Lp 5 - Membrana Celulara + 1a1l64

Membrana celulară

1

Microscopie  La

M.O. membrana celulara nu este vizibilă deoarece grosimea sa , de ordinul zecilor de nm , este sub limita de rezolutie a acestuia.  Examinate la M.E. cu o mărire de ordinul zecilor de mii , celula apare delimitată de o linie intunecată subţire, continuă. 2

3

Ultrastructură Plasmalema  Glicocalix  Schelet asociat membranei 

4

5

PLASMALEMA 

 

La măriri de peste 50000 de ori, membrana celulara are o structura trilaminară , fiind alcatuită din două benzi întunecate si una clară , care le separă. Acest aspect trilaminat este clasic denumit PLASMALEMA substrat molecular: bistratul lipidic şi proteinele asociate acestuia. Cele două benzi electronodense ale plasmalemei se evidenţiază datorită contrastării cu CITRAT DE PLUMB, care se leagă de grupările fosfat ale fosfolipidelor. 6

GLICOCALIX Pe versantul extern al plasmalemei există o reţea de filamente fine , ramificate ce alcătuiesc GLICOCALIXUL sau GLICOLEMA  substrat molecular: lanţuri de oligozaharide. 

7

CITOSCHELETUL ASOCIAT MEMBRANEI reţea alcatuită din microfilamente orientate neregulat, anastomozate între ele  alcatuire proteică. Prin reţeaua de proteine care îl formează, citoscheletul este ancorat la plasmalemă şi se continuă spre interiorul celulei cu CITOSCHELETUL ASOCIAT MaTRICEI 

8

MODALITATI DE STUDIERE A MEMBRANEI CELULARE 1.

STUDIUL ULTRASTRUCTURAL GENERAL a. Microscopie electronică de transmisie i. Pe secţiuni ii. Pe preparate de îngheţare- fracturare b. Microscopie electronică de baleiaj

9

TEHNICA DE INGHETARE – FRACTURARE Fracturare – la nivelul porţiunii hidrofobe a bistratului lipidic membranar.  Se pot studia feţele interne ale celor două straturi lipidice ale membranei : faţa externă E si cea internă P  Proteinele membranare sunt mai bogate pe fata P fiind ancorate de citoschelet. 

10

Inghetare - fracturare

Cutit

Fa ta P

Fa ta E

Fata P

Se rea lizea za o replica in C si Pt

Fara E

Fa ta externa

Fete de fra ctura Fa ta citopla sma tica

11

STUDII SPECIFICE Citochimie ultrastructurală i. ii. iii. iv.

– trasori electronodensi cu Feritina Peroxidaza de hrean Citocrom c ( hempeptizi) Aur coloidal

12

Metode biochimice i. 1. 2.

Marcare pe celule intacte radioactivă pentru interacţiuni afine ( în sistem haptene/anticorp sau biotina/avidina )

ii.

Separare de fracţiuni purificate de membrane 13

Metode biochimice 

Haptenele sunt molecule mici , care inserate pe un lanţ polipeptidic devin puternic imunogene. Împotriva lor se pot astfel ridica anticorpi. Ei se pot utiliza apoi in cromatografia de afinitate pentru purificarea proteinelor de membrana pe care a fost inserată haptena.

14

Metode biochimice 

Sistemul biotină/avidină are la baza afinitatea deosebită a avidinei, o proteină , faţă de biotină. Această interacţiune specifică este utilizată în separarea biochimică prin afinitate a unor proteine de membrană pe care s-a inserat biotina. Acest sistem este folosit şi în studii citochimice folosind trasori electronodenşi cu avidină.

15

STUDIUL CITOCHIMIC AL LIPIDELOR a. FILIPINA – pentru colesterol, formând agregate care dezorganizează membrana şi se observă la M.E. b. POLIMIXINA B – pentru fosfolipidele anionicePS şi PI .  se poate evidentia distribuţia asimetrică a lipidelor în cele două straturi ale bistratului lipidic: 1. colesterolul este distribuit preferential pe fata E 2. fosfolipidele pe fata P 16

STUDIUL BIOCHIMIC AL LIPIDELOR după fracţionarea membranelor şi extragerea lipidelor a. Cromatografie în strat subţire b. Cromatografie în fază lichidă de înaltă performanţă ( HPLC) i. Cu faze normale – clase de lipide ii. Cu faze inversate – tipuri de lipide dintro clasă c. Cromatografie in fază gazoasă -

17

STUDIUL PROTEINELOR - prin citochimie a. liganzi marcaţi cu feritină , peroxidază de hrean etc.– pentru receptori b. anticorpi marcaţi – pentru orice proteină - metodele biochimice a. electroforeza în una sau două dimensiuni b. cromatografie în fază lichidă clasică şi /sau de înaltă performanţă i. gel-filtrare ii. schimb ionic iii. prin afinitate

18

STUDIUL COMPONENTEI GLUCIDICE LECTINELE – sunt proteine sau glicoproteine ce interacţionează specific cu anumite secvenţe glucidice, au cel puţin două situsuri de interacţiune identice şi nu sunt de origine imună  se folosesc fie prin marcarea directă radioactivă sau prin compuşi electronodenşi - în citochimie a. lectine marcate b. lectina + glicoproteina marcată c. (endo)glicozidaze + citochimie cu lectine 

19

STUDIUL COMPONENTEI GLUCIDICE Cele mai cunoscute lectine sunt a. Concanavalina A care leaga specific structuri ce conţin manoză sau glucoză b. lectina din germeni de grâu care recunoaşte anumite tipuri de acizi sialici c. lectina din arahide care recunoaste galactoza terminală - tehnici biochimice a. cromatografie de afinitate (pentru glicoproteine) b. cromatografie în strat subţire (pentru glicolipide)după fracţionare şi separarea lipidelor 

20

MODELUL MOZAIC FLUID Membrana celulara este o structura fluida alcatuita din proteine , lipide si glucide.  lipidele alcatuiesc un bistrat continuu,  proteinele sunt dispuse in mozaic fiind ataşate de o parte şi de alta a bistratului lipidic sau pătrund în acesta, străbătându-l  glucidele sunt situate pe versantul extern al membranei si sunt oligozaharide ataşate la proteine sau lipide. 21

22

JONCTIUNI CELULARE Structuri membranare cu rol în adezivitatea celulelor în cadrul unui ţesut  Observabile doar la MET 

Clasificare  Simple  spaţii intercelulare  denticulare  digitiforme



Speciale  strânse  de ataşare  de comunicare 23

Joncţiuni speciale - zonula occludens 

Joncţiunea strânsă = zonula occludens  ME: “închiderea “ spaţiului intercelular, prin apoziţia membranelor a 2 celule adiacente

24

Joncţiuni speciale - Desmozomii 

2 tipuri:  Desmozomi în bandă (zonula adherens)  Desmozomi în spot (macula adherens) ME: condensare membranară care prezintă pe versantul citoplasmatic placa desmozomală 25

Joncţiuni speciale Hemidesmozomii Implicaţi în ME: componenta celulară adeziunea celulăare acelaşi aspect ca matrice extracelulară desmozomii, dar localizarea diferă – la polul bazal al celulei 

26

Complexul joncţional 

Succesiunea de la polul apical spre cel bazal a următoarelor tipuri de joncţiuni:  Joncţiunea strânsă  Zonula adherens  Macula adherens

27

Joncţiuni speciale – de comunicare = joncţiuni gap  2 membrane alăturate străbatute de canale hidrofile = conexoni 

28