Informe 4. Observacion Microscopica De Bacterias 4p3f32

Microbiología Industrial Informe de Laboratorio Práctica No. 4., 05/10/2016

OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE BACTERIAS Alexa Roa, Jhon Armenta, Leidy Cuyares Programa de Biologia, Departamento de Biologia y Química, Universidad de los Llanos Vereda Barcelona, Km 12 vía a Puerto López, Villavicencio 500017, Meta, Colombia.

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Resumen- Para la observación detallada de bacterias, se observaron microorganismos del género, Bacillus sp, población microbiana de Escherichia coli, y de Klebsiella sp. Para la apreciación de algunas características físicas y morfológicas como tinción de Gram y movimiento bacteriano para los Bacillus sp. y la Escherichia coli, identificación del, observación de capsula de la Klebsiella sp., y contraste cromático de las endosporas para los Bacillus sp. Se dedujo de la observación de tinción de Gram que los bacilos presentan coloración de Gram + movimiento perimétrico y formación de endosporas importante, la Escherichia coli presento tinción de Gram -, movimiento polar definido, la Klebsiella sp. Presenta una capsula que recubre y forja una estructura visible en tinción negativa.

Palabras Clave: Bacteria, tinción, colores, microscopia, clasificación

Metodología

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Movilidad

Se utilizaron dos bacterias patógenas (E. coli, lactobacilos), para esto se tomaron dos portaobjetos a los cuales se les aplico una solución salina, posteriormente se tomaron las bacterias con un asa extendiéndolas en el líquido del portaobjetos y se colocaron respectivamente en cada uno de los portaobjetos, los cuales se fijaron con calor, se los coloco un cubre objetos y se colocaron el microscopio a 100x con aceite de inmersión. 

Tinción de endosporas

Para esta tinción se tomó un portaobjetos al cual se le aplicó una solución salina, posteriormente se tomó la bacteria

lactobacilos con un asa y se colocó respectivamente en el portaobjetos, la cual se fijó con calor, después se le coloco papel absorbente y se le adiciono el colorante verde malaquita. Durante 5 minutos se le aplico constantemente colorante y calor, evitando que el papel se pegara a la superficie, posteriormente se enjuago con agua destilada y se procedió al secado, luego de unos minutos se llevó al microscopio en el cual se observó con aceite de inmersión a 100x 

Tinción Negativa

Se colocó tinta china en una esquina del portaobjeto y después una muestra de Klebsiella encima, con un cubreobjetos se extiende por el resto del portaobjetos para distribuir bien la muestra (solo se pasó una

vez), se dejó secar a temperatura ambiente, se le adiciono aceite de inmersión y se observó en el microscopio. 

Tinción de Gram

Se utilizaron dos bacterias patógenas (E. coli, lactobacilos), para esto se tomaron dos portaobjetos a los cuales se les aplico una solución salina, posteriormente se tomaron las bacterias con un asa extendiéndolas en el líquido del portaobjetos (frotis) y se colocaron respectivamente en cada uno de los portaobjetos, los cuales se fijaron con calor, se les adiciono cristal violeta durante 1min el cual se le retiro con abundante agua, después se le añadió Lugol y se dejó actuar durante 1 min y se le retiro con abundante agua, posteriormente se le adiciono Alcohol durante 20 s y se lavó, finalmente se le adiciono el colorante fucsina durante 20 s y se lavó la lámina, la cual se dejó secar y se le coloco una gota de aceite de inmersión y se observó en el microscopio 100X.

en todo el perímetro de la célula, además este género también presenta coloración de Gram morada (imagen 1.) y permite afirmar que se clasifica como bacteria Gram +. Adicionalmente también se pudo evidenciar por contraste cromático la presencia de endosporas en los individuos de los Bacillus. Para la Escherichia coli la coloración de Gram fue rosa violeta brillante (imagen 2.) por su naturaleza se clasifica en bacteria Gram -, adicionalmente se notó que esta bacteria presenta un movimiento polar definido, debido a que posee una estructura monótrica (un solo flagelo alargado en uno de los extremos). También se evidencio por medio de una tinción simple con tinta china, la capsula bacteriana de individuos de Klebsiella sp al microscopio en 100 x (imagen 3.) Por un contraste evidente que permite ver la morfología de la bacteria.

Resultados

Por lo observado en el laboratorio y gracias a que se contaba con un cultivo bacteriano bastante puro, se estableció que la movilidad de las bacterias vistas al microscopio del genero Bacillus sp. Es de perítrical, es decir que existencia de un movimiento caótico y aleatorio por la presencia de pilís establecidos

2 Tinción de Gram de Bacillus sp.

2 Tinción de Gram de la Escherichia coli

3 Tinción negativa de Klebsiella sp. Con tinta china

Análisis

La determinación de la movilidad bacteriana es uno de los parámetros que se utiliza en la identificación de bacterias (Rodríguez Cavallini, & et al). La cepa de Bacillus y E. coli analizada presentó movilidad, esta capacidad usualmente se debe a la presencia de flagelos (Rodríguez Cavallini, & et al). La movilidad del Bacillus sp. se observó de manera peritrical indicando la presencia de flagelos perítricos en estas bacterias, y la del E. coli presentó un movimiento polar definido indicando la presencia de un flagelo (estructura monótrica). Las capsulas bacterianas no tienen la misma afinidad por los colorantes que otros componentes celulares, por este motivo se hace uso del método de tinción negativa para su observación. La tinta china consiste en una suspención helicoidal que no puede penetrar a través de la cápsula, sino que precipita alrededor de ella (Negroni, 2009 ). El género Klebsiella es un bácilo no flagelado, y por lo tanto es inmóvil, pero posee una gran cápsula que los carateriza (Romero, 2007). La tinción de esporas permite poner en manifiesto la endospora bacteriana, una forma de resistencia producida por algunos generos de bacterias Gram positivas. Los bacilos son capaces de producir estas estructuras (Vázquez, Martín, & et al, s.f). Las endosporas son muy resistentes a los procedimientos tintoriales usuales. Para lograr introducir el colorante dentro de la espora es necesario aplicar calor (Rodríguez CavallinI, & et al). El calor modifica la permeabilidad de la endospora permitiendo la entrada del colorante a través de las capas externas y el lavado con abundante agua produce la decoloracion de las formas vegetativas. Igualmente se observo que no se podia distinguir correctamente ya que el rosado que cubria la espora es muy suave

debido que se dejo 30 segundo con el indicador de fucsina y según la literatura es 1 minuto (Rodriguez, 2005). Por medio de la tinción de GRAM, elaborada por Hans Christian Gram en 1804, se determinó que la cepa de Bacillus sp. es gram positiva y la cepa de E. coli es gram negativa. Estas tiñen de colores distintos debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula gram positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. La pared de la célula gram negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delagada, unicamente de petidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolipidos, lipopolisacaridos y lipoproteínas (Universidad Tecnologica Nacional, 2009). El iodo del lugol (iodo + ioduro potásico) forma con el cistal violeta un complejo insoluble en agua, pero soluble en alcohol o acetona. Al tratar la muestra de Bacillus sp., esta no se decolora porque su pared de peptidoglicano es gruesa y contiene pocos lípidos que dificultan la penetración del alcohol que pudiera extraer el colorante (Macarulla & Goñi, 1994). Por el contrario la muestra de E. coli si se decolora y para observar en microscopio se añade fucsina que la va a tenir de rojo. Conclusiones

Mediantes técnicas simples de tinción se puede observar en un cultivo de bacterias simples características morfológicas microscópicas en individuos de lactobacilos, E. coli y Klebsiella sp.

Bibliografía

Macarulla, J. M., & Goñi, F. M. (1994). Bioquímica humana (segunda ed.). Barcelona: Reverté S.A. Negroni, M. (2009 ). Microbiología Estomatológica: fundamentos y guía práctica . Buenos Aires: Médica Panamericana . Rodríguez Cavallini , E., Gamboa Colorado , M. d., & et al. (s.f.). Bacteriología General . Costa Rica: Editorial Universidad de Costa Rica. Rodriguez, E. (2005). Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio. Romero, R. (2007). Microbiología y Parasitología Humana (Tercera ed.). México : Médica Panamericana. Universidad Tecnologica Nacional. (2009). Tinción y observación de microorganismos . Vázquez, C., Martín, A., & et al. (s.f). Técnicas básicas de microbiología: observación de bacterias. Madrid: REDUCA.