Práctica 2. Coloraciones Microbiológicas 5i4t1n

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA ESCUELA DE NUTRICIÓN Y DIETÉTICA MICROGIOLOGÍA

PRÁCTICA 2. COLORACIONES MICROBIOLÓGICAS

OBJETIVO  Identificar las diferencias morfológicas de los microorganismos a través del estudio microscópico.  Aprender las técnicas de preparación de frotis y coloraciones microbiológicas más importantes.

INTRODUCCIÓN La mayoría de los microorganismos son incoloros, por esto es necesario recurrir al uso de colorantes para observar a través del microscopio óptico características morfológicas. Las tinciones aumentan artificialmente el contraste entre las células y el medio. El primer paso para la observación microscópica de microorganismos teñidos es la preparación del frotis, que debe asegurar una distribución de los microorganismos sobre el portaobjetos de tal manera que estos queden lo más separado posibles y puedan apreciarse características particulares. Para evitar la pérdida de la muestra en el proceso de tinción, este frotis debe ser fijado al portaobjetos por calor para inactivar las células y adherirlas al vidrio sin alterar la morfología microbiana. Las tinciones en microbiología se pueden clasifican de la siguiente manera: SIMPLE Observar tamaño, distribución, forma Un solo colorante Tinción del microorganismo o del fondo de la muestra DIFERENCIAL Clasificar microorganismos de acuerdo a características morfológicas Varios colorantes ESPECÍFICA Identificación de estructuras microbianas: Flagelos, capsula, esporas

Azul de metileno Azul de lactofenol Safranina GRAM Ziehl Nielsen

Nigrosina Verde de malaquita Rosalina

MATERIALES Y REACTIVOS  Portaobjetos  Asas de ojo  Solución salina  Azul de lactofenol  Cristal violeta  Lugol

    

Alcohol acetona Safranina Aceite de inmersión Mechero Microscopio

PROCEDIMIENTO 1. Preparar el frotis a partir de un cultivo solido de microorganismos. Tomar una gota de solución salina y depositarla en el centro del portaobjetos, resuspender en esta gota la porción de la colonia que se ha tomado del cultivo solido teniendo en cuenta todas las normas de asepsia para evitar la contaminación. Permitir la desecación completa de la muestra y fijarla sometiéndola por 2 segundos a la llama del mechero 3 veces. 2. Coloración simple. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de lactofenol durante 1 minuto. Eliminar el exceso de colorante con agua usando un frasco lavador. Dejar secar al aire. 3. Coloración diferencial. Cubrir el frotis con dos gotas de cristal violeta por 1 minuto. Eliminar el exceso de colorante con la ayuda de agua y adicionar 2 gotas de lugol, mantener por 1 minuto. Eliminar el lugol y realizar la decoloración con alcohol acetona por 15 segundos, lavar rápidamente el frotis y adicionar 2 gotas de safranina, mantener por 1 minuto. Lavar completamente la muestra y dejar secar al aire.

4. Observación al microscopio óptico en el objetivo de 100X. Microorganismos Gram positivos se observan morados y los microorganismos gram negativos se observan rosados.

5. Descripción microscopica y macroscopica de los microorganismos observados.

CONSULTA 1. Cuál es la función de cada uno de los colorantes usados en la tinción de GRAM 2. Explique brevemente en que consiste la tinción de endosporas bacterianas

BIBLIOGRAFIA  Brock M, Martinko M, Parker J. Biología de los microorganismos. 10 ed. Madrid: Pearson; 2004.  Montoya H. Microbiología básica para el área de la salud y afines. Medellín : Editorial Universidad de Antioquia, 2008.  Pelczar, J, Reid R, Chan Ch. Microbiología. 4ª ed.México: Mc Graw Hill; 1996.  Jawetz E.,Brooks,G., Butel J., Morse S., Carroll K., Melnick J., Adelberg E., Mietzner T. Microbiología Médica. 25 ed. México: McGraw-Hill Interamericana; 2011.  Botero D., Restrepo Marcos. Parasitosis humanas. 5ª ed. Medellín: CIB; 2012.  Mossel D., Moreno B., StruijkC. Microbiología de los alimentos: fundamentos ecológicos para garantizar y comprobar la integridad (inocuidad y calidad) microbiológica de los alimentos. - 2. Ed España ; Editorial Acribia, 2003.