente de color verde), salvo en las posiciones donde se encuentran los solutos. Esas zonas aparecen oscuras por haberse producido un proceso de desactivación de fluorescencia, o uno de absorción de la luz UV por los solutos. Si este procedimiento no resulta aplicable, se acudirá a otros métodos ce oeicc-ción, que podrán ser inespecíficos, cuando se persiga la detección de todos los solutos presentes en la muestra, o específicos, basados en la reacción coloreada de determinados grupos funcionales (Cuadro 6.3). Estos métodos de detección también se pueden utilizar en cromatografía de papel, con la lógica excepción del método del ácido sulfúrico.

81

Con carácter general, el procedimiento a seguir será el de rociar la placa con un líquido que provoque la reacción de detección. Si ésta modifica la naturaleza química de los solutos se dice que la reacción es destructiva y, obviamente, no estará indicada en aplicaciones preparativas. En estos casos, lo que se suele hacer es rociar sólo un extremo de la placa con el líquido de detección. Así se detectarán los solutos de interés en una parte de la placa, infiriendo de ahí su localización en el resto, de donde podrán ser recuperados. Finalmente, conviene recordar que si las muestras sometidas a TLC se encuentran marcadas radiactivamente, serán de aplicación los métodos autorradiográficos ya descritos (Capítulo 1).

CUADRO 2 Métodos de Detección en Cromatografía de Capa Fina

Método

Aplicación

Color

Compuestos orgánicos

Pardo – amarillento(reversibl e)

Inespecífico Vapores de yodo Ác. Sulfúrico conc. +calor Específico 2,4dinitrofenilhidraz

Compuestos orgánicos

Negro (carbonización)

Compuestos

82

ina

carbonílicos

Naranja

AgNO3/OH-

Compuestos carbonílicos

Marrón

Ácido iodoplatínico Verde bromocresol Ninhidrina

Bases de

Ácidos Aminas primarias (aminoácidos) Aminas secundarias

Rodamina ó G

Lípidos

Púrpura – negro Azul – violáceo Marrón Fluorescencia amarillo – rosácea (exc = 366 nm)

2. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA En este modo cromatográfico la fase estacionaria se dispone como el relleno de un recipiente cilíndrico, de vidrio, plástico o metal, abierto por ambos extremos, que se denomina columna. Dicho relleno, también llamado lecho cromatográfico, ha de tener una estructura porosa a fin de que pueda fluir la fase móvil. El flujo estará propiciado por la acción de la gravedad (cromatografía convencional; apartado 6.5) o por sistemas de bombeo de alta presión (cromatografía líquida de alta resolución; apartado 6.14). La esencia misma de la cromatografía se encuentra en el íntimo o entre fase móvil y estacionaria. Para conseguirlo es necesario evitar la formación de grietas y acanaladuras en el lecho, ya que de existir, la fase móvil circularía más fácilmente por ellas, en lugar de por los intersticios entre partículas, disminuyendo el o entre fases. La operación de preparación de un buen lecho cromatográfico recibe el nombre de empaquetado, y es crucial para unos buenos resultados croma-tográficos (apartado 6.5). Al igual que en TLC y cromatografía en papel, también en cromatografía en columna lo normal es llevar a cabo una aplicación zonal de la muestra. En cromatografía en columna esto

83

se consigue depositando la disolución problema sobre la parte superior del lecho cromatográfico (Figura 6.3). Una vez aplicada la muestra, se abre la columna por el extremo opuesto y se deja que la disolución problema vaya fluyendo hacia el interior del lecho. Antes de que la parte superior de éste se seque, se aporta nueva fase móvil, y así se sigue de modo continuado hasta el fin del proceso. El ir pasando fase móvil hasta la salida de los solutos se llama elución, y el término eluido hace referencia a la fase móvil que se. recoge desde la aplicación de la muestra hasta la salida de todos los solutos. Con carácter general, a la fase móvil se la suele llamar también eluyente. En su viaje a través de la fase estacionaria, los solutos no sólo se irán separando cromatográficamente sino que también difundirán, por lo que la zona en la que viaja cada uno se irá ensanchando y sus límites difuminando. De este modo, la distribución de cada soluto en el eluido de la columna será de tipo gaussiano. El perfil de elución, perfil cromatográfico o cromatograma es la sucesión de curvas gaussia-nas que informa sobre la salida de los diferentes solutos (Figura 6.4). Para

cada

soluto,

correspondiente

la

pico

posición

en

gaussiano,

el

eje

informa

de sobre

abscisas el

del

tiempo

transcurrido desde que se aplicó la muestra hasta que se produjo la elución de la columna. A este tiempo se le llama tiempo de retención, tR.

Normalmente, el caudal aflujo de fase móvil (F; ml/min) se mantiene constante durante la elución cromatográfica, luego, V R  F .t R

84

siendo VR el volumen de retención, también llamado volumen de elución, Ve, que es el volumen de fase móvil que ha de pasar a través de la columna para que eluya un soluto dado. Un soluto que no sufra retraso alguno por la fase estacionaria (soluto a en la Figura 6.4), viajará en todo momento con la velocidad de la fase móvil, u. Para una columna de longitud L el tiempo que tarda en eluir este soluto vendrá dado por: tM 

L u

donde el subíndice M hace referencia a la fase Móvil. El volumen de elución de este soluto no retrasado será: V M .F . t M

Con frecuencia tM y/o VM se designan también como (o y V0, respectivamente, dándoles los nombres de tiempo o volumen de exclusión, pues corresponden a un soluto que ni interacciona ni se reparte con la fase estacionaria, esto es, que queda excluido completamente de ella. Al volumen VM también se le suele llamar volumen

vacio

o

hueco

(en

inglés

void

volume),

ya

que

corresponde al volumen del lecho cromatográfico no ocupado por las propias partículas de la fase estacionaria (fracción de volumen de lecho cromatográfico ocupado por la fase móvil). Cuando un soluto se encuentra en la fase móvil se desplaza con la velocidad de ésta, u, pero cuando interacciona o se reparte con la fase estacionaria su velocidad es nula. Por tanto, se puede afirmar que el tiempo (de un soluto es la suma del tiempo durante el cual sus moléculas viajan en la fase móvil (tM), más el tiempo neto que permanecen inmóviles en la fase estacionaria (t’ R; tiempo de retención ajustado):

85

t R  tM  t'R

De la anterior expresión se deduce que el tu de un soluto que experimenta un retraso cromatográfico (soluto b en la Figura 6.4), se calcula como la diferencia entre su tiempo de retención (t R), y el tiempo de elución de un soluto no retrasado (tM). Este tiempo ajustado da una idea directa de la mayor o menor intensidad de la interacción o reparto del soluto con la fase estacionaria, "nene sentido utilizar este t’R, no en términos absolutos, sino referido al tiempo de exclusión, tM.

t R' t t  R M k tM tM

Este cociente, que se designa con la letra k, recibe el nombre de factor de capacidad, y es característico de cada soluto para unas fases móvil y estacionaria dadas, independientemente de cuáles sean los valores del flujo, F, y de la longitud de la columna, L. Reordenando la ecuación (6.6) se llega a

t R  t M 1  k 

o en términos de volumen de eluido, VR  Vm 1  k 

86

En la puesta a punto de un método cromatográfico, el objetivo es alcanzar un perfil de elución en el que la separación entre los picos cromatográfícos de dos solutos, 1 y 2, que eluyan uno detrás de otro, sea óptima. De acuerdo con las ecuaciones (6.7) y (6.8), estas diferencias vendrán dadas por t R , 2  t R ,1  t M  k 2  k1 

V R , 2  V R ,1  VM  k 2  k1 

donde tR,1, tR,2, VR,1 y VR,2,

son los tiempos/volúmenes de retención

o elución de los solutos 1 y 2, y k1 y k2 son sus respectivos factores de capacidad. Con vistas a la separación efectiva de ambos solutos, es preciso asegurar que las diferencias entre sus valores de k sean adecuadas; pero, además, el ensanchamiento de sus picos cromatográficos no ha de ser tan acusado que arruine los efectos de una buena separación entre los máximos. En la Figura 6.5 se presentan dos situaciones bien distintas en cuanto a separación y anchura de dos picos cromatográfícos. El caso A representa un resultado cromatográfico peor que el caso B; mientras en este último los dos picos están perfectamente separados, en el caso A hay solapamiento entre ellos, lo que se pone de manifiesto en que no se alcanza la línea basal entre la salida del primer soluto y la del segundo. En definitiva, además de la separación entre picos, hay que tener en cuenta su anchura. Para un par de solutos, 1 y 2, un sistema cromatográfico proporcionará un factor de separación o selectividad, a, que vendrá dado por 

k2 k1

 siendo k 2

 k1 

Modificar la separación entre esos dos solutos implicará, por tanto, la modificación en la selectividad de la columna; en suma, alterar la termodinámica (valores de k) del sistema. 87

A diferencia de la separación entre picos, la anchura de éstos no viene determinada por factores termodinámicos, sino por factores cinéticos (apartado 6.15). Son éstos los que darían cuenta de la mayor eficiencia observable en el cromatograma B de la Figura. 6.5, en comparación con el A; y ello, a pesar de su menor selectividad. En términos cualitativos, una columna cromatográfica será más eficiente cuantos más estrechos sean los picos de elución que genere. En cromatografía se utiliza el concepto de plato teórico, para hacer referencia a cada una de las láminas en que "imaginariamente" se puede considerar dividida una columna cromatográfica. Se trata de suponer que las moléculas de un soluto van alcanzando, en cada una de esas láminas o platos teóricos, un equilibrio de interacción con la fase estacionaria, o un equilibrio de reparto entre ésta y la fase móvil. El retraso que finalmente experimente el soluto en su elución dependerá del número de estas etapas de equilibrio, en suma, del número de platos teóricos, n, de la columna. Pero, no sólo el tR de un soluto está relacionado con n, también la anchura de su pico de elución se ve afectada por este número. No en vano, cuanto mayor sea el tR, más tiempo tendrán las moléculas de soluto para irse dispersando. Asi, la eficiencia de una columna se cuantifica a partir de su número de platos teóricos, calculando este número según la siguiente expresión  tR     

2

n

donde a hace referencia a la desviación estándar de la curva gaussiana que representa el pico de elución de un soluto (Figura 6.6).

88

En la práctica, para el cálculo de n se mide la anchura total del pico gaussiano a la mitad de su altura, lo que se conoce como wh (del inglés,"width at half-height"). Para un pico gaussiano perfecto, wh =2.354 - con lo que la expresión (6.11) se transforma en  t  n  5.54 R   wh 

2

 V  n  5.54 R   wh 

2

o en términos de volumen,

donde ahora w,, también se mediría en unidades de volumen. El valor de n es independiente del pico cromatográfico escogido para su evaluación. Cuanto mayor sea el tR o el VR, de un soluto, mayor será la anchura de su pico de elución; pero el cociente de ambos se mantendrá constante. Lógicamente, n depende de la longitud de la columna. Por ello, es frecuente hablar de platos teóricos

por

unidad

de

longitud

de

lecho

cromatográfico.

Alternativamente, se puede especificar la altura del plato teórico, h, que será el resultado de dividir la longitud de la columna, L, por su número de platos teóricos, n: h

L n

La altura del plato teórico se expresa (generlamente

milímetros)

y

su

en unidades de longitud

valor

está

inversamente

relacionado con la eficiencia de la colulmna, siendo además

89

independiente de la longitud del lecho cromatográfico. Desde un punto de vista práctico, la determinación de n o de h permite tener una medida de la calidad del empaquetado de una columna. Hasta

aquí

se

cromatografía;

han

introducido

selectividad

y

dos

conceptos

eficiencia.

Los

claves

en

respectivos

parámetros  y n se han de optimizar con vistas a conseguir que los diferentes solutos de la mezcla inicial eluyan como picos independientes. Se dice entonces que los componentes de la mezcla han quedado resueltos. Pero,

aparte de este significado

cualitativo, el término resolución tienen en cromatografía un significado cuantitativo. La resolución, Rs, de dos cromatograficos se define como, Rs 

t R , 2  rR ,1 1  wb, 2  wb,1  2

Donde wb se refiere a la anchura de los picos guassianos en su base. El cálculo de RS a partir de la expresión se suele llevar a cabo con pares de picos que se encuentren relativamente próximos en el cromatograma.

Cabe

esperar

entonces

que

las

respectivas

anchuras wb,1 y wb,2 sean muy parecidas, por lo que la expresión (6.16) se puede reducir a

Rs 

t

R,2

 t R ,1  wb

siendo wb la anchura en la base de cualquiera de los picos en consideración. Asumiendo la forma gaussiana para estos picos, es posible expresar esta anchura en. función de la desviación estándar: wb  4.

90

Sustituyendo en (6.17) el valor dado por esta última, queda, RS 

t R .2  t R .1 4.

A partir de la anterior es fácil llegar a la siguiente, sin más que. considerar las expresiones (6.7), (6.9)-(6.11) aplicadas al soluto 2, RS 

n k2  1 . . 4 1  k2 

Dado que los dos solutos en consideración eluirán relativamente próximos

(k2  k1), la fracción k2l(1 + k2) que aparece en el

segundo término de la expresión anterior podrá ser reemplazada por kl(1 + k), siendo k el factor de capacidad de cualquiera de ellos, RS 

n k  1 . . 4 1 k 

Queda claro de esta expresión que la resolución cromatográfica depende de factores cinéticos



n /4



y factores termodinámicos

 k / 1  k .  1 /   Mejorar la resolución actuando sobre los factores cinéticos obliga a aumentar el número de platos teóricos de la columna. Dado que este número es proporcional a la longitud del lecho cromatográfico, una posibilidad seria la de aumentar esta longitud. Sin embargo, tal solución puede no ser rentable, ya que Rs depende de n1/2, y por tanto de L1/2. Así, para duplicar la resolución cromatográfica habría que cuadruplicar la longitud de la columna, y ello puede o ser impracticable o imponer tiempos de elución exageradamente

91

largos. La mejor forma de mejorar este factor cinético es empaquetar lo mejor posible el lecho cromatográfico, y utilizar fases estacionarias con un tamaño de partícula pequeño y homogéneo (apartado 6.15). Por su parte, los factores termodinámicos a considerar son dos, capacidad, k/(1+k), y selectividad,(-1)-. En cuanto al primero, el margen de maniobrabilidad es relativamente estrecho. En efecto, k puede variar desde O hasta , sin embargo el cociente k/(1+k) tiene un valor límite de 1 (Figura 6.8), y éste se alcanza relativamente pronto. Así, utilizar sistemas cromatográficos que proporcionen valores de fe superiores a 10 no aporta grandes ventajas,

y

sí

considerables

inconvenientes

en

cuanto

al

alargamiento de los tiempos de elución. Se ha comprobado que un valor de 2 para fe proporciona la mejor situación de compromiso en el binomio resolución-tiempo de elución. En la práctica, lo más adecuado

es

trabajar

con

sistemas

cromatográficos

que

proporcionen fe comprendidas entre 1 y 10; en otras palabras, que la elución de los solutos se produzca en el intervalo 2 . VM - 11 . VM (expresión 6.8). Finalmente, el término (a -1)1 a de la expresión (6.21) es el que resulta más útil para mejorar la resolución. El intervalo en que normalmente suele encontrarse a es entre 1 y 2, donde 1 correspondería a un par de solutos cuya separación en el correspondiente sistema cromatográfico sería imposible, mientras que en el otro extremo ( = 2), la separación cromatográfica sería ciertamente fácil. Con a variando en el intervalo mencionado, es fácil ver que el término ( -1)l puede llegar a variar hasta en tres órdenes de magnitud (Figura 6.8). Mejorar la relación (- 1)/ se limita, en esencia, a encontrar el par fase estacionaria/fase móvil más adecuado. También ése es el camino para mejorar en lo posible el otro factor termodinámico que

92

influye en la resolución, k/(1+k). En la práctica, la selección de la fase estacionaria está muchas veces limitada por el tipo de muestra problema. En tales casos sólo queda como variable la modificación de la fase móvil. Afortunadamente en CL se puede llevar a cabo la elución de los solutos con fases móviles cuya composición química vaya variando durante la propia elución, lo que se conoce como elución en gradiente. De esta forma se puede ejercer un buen control sobre la resolución de dos solutos, al poder modificar los factores termodinámicos sobre la marcha.

4. CROMATOGRAFÍA DE GASES En los tipos de cromatografía de reparto descritos hasta ahora, la muestra es arrastrada por una fase móvil líquida sobre una fase estacionaria líquida, en la que el líquido está inmovilizado por adsorción o absorción a un soporte sólido. En la cromatografía de gases (GLC, «gas-liquid chromatography») la fase móvil es un gas; la fase estacionaria es un líquido adsorbido a la superficie interna de un tubo o columna (funcionamiento tubular o capilar) o a un soporte sólido (funcionamiento en columna empaquetada) como la tierra de diatomeas, Teflon en polvo o finas cuentas de vidrio. En general, el líquido se aplica como un sólido disuelto en un disolvente volátil, como el éter. Por ejemplo, las cuentas de vidrio se sumergen en una disolución de polietilenglicol en éter. Cuando el

éter

se

evapora,

cada

cuenta

queda

recubierta

de

polietilenglicol. A la temperatura utilizada para la cromatografía de gases, el polietilenglicol funde y permanece en las cuentas como una película líquida. La muestra, que puede ser cualquier compuesto capaz de ser volatilizado sin sufrir descomposición, se introduce como líquido con un gas inerte —helio, argón o nitrógeno — y a continuación se calienta. Esta mezcla gaseosa pasa a través del tubo que está dispuesto según se muestra en la figura 8-13.

93

En el funcionamiento en columna empaquetada el tubo tiene de 1 a 20 metros de longitud y 0,5 cm de diámetro. En el método capilar la longitud es de 30 a 100 metros. Para conseguir resoluciones muy elevadas, se utilizan sistemas capilares de dos kilómetros de tubo. Los compuestos vaporizados se redistribuyen continuamente entre la fase móvil gaseosa y la fase estacionaria líquida, de acuerdo con sus

coeficientes

de

reparto

y

son,

en

consecuencia,

cromatografiados. Al final de la columna se usa un detector apropiado.

Detección de sustancias en el efluente En el trabajo analítico se utilizan, por lo general, tres tipos de detectores: La

célula

de

conductividad

térmica

(con

una

sensibilidad

aproximada de 10 pg), el detector de ionización de argón (sensibilidad de 10-5 g) y el detector de ionización de llama (sensibilidad de aproximadamente 10-5 g). La acción de la célula de conductividad térmica está basada en el hecho de que la resistencia eléctrica de un alambre es dependiente de la temperatura. Si un gas fluye con una velocidad constante a través de un alambre caliente, éste puede ser enfriado a una temperatura determinada-por la velocidad de flujo y la conductividad térmica del gas. Por lo tanto, a una velocidad de flujo constante, la temperatura

y,

por

consiguiente,

la

resistencia,

es

una

característica de cada gas. Si la composición del gas cambia, tendrá lugar un cambio en la conductividad térmica del gas y, por lo tanto, de la resistencia del alambre; ésta se presenta, por lo general, como un registro gráfico en función del tiempo de flujo del gas. Con un detector de ionización de argón, éste (el gas portador) pasa a través de una cámara de detección (en el agujero de salida de la

94

columna) similar a un contador de Geiger-Müller y es ionizado mediante bombardeo con partículas . Según se explica en el capítulo 5, cuando el ion argón positivo se acerca al cátodo, captura un electrón y se neutraliza. Esta recombinación produce rayos X que ionizan más átomos de argón. Esto causa una ionización continua autogenerada, de forma que se produce una corriente constante en el tubo de Geiger-Müller. Si se encuentra presente un compuesto con un potencial de ionización menor que el del argón, puede choca." con los iones del argón y transferir un electrón. El compuesto queda cargado positivamente. Cuando se acerca al cátodo, capta un electrón y queda

neutralizado.

No

obstante,

con

muchos

compuestos

orgánicos el exceso de energía resultante de la recombinación no conduce a la producción d& radiación electromagnética, sino que determina la rotura de enlaces químicos. Por lo tanto, cuando se encuentra presente un compuesto de este tipo, la corriente entre los electrodos disminuye. Esta corriente se mide y se representa en función del tiempo. Se hace necesaria una calibración, al igual que en el detector térmico. La sensibilidad de este tipo de detector es de 0,1 g. El detector de ionización de llama viene esquematizado en la figura 8-14. Se quema gas hidrógeno con aire en presencia del efluente de la columna. Todo el carbono presente en la muestra se quema y se convierte en dióxido de carbono. Por razones que todavía no están muy claras, se producen electrones e iones negativos que se detectan en forma de corriente, la cual es convertida en diferencias de voltaje. Este detector opera linealmente desde 0,01 g hasta 5 mg y cuenta esencialmente los átomos de carbono. En la figura 815 se muestra un cromatograma de gases típico. Identificación de componentes a la salida del detector

95

Cada uno de los detectores indica la cantidad de material que sale de la columna en función del tiempo. No obstante, no hay una indicación directa de la identidad- del material que produce un pico concreto ni de la cantidad de éste que existe en el pico. Por ejemplo, si las sustancias presentes en una mezcla se conocen por adelantado (y el propósito de la cromatografía es determinar la cantidad de cada una de ellas), los picos suelen identificarse preparando una muestra duplicada que contenga una pequeña cantidad de una sustancia conocida que se ha añadido, y volviendo a cromatografiar. Si esta sustancia conocida es alguna de las que componen,

la

mezcla,

aumentará

el

tamaño

del

pico

correspondiente (figura 8-16). Si los picos son parte de una serie homologa (p. e., etilésteres de ácidos grasos), puede representarse gráficamente el logaritmo del tiempo de retención (es decir, el tiempo que transcurre entre la inyección de la muestra y su aparición en el detector) en función del número de átomos de carbono (figura 8-17), y, en general, el resultado será una línea recta. La adición de uno o dos de los estándares de la serie homologa,

proporciona

entonces

una

calibración

para

el

cromatograma. Por supuesto, este método sólo puede utilizarse si se sabe que todas las sustancias forman parte de una serie homologa. La identificación de sustancias desconocidas es difícil y no existe un método general para hacerlo. A veces se burbujea el gas efluente a través de disoluciones de control que dan lugar a colores determinados con grupos funcionales específicos (p. e., aldehído, alcohol, etc.). Otro método consiste en la alteración química y repetición de la cromatografía de, la muestra frente a varios estándares o bien el análisis mediante otras técnicas físicas. Esto se hace a menudo si se sospecha qué tipos de sustancias pueden ser. Por supuesto, para identificar sustancias se debe

96

utilizar un detector no destructivo (p. e., la célula de conductividad térmica). La determinación cuantitativa de la cantidad de material en un pico no es un procedimiento directo. Para cualquier compuesto, la cantidad de material es directamente proporcional al área del pico. No obstante, la constante de proporcionalidad varía con las sustancias. Por tanto, lo primero que se necesita es identificar el material que se encuentra en un pico determinado. La cuantificación requiere la preparación de una curva estándar; es decir, deben cromatografiarse diferentes cantidades de la sustancia y hacer una gráfica que relacione el área del pico con la cantidad de material.

Ventajas de la cromatografía de gases Con

la

cromatografía

de

gases

se

consiguen

excelentes

separaciones. La velocidad y la sensibilidad son extraordinarias, siendo detectables cantidades del orden de 10 -12 gramos para muchas sustancias. Debido a que la rapidez del revelado de los cromatogramas depende de la velocidad de difusión entre las fases móvil y estacionaria, y debido a que la velocidad de difusión de los gases es mucho mayor que la de los líquidos, el cromatograma de gases puede ser realizado unas mil veces más rápido que el equivalente

en

la

cromatografía

líquida

en

columna.

Por

consiguiente, las separaciones pueden obtenerse, con frecuencia, en menos de un minuto. Además, utilizando un detector no destructivo y condensando la muestra en la recogida final, es posible utilizar la cromatografía de gases de- forma preparativa. Los instrumentos de preparación en masa pueden purificar cantidades importantes del material que se está tratando, hasta llegar a gramos. La cromatografía de gases puede utilizarse con cualquier sustancia que pueda volatilizarse. Por lo tanto, hay miles de compuestos 97

orgánicos que pueden separarse con este tipo de cromatografía. Las sustancias no volátiles pueden examinarse, si es posible, convirtiéndolas en derivados volátiles por oxidación, acilación, alquilación u otros procesos. Su principal utilización con muestras biológicas es la separación de alcoholes, esteres, ácidos grasos y aminas. Por lo tanto, es de una gran utilidad en el estudio del metabolismo intermediario y en el análisis del mecanismo de acción de los enzimas. Se ha utilizado en gran escala para identificar los componentes aromatizadores de los alimentos y vinos y para la detección de pesticidas en materiales biológicos. La cromatografía de gases juega también un papel muy importante en el análisis orgánico. Por ejemplo, el carbono y el. hidrógeno pueden determinarse con una precisión del 0,5 % y el 0,1 %, respectivamente, por combustión de la muestra en un flujo seco de oxígeno, libre de CO2 y H2O, y determinando la cantidad de CO2 y H2O

que

forma.

También

pueden

identificarse

los

grupos

funcionales —p. e., los grupos alcoxi se detectan por iodación para formar ioduro del alquilo correspondiente, que puede identificarse con facilidad También puede determinarse la posición de un doble enlace,

rompiendo

el

enlace

por

oxidación

u

ozonólisis

y

cromatografiando los productos.

5. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) En una primera etapa, la cromatografía de líquidos se realizaba en columnas de vidrio con diámetros comprendidos entre 1 y 5 cm. y 98

longitudes entre 50 y 500 cm. Los tiempos de separación de las distintas muestras, eran largos y frecuentemente duraban varias horas. Los primeros intentos para acelerar el procedimiento clásico mediante la aplicación de vacio o por bombeo, no resultaron efectivo. Los avances tecnológicos de los últimos años han permitido poner en funcionamiento una serie de métodos cromatográficos para los que se emplea la denominación de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)que son los más utilizados en la actualidad, y se caracterizan por:  Su gran sensibilidad.  Su capacidad para proporcionar determinaciones cuantitativas exactas.  Su gran utilidad a la hora de separar sustancias no volátiles, o termolábiles.  Por ser utilizados para sustancia de gran interés en la industri, en muchos campos de la ciencia, etc. La cromatografía de líquidos de alta resolución, puede ser utilizada como método d e separación de sustancias tan variadas como: - Plaquicidas - Hidrocarburos.

- Ácidos nucleicos. - Azúcares.

- Aminoácidos.

- Drogas.

- Proteínas.

– Terpenoides.

Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusión de las bandas, aumentando por tanto la resolución. El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector

99

permite la aplicación de la muestra. A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna, se requiere un colector.

En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografía, identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares, que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente.

100

CAPITULO IV

101

FUNDAMENTO TEÓRICO La cromatografía es la técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (liquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser sólida o líquida. Hay que indicar que el nombre de la técnica es incorrecto, ya que no consiste en escribir con colores. Este nombre proviene de la primera experiencia cromatográfica realizada, la cual se utilizo para separar pigmentos coloreados de plantas. La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso de origen italiano Mijail Tswett en 1903. Tswett separo los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verde en éter de petróleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. No obstante, no existen datos sobre la utilización de esta técnica hasta 1930 cuando khun y Lederer separaron también pigmentos de las plantas usando como adsorbentes alúmina y carbonato de calcio. Fue a partir de ahí cuando se inicio el verdadero desarrollo de la cromatografia. Para explicar el fenómeno cromatográfico es necesario establecer dos tipos de fundamento: uno remoto y otro próximo Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades físicas o físico químicas de los analitos: solubilidad, adsorción (tendencia a ser retenidos en sólidos finamente

102

divididos),

volatilidad,

tamaño,

carga,

reactividad

química

o

bioquímica, etc. La mezcla de sustancias a separar se coloca en una situación experimental dinámica donde exhiben dos de estas propiedades, o bien una de ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos líquidos diferentes como ocurre en cromatografía liquido - liquido. Deben cumplirse las condiciones siguientes: - Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo o entre si. - El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible. Fundamento próximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o físico - químicas frente a un sistema cromatográfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeñas, se basa la separación cromatográfica. Si se transforma la idea del equilibrio estático establecido entra las dos fases en un equilibrio dinámico, se tiene la realidad del fenómeno cromatográfico. Como se ha indicado anteriormente, una de las fases, denominada fase móvil, fluye a través de la otra, a la que se denomina fase estacionaria, que permanece inmóvil, y que, al menos en una extensión esta en equilibrio con la fase móvil. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan so “movilidad” entre si y con respecto a la fase móvil. Se eligen las condiciones experimentales y las fases cromatográficas para que los componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. La base de la separación cromatográfica será, por tanto, la diferencia en la velocidad de migración de los mismos. La cromatografía es probablemente la más versátil de las técnicas de separación: es aplicable a cualquier mezcla soluble o volátil. De hecho las técnicas de separación suelen dividirse en dos grandes grupos: cromatograficas y no cromatograficas. La elección de una técnica

103

cromatográfica concreta dependerá de la naturaleza y cantidad de la muestra, del objetivo de la separación y de las limitaciones del tiempo y equipo asequible. Puede

hacerse

una

primera

distinción

entre

las

técnicas

cromatográficas atendiendo a la integración continua o no del sistema de detección. Así, la cromatografia no conlleva a un sistema de detección, mientras que cualquier cromatógrafo de líquidos o gases lleva incorporado dicho sistema siendo, por tanto, auténticos instrumentos.

IMPORTANCIA DE LA COMATOGRAFÍA  Purificación de la penicilina.  Purificación de las proteínas terapeúticas.  La técnica cromatográfica con un enfoque al área clínica nos sirve para identificar bacterias mediante la comparación obtenida del cromatograma

obtenido

con

un

patrón

predispuesto,

para

identificar distintos tipos de: aminoácidos, proteínas, nucleótidos, hemoglobina, esteroides etc.  Separaciones de componentes de plantas medicinales.  Separación de componentes de una síntesis orgánica.  Separación de colorantes.  Separación e identificación de hioscina y de morfina.  Separación de acEido acetico,alcohol cetilico y metil-etil cetona.

104

 Separación e identificación de los compuestos intermedios de una síntesis organiza, por ejemplo en la síntesis del naftaleno, identificación de acido ftalico, anhidrido ftalico, benceno.  En la producción sintética de acetaminofen, identificación de la imina de la N-acetilbenzoquinona. Identificación de levo-alfa-acido aminoadipico, durante la biosintesis de penicilina.  Identificación de 8-nitroisoquinolina, durante la síntesis de Ciprofloxacina, un antibiótico.

APLICACIONES AL ANÁLISIS DE ALIMENTOS  Conservantes antioxidantes: se usa el gradiente de HPLC con un detector colorimétrico para medir simultáneamente los nueve antioxidantes más comunes.  Análisis de carbohidratos en bebidas: la adición de mono y disacáridos a bebidas y zumos sirve como propósito de enriquecer el sabor. Para determinar si la cantidad añadida es correcta se miden los azucares usando HPLC de intercambio iónico con detección de pulso amperométrico con detectores de refracción o ultravioletas.  Isómeros de carotenoides: el HPLC en combinación con detectores calorimétricos permite el análisis de los carotenoides dietéticos en tejidos animales y vegetales.

105

 Flavonoides y fenoles: en el vino la medición de estas sustancias permite la determinación del color, la edad y las variedades de uva usadas. El HPLC en combinación con colorímetros,

permiten

la

determinación

de

hasta

22

compuestos diferentes simultáneamente.  Lípidos: la determinación de lípidos animales y vegetales como: colesterol, triglicéridos, glicéridos y esteroles, se basa en el uso del HPLC y un detector de Dispersión de Luz Evaporativa (ELS).  Acidos lipoico y ácido dihidrolipoico en suplementos alimenticios: aun en estudio pero su detección combinando HPLC con detectores colorimétricos es importante ya que estos dos compuestos parecen importantes como antioxidantes y reguladores del ciclo celular.  Medición

de

nutrientes

liposolubles

en

tabletas

multivitamínicas: el uso del HPLC permite la detección de múltiples

vitaminas

en

alimentos

suplementarios

para

neonatos.  4-Hidroxinonenal y otros aldehídos: se forman como resultado de peroxidación de lípidos, durante la cocción o podredumbre. Se usa HPLC con detectores de fluorescencia para detectar estas sustancias que son citotóxicas.  Surfactantes no iónicos: la detección de estas sustancias es crucial puesto que están altamente reguladas debido

a

problemas medioambientales, se usa HPLC combinado con dispersión de luz evaporativa.  Carbohidratos simples: usar HPLC con ELSD elimina la necesidad de usar bases fuertes o alto pH, convirtiéndose en un método no destructivo.  Catequinas del té: las catequinas son flavonoles del té, posiblemente anticancerígenos. Se usa HPLC con hidrólisis enzimática para detectar estas sustancias tan beneficiosas.

106

 Triglicéridos:

HPLC

con

ELSD

permite

la

separación

y

caracterización de todos los tipos de triglicéridos.  Contaminantes triptófanos: el HPLC con ELSD y detectores colorimétricos permiten la detección de esta sustancia tóxica proveniente de plaguicidas.

APLICACIONES GENERALES 

Aplicaciones de la cromatografía de reparto en productos de alimentación : edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos, colorantes, aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos.

107

Aplicaciones de la cromatografía iónica : el análisis de drogas y



sus metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas para vitaminas, azúcares, y preparaciones farmacéuticas. Aplicaciones referidas a productos alimenticios en



cromatografía por exclusión de tamaños: separación de ácidos grasos, determinación de glucosa fructosa y sacarosa en zumos enlatados. Aplicaciones de La cromatografía de Gases. Se pueden destacar



las siguientes aplicaciones o ejemplos: 

Aminas aromáticas heterocíclicas (HAA) formadas durante la cocción de alimentos proteicos (carne y pescados). Donde estos compuestos son mutagénicos potentes bien conocidos y algunos de ellos son carcinógenos. Se han formado en alimentos cocinados, y también se han detectado en las muestras ambientales (aerotransportadas partículas, aire de interior, humo del cigarrillo...) y en las muestras biológicas (orina, plasma). Por lo tanto, el aislamiento y la medida de HAA son muy importantes para el gravamen de riesgo para la salud humana.



Control de los procesos de destilado de aguardientes a escala industrial: Se identifica y cuantifica, mediante cromatografía en fase gaseosa aquellos componentes que definen la calidad básica de los orujos y cuyo control exige la istración: grado alcohólico, acidez total, acetato de etilo, metanol, acetaldehido, acetal y alcoholes superiores.



Determinación de enantiomeric de compuestos chiral en aceites de mesa ( aceites de oliva, avellana, cacahuete y nuez) haciendo uso de HPLC inversa y CG.



Estudio de vinos monovarietales.



Caracterización de avellanas por su composición en ácidos grasos.



Identificación d compuestos volátiles en granos de cacao.

108



Determinación del perfil del ácido graso, acidez y valor del peróxido en la calidad del aceite de oliva contra el almacenaje.



Determinación cuali y cuantitativa de componentes volátiles en hierbas y especias.



Separación de compuestos volátiles del queso.



Análisis de compuestos terpénicos de la uva de la variedad albariño.



Estudio de compuestos azufrados volátiles pesados es vinos tintos de la denominación de origen ribeira sacra.

CONCLUSIONES 109

Se puede concluir que la cromatografía es en la actualidad una técnica ampliamente utilizada en la resolución de macromoléculas de interés en la industria biotecnológica, biológica y bioquímica. Muestra de ello es el numeroso grupo de estudios realizados que se encuentra en la literatura especializada. Se destaca en las últimas décadas un mayor uso de la cromatografía. Esta versión instrumental de la cromatografía convencional resulta más ventajosa debido a los pequeñísimos volúmenes que se necesitan para el estudio en cuestión y los resultados se obtienen en un tiempo mínimo. Estos aspectos la hacen preferida entre las técnicas de separación.

110

ANEXOS CROMATOGRAFIA DE REPARTICION

Figura 8-3

Figura 8-4

CROMATOGRAFIA EN GEL

111

Figura 8-1

Figura 8-20

112

Figura 8-22

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO

113

114

CROMATOGRAFIA DE PENETRABILIDAD

115

GLOSARIO

116

 Cromatografía: La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida.  Cromatógrafo: El instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica.  Cromatógrama: Una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un detector, la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración en el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo. En la cromatografía plana, "cromatógrama" puede referirse al papel o capa con las zonas separadas.  Fase Ligada: Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las partículas de soporte o a la pared interior de la columna.  Fase Inmovilizada: Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las partículas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por polimerización in situ (entrecruzamiento químico) tras un recubrimiento.  Fase Móvi: Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en una dirección definida. Puede ser un líquido (Cromatografía Líquida), un gas (Cromatografía de Gases) o un fluido supercrítico (Cromatografía con Fluido Supercrítico). En la cromatografía de gases se uede usar la expresión Gas Portador para la fase móvil. En la cromatografía de elución se usa también para la fase móvil la expresión Eluyente.

117

 Eluir: Aplicar la cromatografía de elución. El proceso de elución se puede detener mientras todos los componentes de la muestra están aún en el lecho cromatográfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se prefiere el término "Eluir" a "Desarrollar", término usado en nomenclaturas anteriores de cromatografía plana.  Efluente: La fase móvil que abandona la columna.  Muestra: Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya separación se pretende en el lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos por la fase móvil.  Componentes de la Muestra: Los constituyentes químicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente. Se aceptan también los términos Eluito y Analito para un componente de la muestra.  Soluto: Término que se refiere a los componentes de la muestra en la cromatografía de reparto.

 Disolvente: Término que en ocasiones se refiere a la fase estacionaria líquida en la cromatografía de reparto.

 Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorción y de reparto.  Adsorción: Es la retención de una especie química en los sitios activos de la 118

superficie de un sólido, quedando limitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial, esta retención superficial puede ser física o química.  C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar.  C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar.  Elución: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.  Eluyente: La fase móvil una vez que se extrae de la columna.  Origen: Lugar físico donde se coloca la muestra al principio.  Revelado: Proceso de separar un soluto de la muestra por medio de cromatografía.  Soporte: El material sólido inerte que en la Cromatografía de reparto sirve para sostener la fase estacionaria líquida en su sitio.  Sorbente: Cualquier fase estacionaria.

 Contraión: (Termino usado en HPLC, cromatografía iónica), Un contraión es un ión que se combina con el ión analito para formar una pareja de iones, que es una especie neutra que es retenida por el relleno de la fase inversa.  Efectividad o selectividad de una columna cromatográfica: Se dice que una columna es efectiva cuando las especies a separar se eluyen a velocidades relativas

119

suficientemente diferentes (los picos están suficientemente separados).  Eficacia de una columna cromatográfica: Se dice que una columna es tanto más eficaz cuanto menos sea el ensanchamiento de los picos. La eficacia será mayor cuanto más pequeña sea la altura de plato y mayor sea el número de platos.  Resolución de una columna: Parámetro que proporciona una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos solutos. Debe ser mayor a 1,5 para que se considere buena.  Tiempo de retención:( tr ) Es el tiempo entre la inyección de una muestra y la aparición de un pico de soluto en el detector de una columna cromatográfica.  Tiempo muerto: ( tm ) Es el tiempo que tarda en salir de la columna una sustancia no retenida.

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BIBLIOGRAFÍA

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