Manual De Hemostasia Fac. Bioanalisis. r392r

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOANALISIS Manual para Laboratorio de

HEMOSTASIA

Que presenta

Norma Edith Hernández Hernández

Director Q.C. Jorge Sigfrido González Hernández

Xalapa, Ver.

Noviembre de 2009

1

Facultad de Bioanálisis.

Manual de Laboratorio de Hemostasia.

INDICE Introducción………………………………………………………………..………….....3 Fase preanalítica en Hemostasia. Practica 1 Toma de muestras y manejo de anticoagulantes en Hemostasia……...5

Pruebas para evaluación de la fase vascular. Practica 2 Prueba de fragilidad capilar (Rumple-Leedle)…………………………...16 Pruebas para evaluación de la fase plaquetaria. Practica 3 Recuento de plaquetas…………………………………………………….19 Practica 4 Evaluación cualitativa de las plaquetas…………………………………...28 Practica 5 Tiempo de sangrado de Ivy………………………………………………..34 Practica 6 Retracción del coágulo……………………………………………………..37

Pruebas para valoración de la coagulación plasmática Practica 7 Tiempo de protrombina……………………………………………………..40 Practica 8 Tiempo de Tromboplastina parcial…………………………………………47 Practica 9 Utilidad de la mezcla de plasmas…………………………………………..51 Practica 10 Tiempo de trombina………………………………………………………...58 Practica 11 Cuantificación de fibrinógeno………………………………………………61 Practica 12 Solubilidad del coágulo en urea……………………………………………65 Practica 13 Investigación de anticoagulantes circulantes…………………………….69

Pruebas para evaluar los mecanismos reguladores de la coagulación Practica 14 Proteína C y S………………………………………………………………79 Practica 15 Antitrombina III……………………………………………………………...85 Pruebas para la valoración de la fibrinólisis Practica 16 Tiempo de lisis del coágulo de euglobulinas………………………....….89 Practica 17 Determinación de alfa-2-antiplasmina……………………………….......93 Practica 18 Productos de degradación del fibrinógeno y fibrina……………………..97 Practica 19 Dímeros D………………………………………………………………….100 Apéndice de reactivos………………………………………………………………….....104

2



INTRODUCCION La sangre es líquida mientras se encuentra dentro del organismo, pero se transforma en un gel resistente en pocos minutos después de salir del organismo. La hemostasia es la combinación de acontecimientos celulares y bioquímicos que funcionan en armonía para mantener la sangre líquida dentro de las venas y las arterias, evitar la pérdida de sangre en las lesiones mediante la formación de trombos y restablecer el flujo sanguíneo durante el proceso de curación. Cuando se altera el equilibrio de los sistemas de hemostasia, la trombosis o la hemorragia pueden llegar a ser fatales. (3) Los químicos clínicos, los hematólogos y otros profesionales, investigan en laboratorio todos los sistemas de hemostasia principales (vasos sanguíneos, células

sanguíneas

y

proteínas

plasmáticas)

diagnosticar y manejar la enfermedad hemostática.

para

prevenir,

predecir,

(3, 4, 6)

La hemostasia es un proceso constituido por mecanismos biológicos interdependientes cuya finalidad es prevenir la extravasación sanguínea espontánea, evitar la hemorragia excesiva a nivel de los vasos lesionados y mantener la fluidez de la sangre circulante. (1) Los mecanismos de la hemostasia dependen de estos factores: a) pared vascular, b) función plaquetaria, c) coagulación sanguínea, d) anticoagulación y fibrinólisis El mantenimiento de una hemostasia normal supone el correcto funcionamiento de estos cuatro factores, de forma que la alteración de uno solo de ellos es siempre causa de patología. (4) En esquema, el proceso de la hemostasia puede resumirse como sigue: Al producirse una lesión vascular, el vaso afectado se contrae transitoriamente disminuyendo el paso de la sangre a su través (reacción vascular). A continuación las plaquetas circulantes se adhieren rápidamente al colágeno del 3



tejido subendotelial, que se ha exteriorizado como consecuencia de la lesión, liberando agonistas de la agregación de aquellas y la formación de un trombo plaquetario

(función

plaquetaria).

El

trombo

plaquetario

detiene

momentáneamente la hemorragia, mientras es reforzado por la formación de fibrina (coagulación sanguínea) producida en cantidades cuidadosamente controladas, tanto en cantidad como en ubicación dentro del tejido dañado (regulación de la coagulación). Finalmente, se inicia la cicatrización de la herida, al mismo tiempo que la fibrina es digerida por un sistema enzimático (fibrinólisis). (3, 1, 7) Por todo esto, el abordaje clínico de los trastornos de la hemostasia debe ser basado en la tríada: Historia clínica, exploración física y pruebas de laboratorio. Es la clínica la que orientará la búsqueda de una alteración congénita o adquirida y la que hará sospechar de un defecto específico en alguna de las fases de la hemostasia en función del tipo de manifestaciones hemorrágicas o trombóticas. De la misma manera, el laboratorio juega un papel por demás relevante en el estudio de los trastornos de la hemostasia, pues a través de pruebas estratégicamente orientadas por la clínica, su correcta realización y una interpretación correcta y oportuna de los resultados analíticos, es posible establecer un diagnóstico, pronóstico y seguimiento de las diversas patologías de la hemostasia. (3,2,5) El manual de laboratorio de Hemostasia se plantea como un trabajo práctico educativo que sirve de guía metodológica en el conocimiento, la selección, ejecución e interpretación de las pruebas de laboratorio más adecuadas, convenientes y pertinentes para el estudio de cada una de las fases de la hemostasia. Se incluyen en él, pruebas para evaluar la fase plaquetaria (cuanti y cualitativamente), la coagulación plasmática y sus mecanismos de control, así como la valoración de la fibrinólisis. Aunque la evaluación de la fase vascular no es factible a través de laboratorio, se contempla una prueba que aunque poco específica, puede aportar cierta ayuda si se relaciona con otros resultados y sobre todo con la clínica. 4



PRÁCTICA 1 FASE PREANALITICA EN HEMOSTASIA TOMA Y CONSERVACION DE MUESTRAS SANGUÍNEAS MANEJO DE ANTICOAGULANTES

La sangre es una suspensión de células en un líquido llamado plasma que circula por el sistema vascular, formado por vasos sanguíneos de diverso calibre. En los tejidos, el sistema vascular se ramifica y disminuye progresivamente su calibre hasta constituir la llamada microcirculación formada principalmente por capilares (sistema capilar) y vasos de muy pequeño calibre. Las paredes de los capilares permiten el intercambio de agua y sustancias diversas entre el interior del sistema vascular y los tejidos del organismo facilitando así, la oxigenación y el metabolismo celulares. (4,5) La sangre fluye libremente

a lo largo del sistema vascular gracias a las

contracciones del corazón, la retracción de los grandes vasos, el movimiento muscular y la fuerza de la gravedad. Gracias a ello las células sanguíneas pueden realizar sus funciones y el plasma puede contribuir al metabolismo de los tejidos mediante la adecuada distribución de sustancia nutritivas a las células, la recogida de los productos de desecho resultado del metabolismo celular, la regulación del pH y el trasporte de gases respiratorios (oxigeno y bióxido de carbono). (3,5) El estudio de la sangre requiere su previa extracción del organismo. Esta puede hacerse mediante diversos métodos, siendo los mas empleados la punción venosa o capilar. Al igual que cualquier otra técnica o práctica clínica, tanto la extracción sanguínea como la recogida del espécimen deben realizarse en condiciones muy precisas y de acuerdo con las recomendaciones internacionales de control de calidad. Una muestra así obtenida se conoce como muestra sanguínea de calidad analítica. (3,4) 5



Los resultados de los exámenes sanguíneos dependen en gran medida de la correcta obtención y manipulación inicial del espécimen, de forma que una extracción deficiente puede ser causa de resultados erróneos a pesar de usar una correcta metodología. (1,2) En la actualidad pueden practicarse diferentes tipos de punciones para obtener muestra de sangre de calidad analítica, entre ellas está la punción venosa, la capilar y la arterial. La diferencia entre elegir una u otra alternativa radica básicamente en el tipo de pruebas que se requiere realizar, las características del paciente que permitan mayor facilidad para realizar la punción, y la cantidad (volumen) de muestra requerida para los estudios a practicar. Por ejemplo la punción capilar es utilizada cuando sólo se requieren pequeños volúmenes de sangre (grupo sanguíneo, monitoreo de glicemia) o bien en casos de pacientes pediátricos o de muy difícil punción por otras técnicas. La punción arterial queda restringida básicamente a estudios especiales como la medición de los niveles de gases sanguíneos y equilibrio ácido básico en la sangre (gasometría arterial) (1, 2, 4,5) La punción venosa resulta la forma de extracción sanguínea más utilizada en la práctica diaria. El sitio de elección para practicarla es la región venosa de la fosa antecubital, ya que a este nivel existe una piel delgada y móvil, y además las venas son de un calibre adecuado y relativamente superficiales, fáciles de observar y/o de palpar. Las venas superficiales de la cara anterior del antebrazo que se utilizan son: a) vena cefálica, ubicada en la parte superior del antebrazo y del lado del pulgar de la mano; b) vena basílica, ubicada en la parte inferior del antebrazo y del lado del dedo meñique de la mano; y c) vena cubital mediana, que conecta las venas basílica y cefálica en la fosa antecubital (flexión del codo) y generalmente es la vena de elección. (2,4,5) Si el paciente aprieta el puño después de aplicar un torniquete, la vena se torna más prominente. El paciente no debe realizar movimientos de bombeo con el puño, pues se pueden afectar algunos de los valores a analizar. Se debe palpar (examinar mediante el tacto) con el dedo índice, la vena para determinar su profundidad, dirección y grosor. Si en ninguno de los brazos se puede hallar la 6



vena, se examinan las venas del lado dorsal de la muñeca, la mano o el pie. La estrategia en algunas instituciones es solicitar a una segunda persona que intente localizar una vena en el brazo antes de utilizar estos tres sitios alternativos. (2,4) La manera más común de recolección de las muestras de sangre es mediante el uso de sistemas de tubos al vacío. Estos utilizan tubos de plástico o de vidrio, una aguja y un adaptador, que se utiliza para asegurar la aguja y el tubo. Los tubos contienen una cantidad preestablecida de un aditivo sellado al vacío. Debe preferirse siempre que sea posible el sistema de tubos al vacío por sobre la extracción con jeringa y aguja hipodérmica. (4,1) Existen muchas ventajas al utilizar el sistema de tubos al vacío para la toma de muestra sanguínea, por ejemplo: a) Permite recoger la sangre directamente de la vena del paciente a los tubos, evitando el o de la sangre con el exterior del tubo y por lo tanto probables contaminaciones del ambiente o del personal de laboratorio; b) el volumen de sangre extraída mediante este sistema es prácticamente ilimitado pues depende del número de tubos a utilizar y la capacidad de cada uno de ellos; y c) se consigue siempre una proporción correcta entre la cantidad de sangre extraída y el anticoagulante usado. (4) Existen tubos de diferentes tamaños que contienen diferentes aditivos y aunque existen varios fabricantes de tubos al vacío, todos respetan un código de color universal en el cual el color del tapón del tubo indica el tipo de aditivo que contiene. En el laboratorio de Hemostasia los anticoagulantes mas usados son el citrato de sodio al 3.2% y con menor frecuencia el EDTA-K2 (sal dipotásica del ácido etilen diamino tetra acético) Aunque en ciertas ocasiones se requiere el uso de heparina o incluso sangre sin anticoagulante para pruebas especiales generalmente poco frecuentes. 7



Las recomendaciones generales del procedimiento para la venopunción según el documento H3-A5 del Clinical and Laboratory Standars Institute (CLSI), anteriormente National Committee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS) son las siguientes: 1. Seleccionar el sitio adecuado para la venopunción 2. Limpiar el sitio elegido con alcohol isopropílico, con círculos concéntricos desde el centro hacia la periferia. Dejar secar al aire 3. Aplicar el torniquete 5 a 10 cm por encima del sitio seleccionado, por no más de un minuto 4. Revisar el empaque de la aguja y enroscarla firmemente al adaptador 5. Realizar la venopunción con la fijación de la vena con el dedo pulgar 2.5 cm por debajo del sitio e insertar la aguja, con el bisel hacia arriba, con un ángulo de 15º entre la aguja y la piel. Recolectar los tubos respetando el orden correcto de extracción, mezclando por inversión de cada tubo de inmediato después de la recolección. Orden de extracción de los tubos: a. Hemocultivo b. Tubos sin aditivo (tapón rojo) c. Tubo para coagulación (TAPON CELESTE) d. Otros tubos con aditivos i. Tubos con gel separador de suero (tapón dorado) ii. Tubo con heparina (tapón verde) iii. Tubo con EDTA (tapón lavanda) iv. Tubo con oxalato de potasio o fluoruro de sodio (tapón gris) 6. Retirar el torniquete en cuanto se restablece el flujo de sangre 7. Asegurarse que la mano del paciente esté abierta 8. Colocar la gasa o torunda con suavidad sobre el sitio de punción, sin presionar y retirando la aguja inmediatamente antes. 9. Aplicar presión directa sobre el sitio de punción unos minutos hasta que el sangrado se detenga 10. Colocar un esparadrapo o vendolete sobre el sitio de punción. 8



11. Desechar el material de punción y otros residuos biopeligrosos. 12. Verificar las condiciones del paciente. (1,2)

Consideraciones particulares de la fase preanalítica en la valoración de la hemostasia: Generalmente los exámenes de laboratorio son integrales y si se realizan pruebas de coagulación conjuntamente con estudios de rutina sencillos se suele pedir un ayuno mínimo de 4 horas para que el plasma o suero no interfiera con las determinaciones cuyo método de detección se relacione con el paso de luz de una fuente luminosa (turbidimetría, colorimetría) El diagnóstico de los trastornos hemostáticos se basa en la tríada: historia clínica, exploración física y laboratorio. Por esta razón, para aprovechar al máximo los beneficios del laboratorio de Hemostasia, se requiere un estrecho o con el personal médico. Por ejemplo, cuando se desea hacer el estudio de trombofilia y pruebas especiales de coagulación, es indispensable estar en o con el médico tratante, ya que la ingesta de anticoagulantes orales altera la determinación de factores dependientes de la vitamina K o las pruebas que de ellos dependan. De la misma manera si el paciente está recibiendo heparina, deberá informarse al laboratorio con la debida oportunidad. (1, 2, 3,4) Un aspecto de la fase preanalítica en hemostasia que requiere particular atención es la toma de la muestra para evaluación de la coagulación. •

Aunque el CLSI recomienda que los tubos con citrato de sodio (tapón azul) se colecten después de los tubos sin aditivo (tapón rojo), existe controversia al respecto. Expertos internacionales en hemostasia no dudan en enfatizar que el primer tubo que debe colectarse siempre es el de tapón azul, fundamentando su recomendación en que la primera porción de sangre recolectada no ha sufrido aún modificaciones que puedan favorecer la coagulación al activarla por extravasación sanguínea. Esta aseveración se ve favorecida por varias razones entre las cuales destacan: a) el hecho de 9



que actualmente a los tubos sin aditivos para obtención de suero (tapón rojo), se les han incorporado sustancias que favorecen la coagulación por o; b) no existen estudios que revelen alteraciones significativas en las pruebas de coagulación de muestras tomadas antes y después de otros diferentes tubos; c) al tomar en primer lugar el tubo con citrato de sodio, este inhibe la coagulación de inmediato al entrar directamente en o con la sangre; y d) el estudio y conocimiento de las teorías actuales de los mecanismos

de

coagulación

sanguínea refuerzan

aún

más

estas

recomendaciones. •

Se recomienda que las muestras para coagulación se tomen dentro del primer minuto de aplicado el torniquete. Si se van a realizar pruebas de fibrinólisis no se debe emplear ligadura para la toma de muestra. De hecho lo más recomendable en cualquier caso sería no utilizar torniquete para la toma de muestras de coagulación. (1,3,4)

ANTICOAGULANTES EN HEMOSTASIA: •

CITRATO DE SODIO: Durante mucho tiempo, las empresas comerciales recomendaban el empleo de citrato de sodio al 3.8% para pruebas de rutina en coagulación. No obstante, debido a dificultades que se han reportado para la obtención de resultados confiables y reproducibles del INR (International Normalized Ratio) (Tasa internacional normalizada en español) para las clínicas de anticoagulación, a partir de 1996 las recomendaciones emitidas a través del CLSI (antes NCCLS) de los EUA se recomienda el empleo de citrato de sodio al 3.2% (105-109 mM/L).

•

La proporción adecuada para la mayoría de las pruebas de coagulación es de 9 partes de sangre por 1 parte de citrato de sodio al 3.2%. Esta relación debe respetarse siempre y cuando el hematocrito (Hto) del paciente sea normal, pero cuando el Hto es mayor del 55% debe ajustarse esta relación usando alguna de las dos fórmulas siguientes:

10



Formula 1 100- Hto

Cit =

Vol

(595-Hto)

Donde: Cit es el volumen de anticoagulante requerido para la anticoagulación apropiada del volumen de sangre Hto es el valor de hematocrito del paciente Vol es el volumen de sangre por anticoagularse

Ejemplo: Hto del paciente 62% Volumen de sangre 5 ml

Cit =

100- 62

x 5 ml = 0.36 ml

(595-62)

Lo que significa que para un volumen final de muestra anticoagulada se requieren 0.36 ml de citrato de sodio al 3.2%

Formula 2

Cit = (1.85 x 10-3) (100- Hto) Vol Donde:

11



Cit es el volumen de anticoagulante requerido para la anticoagulación apropiada del volumen de sangre Hto es el valor de hematocrito del paciente Vol es el volumen de sangre por anticoagularse Ejemplo: Hto del paciente 62% Volumen de sangre 5 ml

Cit = (1.85 x 10-3) (100- 62) 5 ml = 0.36 ml

El resultado es el mismo que en la fórmula anterior, 0.36 ml de anticoagulante para un volumen final de muestra anticoagulada de 5 ml. No hay evidencias que sugieran la necesidad de elevar el volumen de anticoagulante en la anemia, aun cuando el Hto sea menor del 20%.

•

EDTA: A semejanza de lo que sucede con el citrato de sodio, el EDTA en forma disódica o dipotásica se une al calcio plasmático libre; sin embargo, dado que el factor VIII es inestable, ningún tipo de EDTA es adecuado como anticoagulante para la mayoría de las muestras de hemostasia. Además, el EDTA inhibe la conversión del fibrinógeno en fibrina mediada por trombina y se une al reactivo de calcio cuando éste se agrega para iniciar las pruebas basadas en el coágulo. El EDTA se utiliza para la citometría hemática incluyendo el recuento de plaquetas. También puede requerirse para las muestras utilizadas para pruebas de genética molecular, como la prueba para la mutación Leiden del factor V, protrombina 20210A o mutación C677T de la metileno tetrahidrofolato reductasa termolábil.

12



•

HEPARINA: La heparina utilizada de manera habitual para recolección de algunas

muestras

en

bioquímica

clínica,

es

inadecuada

como

anticoagulante para las pruebas de hemostasia porque inhibe a la trombina y los factores XIIa, XIa, Xa y IXa. Algunos autores recomiendan su uso para comprobar recuentos plaquetarios en los que el EDTA pudiera producir pseudotrombocitopenia. (1,2,3,4)

CONSERVACION Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS: Las muestras de sangre citratada se mantienen tapadas para mantener el pH, se recomienda que se transporten de manera vertical, sin mucha agitación y a temperatura ambiente (18-24ºC), llevándolas al área donde van a procesarse lo más pronto posible. Se deben procesar dentro de las primeras 4 horas. (2,3,4) Para pruebas de escrutinio NO se recomienda refrigerar las muestras, ya que se sabe que esto activa al factor VII acortando los resultados de las pruebas básicas como tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa), haciendo poco confiables los resultados de estas pruebas. Mucho se ha enfatizado en la temperatura y el tiempo de conservación. Si las muestras no van a procesarse dentro de las primeras 4 o 6 horas tras la extracción, se recomienda congelar el plasma a -20ºC hasta su procesamiento. La conservación prolongada a temperatura ambiente conlleva a una inactivación parcial de los factores V y VIII, mientras que la refrigeración prolongada activa al factor VII y a las plaquetas de modo que el efecto del frío sobre las muestras para TP y TTPa es dudoso. Una recomendación con los nuevos equipos automatizados para coagulación es centrifugar la muestra y conservarla tapada hasta el momento en que será procesada. Algunos modelos actuales no requieren que se quite el tapón del tubo para procesar el plasma después de la centrifugación. La centrifugación recomendada es de 1500g por al menos 15 minutos a temperatura ambiente, para obtener plasma pobre en plaquetas (plaquetas por 13



debajo de 10,000/µl). sólo en casos que se requieran estudios especiales de las plaquetas se puede obtener plasma rico en estas células. Se debe centrifugar la muestra durante 10 minutos a 200g, se separa inmediatamente el plasma abundante en plaquetas y colocarse en un tubo de plástico tapándolo de inmediato. Este plasma puede conservarse hasta por 3 horas a temperatura ambiente. (1,2,3,4)

OTRAS CONSIDERACIONES SOBRE LAS CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA:

En términos generales se dice que para la mayoría de las pruebas de laboratorio puede interferir la hemólisis, la ictericia y la lipemia. Para pruebas de coagulación de rutina si el método de detección es coagulométrico por lo general la lipemia y la ictericia no afectan la determinación. Siempre debe considerarse que las muestras de pacientes con daño hepático generalmente son ictéricas, puesto que los factores de coagulación proteínicos sanguíneos son de síntesis hepática y que los factores dependientes de vitamina K son gammacarboxilados en el hígado, por lo que no debe extrañarse que las muestras ictéricas presenten resultados prolongados en las pruebas de escrutinio y cuantificaciones de factores aislados disminuidas. No es recomendable procesar muestras hemolisadas. (2,3)

CUESTIONARIO 1. Menciona las ventajas y desventajas del EDTA como anticoagulante en la evaluación de la Hemostasia por laboratorio 2. Al tomar una muestra de sangre para pruebas de coagulación usando citrato de sodio como anticoagulante, ¿podría usarse esta misma muestra para realizar la citometría hemática? Explica tu criterio al respecto. 14



3. Menciona tu opinión respecto al orden de drenado de los tubos con citrato de sodio como anticoagulante cuando se toman diferentes tubos en una misma punción. 4. Explica en que condiciones de conservación debe mantenerse la muestra para pruebas de coagulación hasta el momento de ser analizada.

BIBLIOGRAFIA 1. Mackenzie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. México.

Manual

Moderno

2. Rodak, B. (2004). HEMATOLOGIA FUNDAMENTOS Y METODOS. España. Médica Panamericana.

3. Ruiz ChOA, Girón RV, Moreno HM, García GE, Ortiz ChLA. Conversando sobre Coagulación y Hemostasia. NOTICONAQUIC, 2009; 45:38-42.

4. Vives, A. y. (2002). MANUAL DE TECNICAS EN HEMATOLOGIA. España. Masson. Serie Manuales Espiral.

5. Williams, W. e. (2005). HEMATOLOGIA. España. Marbán.

15



PRACTICA 2 PRUEBA DE FRAGILIDAD CAPILAR (RUMPLE-LEEDE, DEL TORNIQUETE) FUNDAMENTO. La prueba del torniquete consiste en aplicar un manguillo de presión en el brazo y observar en un tiempo determinado la aparición de petequias en el antebrazo, por debajo del sitio de la presión. El número de petequias obtenido (extravasación sanguínea) está relacionado a la presión capilar alterada y a la fragilidad capilar. La fragilidad capilar depende del estado de elasticidad de la pared capilar y en menor medida de la función de las plaquetas. (1) OBJETIVOS • Comprender el fundamento de la técnica • Ejecutar correctamente el procedimiento. • Evaluar la interpretación clínica de la prueba del Torniquete. EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS Material por equipo de 4 alumnos: •

4 Reglas de plástico

Material biológico, equipo y reactivos por grupo: • Esfigmomanómetro y estetoscopio •

Cronómetro

PROCEDIMIENTO La técnica recibe varios sinónimos y ligeras variaciones aunque el fundamento es el mismo. Se le ha llamado prueba de Rumple-Leede, prueba de fragilidad capilar o prueba del Torniquete. Con ella se pretende valorar la fragilidad de los capilares sanguíneos

aplicando presión en el brazo y observando la

probable aparición de petequias después de un tiempo determinado. (1) 16



1. Se mide la presión sanguínea por la técnica convencional, con el paciente sentado cómodamente. Se suman las presiones sistólica y diastólica dividiendo entre dos el resultado para obtener la presión media. (Por ejemplo 120/80 mmHg, la media sería 100 mmHg) 2. Se insufla el esfigmomanómetro ahora a la presión media, (ejemplo 100 mmHg) manteniéndola durante 5 minutos. 3. Transcurrido ese tiempo, retirar el esfigmomanómetro y esperar 5 minutos. 4. Examinar el antebrazo buscando la aparición de petequias. En caso de que éstas se presenten buscar una zona donde sean más abundantes, trazando un círculo de 5 cm de diámetro, contando las petequias dentro del mismo. VALORES DE REFERENCIA Hasta 10 petequias dentro de un círculo de 5 cm, o 5 petequias en un círculo de 3 cm en la superficie volar del antebrazo.

INTERPRETACION DE RESULTADOS Aunque la fragilidad vascular no es un parámetro fácilmente medible por laboratorio, la prueba de Rumple-Leede es la que se ha usado durante muchos años para este objetivo y algunos clínicos y autores la consideran obsoleta. La observación microscópica de los vasos de la piel, durante la ejecución del ensayo en laboratorios de investigación, ha demostrado que las petequias se originan por hemorragia en el extremo arteriolar del asa capilar. Esta prueba no agrega mayor información que la obtenida por la historia clínica y el examen físico.(2) La fragilidad capilar tiene un valor dudoso en la evaluación clínica de un paciente con alteración hemorrágica. Se ha reportado que como mínimo, un 8% de los individuos normales tienen fragilidad capilar aumentada, y muchos de los que presentan trombocitopenia acentuada tienen una fragilidad capilar normal. (3)

17



A continuación se enlistan algunos trastornos del sistema vascular en los que la prueba puede resultar positiva Trastornos del sistema vascular. (1) Hereditario • Telangiectasia hereditaria • Síndrome de Ehlers-Danlos Adquiridos Subendotelio anormal • Púrpura senil • Síndrome de Cushing y terapéutica con corticosteroides • Escorbuto • Amiloidosis Endotelio anormal •

Púrpura alérgica

•

Infecciones

•

Medicamentos

•

Púrpura vascular simple

CUESTIONARIO 1. Investiga si existen otras técnicas para evaluar la fragilidad capilar y cual es su utilidad clínica. 2. Menciona una enfermedad hereditaria y otra adquirida del sistema vascular explicando los mecanismos de cada trastorno.

BIBLIOGRAFIA. 1.

Mc Kenzie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno.p-

423,424 2. Steve Kitchen, A. M. (2008). DIAGNOSTICO DE LA HEMOFILIA Y OTROS TRANSTORNOS DE LA COAGULACION. EL COMITE DE CIENCIAS DEL LABORATORIO DE LA FEDERACION MUNDIAL DE HEMOFILIA.p-429,430. 3. Williams, W. e. (2005). HEMATOLOGIA. España. Marbán. P-1136-113 18



PRACTICA 3 RECUENTO DE PLAQUETAS. FUNDAMENTO. Las plaquetas son células sanguíneas cuya función consiste

en taponar

rápidamente cualquier lesión del endotelio vascular mediante la formación de acumulos plaquetarios capaces de tapar estas lesiones así como también favorecer los mecanismos de activación de las otras fases de la hemostasia. La sangre anticoagulada con EDTA, se mezcla con un diluyente (oxalato de amonio al 1%) que causa la lisis de los eritrocitos para evitar interferencia, haciendo más sencilla la observación y conteo de plaquetas en la cámara de Neubauer. Asimismo puede realizarse recuento de leucocitos con esta misma preparación. OBJETIVOS • Describir el fundamento del método. • Aprender y aplicar correctamente la técnica y su procedimiento. • Interpretar clínicamente el recuento de plaquetas. EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS Material por equipo de 4 alumnos: • 4 Hemocitómetro (Cámara de Neubauer). • 4 Microscopio óptico. • 4 Contador de células. • 4 Tubo de 12 X 75 • 4 Caja petri. • 4 Papel filtro. • 4 Pipetas Pasteur • 1 Gradilla 19



Material biológico, equipo y reactivos por grupo: • Sangre venosa obtenida con EDTA como anticoagulante • Líquido diluyente: Oxalato de amonio al 1%. (Reactivo No.1) • Pipetas automáticas de 20 µl y de 200 µl • Mezclador mecánico PROCEDIMIENTO Aplicaremos el método manual, con lo que se pretende que el alumno pueda observar

el proceso desde la obtención de

sangre, la hemólisis de los

eritrocitos, y la observación y cuantificación de las plaquetas en el hemocitómetro. 1. Pipetear 380 µl de oxalato de amonio al 1% en un tubo de ensayo. 2. Añadir 20 µl de sangre previamente homogeneizada. Con esto se consigue la dilución 1:20 de la muestra. 3. Mezclar durante al menos 5 minutos, con el agitador mecánico. 4. Llenar inmediatamente el hemocitómetro mediante una pipeta Pasteur o con la misma pipeta automática. 5. La cámara se llena por acción capilar, de forma que el flujo del líquido sea rápido y suave. Se carga completamente, cuidando que la dilución no se desborde. Es recomendable humedecer ligeramente los bordes de la cámara antes de colocar el cubreobjetos para garantizar que éste quede fijo. 6. Colocar el hemocitómetro en una caja petri la cual contendrá en la base papel filtro ligeramente húmedo, con el fin de evitar la evaporación. 7. Dejar reposar durante 20 minutos, para que las plaquetas se precipiten. 8. Contar las plaquetas al microscopio con objetivo de 40 X, en 5 cuadros de la cuadrícula central.

Es ampliamente recomendable iniciar el 20



enfoque al microscopio con el objetivo de menor aumento (4x o 10x), para ubicar la cuadrícula y la zona de conteo. Las plaquetas se observan como

cuerpos

ovoides

muy

pequeños,

refringentes

al

mover

suavemente el tornillo micrométrico. Para ubicar la cuadrícula con el microscopio se recomienda enfocar primero con el objetivo de menor aumento. Ver imágenes siguientes: Objetivo 4X

Objetivo 10X

2

Cuadrícula completa (9mm ) mm)

Objetivo 40X

2

(b) cuadrado central (1mm )

(c) cuadradito (0.2 x 0.2

21



0.25

1 0.2 0.05

3

1 1 Profundidad 0.1 mm

0.010

Cámara Neubauer

0.005

0.2

Todas las medidas en mm

La cámara de Neubauer consta de 9 mm cuadrados, (3x3 mm). Los cuadrados grandes de las cuatro esquinas, (de 1 mm2 cada uno) se dividen a su vez en 16 cuadraditos pequeños (0.25x0.25 mm) y se utilizan para el recuento de leucocitos. El cuadrado grande del centro de la cámara (1mm2) está dividido en 25 cuadraditos (0.2 x 0.2 mm c/u). El recuento de plaquetas se realiza en 5 de estos 25 cuadraditos, los que corresponden a las cuatro esquinitas y el centro. A su vez cada uno de estos cuadraditos se subdivide en 16 pequeños cuadraditos para facilitar el conteo. (5)

22



Las recomendaciones de la OMS para el conteo de células en cámara de Neubauer dicen que cuando un elemento celular se encuentra por debajo de una línea divisoria de la cuadrícula el criterio que se aplica es el siguiente: Las células que se encuentren en las líneas de arriba y/o a la izquierda SI se incluyen en la cuenta de ese cuadrado (círculos grises en la imagen), mientras que aquellas que estén en las líneas de abajo y/o a la derecha NO se deben contar para ese cuadrado (circulos blancos en la imagen). (5)

9. Realizar los cálculos. Plaquetas/mm3=

plaquetas contadas x factor de dilución (20) Cuadraditos usados (5) X Volumen de cuadro (0.004)

Ejemplo: Si en la cámara se contaron 215 plaquetas, entonces 215 X 20 = 4300 = 215,000 5 X 0.004 0.02 ó 215 X

= 20 = 215 X 20 5 X 0.004 0.02 215 x 1000 = 215,000

Resultado =

215,000 Plaquetas/mm3 23



VALORES DE REFERENCIA Plaquetas/ mm3= 150,000 a 450 000/µl.

INTERPRETACION DE RESULTADOS El hallazgo de un número de plaquetas aumentado por encima de los valores de referencia se denomina trombocitosis y su disminución se llama trombocitopenia o plaquetopenia.

PRINCIPALES CAUSAS DE TROMBOCITOSIS

Mecanismo primario Trombocitemia esencial Leucemia Mieloide crónica Mielofibrosis idiopática ( en su etapa inicial) Policitemia vera Síndromes

Mielodisplásicos

(

Síndrome

5q-

y

anemia

refractaria

sideroblástica) Leucemia megacariocítica aguda Síndrome mieloproliferativo asociado a síndrome de Down

Mecanismos secundarios Infecciones Inflamaciones crónicas Hemorragia Traumatismos y cirugía extensa Enfermedades malignas Ferropenia y anemia Ferropénica Recuperación en el tratamiento del alcoholismo crónico Tratamiento de una anemia megaloblástica Anemia hemolítica intensa istración de adrenalina 24



istración de alcaloides de la vinca Prematuridad y déficit de vitamina E Hiperostosis cortical infantil

PRINCIPALES CAUSAS DE TROMBOCITOPENIA Disminución de la producción de plaquetas Congénitas • Anomalía de May-Hegglin • Síndrome de Bernard-Soulier • Síndrome de Epstein-Barr (Trombocitopenia, sordera e insuficiencia renal) • Otras tombocitopenias congénitas con o sin megatrombocitos • Hipoplasia megacariocítica • Anemia de Fanconi Adquiridas • Efectos de medicamentos • Mielodisplasias • Ferropenia intensa • Infección por Parvovirus B19 ( Infrecuente) • istración de Tiazida • Tratamiento con interferón • Hemoglobinuria paroxística nocturna • Trombocitopenia amegacariocítica adquirida Aumento de la destrucción periférica de plaquetas Mecanismos inmunitarios Congénito • Trombocitopenia aloinmune del recién nacido • Trombocitopenia inmune pasiva del recién nacido • Hipersensibilidad materna medicamentosa Adquirido • Mecanismo autoinmune • Púrpura trombocitopénica autoinmune primaria 25



• Púrpura trombocitopénica autoinmune asociada al lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, LLC, Linfomas y enfermedad de Hodgkin, Sarcoidosis • Trombocitopenia inmunomedicamentosa •

Trombocitopenia postinfeciosa (rubéola, virus y vacunas)

• Trombocitopenia asociada a virus de la inmunodeficiencia humana • Púrpura trombocitopénica postransfusional • Púrpura anafiláctica Mecanismos no inmunitarios Congénito • Síndrome de Schulman-Upshaw Adquirido •

Coagulación intravascular diseminada

•

Púrpura trombótica trombocitopènica

•

Infecciones virales

Multifactorial Congénito • Síndrome de Wiskott-Aldrich • Síndrome de las plaquetas grises • Anomalía de Chediak-Higashi • Disgenesia trombocitopènica cíclica • Macrotrombocitosis mediterránea Adquirido • Alcoholismo • Heparina • Enfermedad de Graves

Actualmente también se cuenta con equipos automatizados para el recuento de plaquetas, los cuales son de gran apoyo en laboratorio, pues debidamente utilizados brindan además de rapidez, exactitud y precisión.(4) Es necesario correlacionar la cuenta de plaquetas con un frotis de sangre periférica, se observarán las características morfológicas de las plaquetas y se 26



anotará la presencia de formas grandes, agranulares u otras anormalidades morfológicas de las plaquetas (2) La sangre venosa para el recuento de plaquetas debe ser obtenida con EDTA; sin embargo con algunos sistemas automatizados se ha reportado algunos casos de trombocitopenia relacionada al EDTA, por lo tanto en aquellos casos que se sospeche de esta causa debe emplearse heparina o citrato de sodio como anticoagulante. (1)

CUESTIONARIO 1. Investiga otra fórmula para calcular el número de plaquetas con esta misma técnica 2. Investiga porque existe trombocitosis en las inflamaciones crónicas y por la istración de adrenalina 3. ¿Cuáles

son

las

recomendaciones

a

seguir

en

casos

de

pseudotrombocitopenia asociada a anticoagulantes?

BIBLIOGRAFIA. 1. Martinez Murillo Carlos, Q. G. (2001). MANUAL DE HEMOSTASIA Y TROMBOSIS. México,D.F.: Prado.p-94 2. Mc Kenczie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno.p-381 3. Steve Kitchen, A. M. (2008). DIAGNOSTICO DE LA HEMOFILIA Y OTROS TRANSTORNOS DE LA COAGULACION. EL COMITE DE CIENCIAS DEL LABORATORIO DE LA FEDERACION MUNDIAL DE HEMOFILIA.p-27a31 4.

Vives Corrons Joan Lluis, A. b. (2006). MANUAL DE TECNICAS DE

LABORATORIO EN HEMATOLOGIA. Barcelona, España: MASSON, S.A. p620,621 5.

Rodak F. Bernardette (2004) HEMATOLOGIA, FUNDAMENTOS Y

APLICACIONES CLINICAS. Buenos Aires, Argentina. Medica Panamericana p157,158 27



PRACTICA 4 EVALUACION CUALITATIVA DE LAS PLAQUETAS

Aunque la trombocitopenia es la causa más frecuente de hemorragia por trastornos plaquetarios, en ocasiones es necesario investigar a fondo la funcionalidad de las plaquetas. En la práctica común de laboratorio, se realiza el recuento de plaquetas y la revisión del extendido sanguíneo como las pruebas básicas en el estudio de la fase plaquetaria de la hemostasia, antes de comenzar los análisis de la función plaquetaria, pruebas que a menudo resultan costosas y complejas. (2) Las

anormalidades cualitativas de las plaquetas se sospechan sólo

cuando hay síntomas hemorrágicos sistémicos como contusiones fáciles, petequias, púrpura o epistaxis y el recuento de plaquetas está dentro o cerca de los valores de referencia. Si bien son raros los trastornos hereditarios de la función plaquetaria, los trastornos adquiridos asociados con hemorragia y trombosis, son más comunes y se asocian con hepatopatías, enfermedad renal, trastornos mieloproliferativos, síndromes mielodisplásicos, mieloma, trastornos autoinmunes, anemias y tratamiento con fármacos. (2,4) La morfología plaquetaria a menudo es indicio de algún trastorno, por ejemplo el Síndrome de Bernard Soulier se asocia con trombocitopenia leve y además grandes plaquetas grises. Estas ultimas pueden indicar un intercambio plaquetario rápido, como en la púrpura trombocitopénica

inmune o en la

púrpura trombocitopénica trombótica. Las plaquetas gigantes o con forma bizarra se observan en trastornos mieloproliferativos, leucemia aguda y síndromes mielodisplásicos. Los trastornos que afectan la función plaquetaria se han clasificado en hereditarios y adquiridos. Los primeros son primarios y se deben a alteraciones a nivel ultraestructural de las plaquetas, defectos moleculares que afectan la funcionalidad celular. Los adquiridos generalmente se asocian a otros 28



trastornos que alteran de manera secundaria el correcto funcionamiento plaquetario (2, 4,1) TRASTORNOS HEREDITARIOS DE LA FUNCIÓN PLAQUETARIA

(5)

1.- Alteraciones de glicoproteínas (Gp) Glicoproteína IIb/IIIa (CD41/CD61): Trombastenia de Glanzmann Glicoproteína Ib (CD42b,c), IX (CD42a) y V: Síndrome de Bernard Soulier Glicoproteína Ib (CD42b,c): Enfermedad Pseudo Von Willebrand de tipo plaquetario Otras: Gp Ia/IIa; Gp IV; Gp VI 2.- Interacciones anormales membrana- citoesqueleto Síndrome de Wiskott- Aldrich (proteína WASP) 3.- Alteraciones de los gránulos plaquetarios Deficiencia del depósito de almacenamiento delta Deficiencia del depósito de almacenamiento alfa delta Síndrome de las plaquetas grises, deficiencia del depósito de almacenamiento alfa Enfermedad plaquetaria de Quebec 4.- Alteraciones de la actividad coagulante plaquetaria 5.- Alteraciones de la señal de transducción y secreción Defectos en los receptores de agonistas de plaquetas o en la señal de transducción específica de agonistas Defectos en el metabolismo del ácido araquidónico y en la producción de tromboxano Defectos en la fosfolipasa C, Galfaq, movilización de calcio y respuesta al calcio

TRASTORNOS PLAQUETARIOS CUALITATIVOS ADQUIRIDOS

(5)

1.- Trastornos sistémicos asociados con función plaquetaria anormal Uremia Anticuerpos antiplaquetas By cardiopulmonar Enfermedad hepática Coagulación intravascular diseminada 2.- Trastornos hematológicos asociados con función plaquetaria anormal Trastornos mieloproliferativos crónicos Síndromes mielodisplásicos y leucemias Disproteinemias Enfermedad de von Willebrand adquirida 3.- Fármacos que afectan la función plaquetaria Fármacos antiinflamatorios no esteroideos Antibióticos, Tienopiridinas (ticlopidina y clopidogrel) Antagonistas del reaptos Gp IIb/IIIa Fármacos que aumentan el AMP cíclico plaquetario

29



Anticoagulantes y agentes fibrinolíticos Fármacos cardiovasculares Expansores de volumen, Agentes psicotrópicos y anestésicos Fármacos oncológicos Alimentos y aditivos de alimentos

Las plaquetas funcionales se adhieren al colágeno subendotelial, se agregan entre si y segregan los contenidos de sus gránulos alfa, lisosomas y cuerpos densos. La adhesión normal requiere membranas plaquetarias intactas y factor de von Willebrand. La agregación normal precisa que las membranas de las plaquetas estén intactas, el nivel de fibrinógeno esté normal y las agregaciones provenientes de los organelos plaquetarios también estén normales. Los fenómenos de adhesión, agregación y segregación plaquetarias pueden ser evaluadas por laboratorio aunque estás pruebas resultan costosas y muy sofisticadas, por lo que su realización esta limitada únicamente a algunos laboratorios muy contados. Aunque estas pruebas resultan muy variadas y existen diversas metodologías, detallaremos aquí sólo los aspectos generales más importantes de ellas. (2,1) VALORACION DE LA ADHESIVIDAD PLAQUETARIA No existen métodos simples que permitan valorar globalmente la adhesión plaquetaria al subendotelio. La cámara de Baumgartner y otras similares están más bien destinadas a trabajos de investigación debido a su relativa complejidad. Por otra parte, los sistemas para medir “adhesividad” a superficies extrañas (sistemas de perfusión a través de columnas de esferas de vidrio) están influidos tanto por la adhesión como por la agregación e incluso la formación de trombina, lo que les resta especificidad, si bien son capaces de señalar, sin precisar cual, la existencia de alguna anomalía.

(4, 1,3)

VALORACION DE LA AGREGACION PLAQUETARIA El estudio de la agregometría plaquetaria se ha hecho técnicamente accesible gracias al moderno instrumental y a la aparición de reactivos de uso sencillo. Un agregómetro es un instrumento diseñado para medir, como lo indica su nombre, la agregación plaquetaria, en una suspensión de sangre 30



entera citratada o plasma rico en plaquetas (PRP). La muestra se recolecta y maneja de acuerdo con los protocolos estándares de laboratorio y se mantiene a 18-24ºC hasta comenzar la prueba. Las muestras para agregometría se dejan reposar 30 minutos después de la extracción para que las plaquetas recuperen su capacidad de respuesta y deben probarse dentro de las tres horas siguientes para evitar el deterioro de los procoagulantes plasmáticos y plaquetarios

lábiles.

Después

de

que

el

equipo

ha

sido

calibrado

electrónicamente según las instrucciones del fabricante, se pipetean las muestras en las cubetas compatibles con el equipo y se colocan las barras agitadoras recubiertas con plástico, permitiendo que las muestras se atemperen a 37ºC durante 10 minutos en las cubetas de incubación antes de realizar la prueba. Se transfiere la primera cubeta, que contiene la muestra y la barra agitadora, al lugar de la reacción del equipo y se pone en funcionamiento el dispositivo de agitación y el dispositivo de registro, que suele ser una computadora. El dispositivo de agitación agita la barra a 800 – 1,200 rpm lo que mantiene las plaquetas en suspensión. Después de unos pocos segundos, se adiciona en forma enérgica un agonista (agente agregante) a la muestra para comenzar la reacción. La agregación se completa en 6 a 10 minutos. Se repite entonces la prueba con la siguiente cubeta con otro agonista. Cada cubeta es atravesada por un haz de luz y cuando, tras introducir el agonista, se produce la agregación, aumenta la transmisión de luz a través de la cubeta y su intensidad se recoge gráficamente. Los agonistas más utilizados en estas pruebas son: ADP, colágeno, ácido araquidónico y ristocetina además de trombina y adrenalina, a concentraciones y volúmenes pequeños de manera que el efecto de la dilución en el sistema de reacción sea mínimo. (1, 2, 4,5) La interpretación debe hacerse para cada agente agregante de manera particular pues la vía de activación plaquetaria que estimula es diferente y por ende el resultado indicará diversos trastornos plaquetarios. La tabla siguiente concentra lo anterior.

31



AGONISTAS

DE

LA

AGREGOMETRÍA

PLAQUETARIA,

CONCENTRACIONES DE LA REACCION FINAL Y LAS VÍAS DE LA ACTIVACIÓN PLAQUETARIA QUE ESTIMULAN (2, 4) Agonista

Concentración

final Vía estimulada

recomendada Trombina

0.3 U/ml

Integrina GPIb/IX

ADP

5-10 µM/L

Receptores

ADP

y

vía

de

ciclooxigenasa o proteína G Adrenalina

2-10 µM/L

Receptor de adrenalina y vía de ciclooxigenasa o proteína G

Colágeno

5-10 µg/ml

Receptor de membrana y vía de ciclooxigenasa o proteína G

Ácido araquidónico

1 mM

Vía de ciclooxigenasa

Ristocetina

1 mg/ml

Integrina GPIb/IX y aglutinación con factor de Von Willebrand

CUESTIONARIO 1. Investiga la interpretación de las gráficas de resultados de agregometría plaquetaria con diversos agonistas. 2. ¿Qué metodología alterna y actual puede utilizarse en algunos trastornos de glicoproteínas plaquetarias y como deben interpretarse los resultados? 3. Investiga las vías que sigue el ácido araquidónico en la síntesis de prostaciclinas y de tromboxano A2

BIBLIOGRAFIA 1. Mc Kenzie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. México. Manual Moderno 32



2. Rodak, B. (2004). HEMATOLOGIA FUNDAMENTOS Y METODOS. España. Mèdica Panamericana. 3. Ruiz Arguelles, G. (2003). FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGIA. México. Panamericana. 4. Vives, A. y. (2002). MANUAL DE TECNICAS EN HEMATOLOGIA. España. Masson. Serie Manuales Espiral. 5. Williams, W. e. (2005). HEMATOLOGIA. España. Marbán.

33



PRACTICA 5 TIEMPO DE SANGRADO DE IVY FUNDAMENTO Esta prueba valora la capacidad cualitativa de las plaquetas in vivo y consiste en medir el tiempo que tarda en detenerse la hemorragia inducida por un corte estándar en profundidad y longitud hecho en la piel. La prueba mide el tiempo necesario para obtener un tapón hemostático eficaz, ofreciendo una valoración global y simultánea de los procesos de adhesión, agregación y liberación plaquetarias. (1, 3, 4,5) OBJETIVO • Comprender el fundamento del método. • Ejecutar correctamente la técnica. • Valorar la aplicación clínica del Tiempo de sangrado. EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS. Material por equipo de 4 alumnos: • 4 Dispositivos patrón para el tiempo de hemorragia. (Lanceta comercial específica para esta prueba, no usar cualquier lanceta) • 4 Torundas de algodón con alcohol isopropílico o etanol al 70% • 4 Papel filtro de 1 mm de grosor Material biológico, equipo y reactivos por grupo: • Esfigmomanómetro • Cronómetro PROCEDIMIENTO La técnica original de Duke (1910) que hacía una punción en el lóbulo de la oreja o la yema del dedo de la mano, ha sido descontinuada por resultar poco sensible y menos reproducible. Se recomienda el método manual de Ivy (modificada por Borchgrevink) en el cual se utiliza el esfigmomanómetro aplicando la presión adecuada en una región localizada del antebrazo, provocando una incisión estandarizada en longitud y profundidad a través de 34



una plantilla o dispositivo automático, ha mostrado una alta sensibilidad y reproducibilidad. 1. Se coloca el esfigmomanómetro en el brazo del paciente y se regula a 40 mmHg, manteniéndolo a esta presión a lo largo de toda la prueba. 2. Se limpia la cara anterior del antebrazo, Se coloca el dispositivo de tiempo de hemorragia firmemente contra la piel pero sin oprimir, en una zona poco vascularizada, sin vello y a unos 3-5 cm por debajo del pliegue del codo y paralelo al mismo. 3. Apretar el gatillo de la lanceta 4. Esperar unos segundos y cuando aparezca la primera gota de sangre poner el cronómetro en marcha. 5. La sangre que brota de forma espontánea se va secando con el papel filtro cada 30 segundos, sin tocar la incisión, y se anota el tiempo que tarda en cesar la hemorragia que será el resultado de la prueba. VALORES DE REFERENCIA Tiempo de sangrado de Ivy 6 a 8 minutos. INTERPRETACION DE RESULTADOS Valores superiores de 10 minutos son claramente patológicos. Valores prolongados superiores a 20 minutos se consideran graves. Un resultado anormal debe repetirse, si la hemorragia continúa más de 20 minutos, registrar simplemente que el Tiempo de sangrado es mayor a 20 minutos. La prueba evalúa la llamada hemostasia primaria (fase vascular y principalmente fase plaquetaria) y aunque recientemente ha caído un poco en desuso, su utilidad clínica como prueba de tamizaje es muy importante, pues permite valorar los componentes implicados en esta fase de la hemostasia, como son la cantidad y funcionalidad de las plaquetas, la estructura histológica de los vasos sanguíneos y al factor de Von Willebrand, por lo que realizada e interpretada de manera adecuada ofrece gran apoyo para el diagnóstico inicial de diversas patologías. Se encuentran tiempo de sangrados prolongados en trombocitopenias, trombocitopatías, Trombastenia de Glanzman, Enfermedad de von Willebrand, síndrome de Bernard-Soulier, uremias, mielomas, macroglobulinemias, déficit de fibrinógeno. La ingesta de ácido acetilsalicílico (AAS) puede inducir alteraciones leves en los resultados en personas normales, pero aumentar considerablemente el tiempo de sangrado de forma secundaria a cualquier defecto evaluado por esta 35



prueba. Si es posible debe evitarse el consumo de AAS durante los 7 días previos a la prueba. (1, 2, 3, 4,5) CUESTIONARIO 1. Describe por lo menos 5 trastornos que pueden alterar el resultado del tiempo de sangrado de Ivy, incluyendo tanto hereditarios como adquiridos. 2. Menciona pruebas adicionales para intentar establecer el diagnóstico de los trastornos que contestes en la pregunta anterior. BIBLIOGRAFIA 1. Korvich Lucia, S. A. (1990). MANUAL DE HEMOSTASIA Y

TROMBOSIS. Argentina: grupo (CLAHT).P-425. 2. Martinez Murillo Carlos, Q. G. (2001). MANUAL DE HEMOSTASIA Y

TROMBOSIS. México,D.F.: Prado. P-93,94. 3. Mc Kenczie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno. P381 4. Steve Kitchen, A. M. (2008). DIAGNOSTICO DE LA HEMOFILIA Y

OTROS TRANSTORNOS DE LA COAGULACION. EL COMITE DE CIENCIAS DEL LABORATORIO DE LA FEDERACION MUNDIAL DE HEMOFILIA. P-32,33. 5. Vives, A. y. (2002). MANUAL DE TECNICAS EN HEMATOLOGIA. Masson. Serie Manuales Espiral. P-618.

36



PRACTICA 6 RETRACCION DEL COAGULO FUNDAMENTO La retracción del coágulo después de incubar una muestra de sangre a la temperatura corporal durante el tiempo suficiente para garantizar su total coagulación, puede dar información sobre el número de plaquetas en la sangre y su funcionamiento. Cuando el trombo se retrae, el suero es liberado y se puede medir el grado de retracción del coágulo. (4) OBJETIVO • Comprender el fundamento del método. • Ejecutar correctamente la técnica. • Valorar la aplicación clínica de retracción del coágulo. EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS. Material por equipo de 4 alumnos: •

4 Tubos de ensayo de cristal de 13 X 100 mm ó tubos de centrífuga graduados de 10 ml

• 4 Aplicadores de madera sin algodón o alambres de cobre de 15 cm torcido en espiral Material biológico, equipo y reactivos por grupo: • Baño María a 37oC. • Sangre obtenida al momento sin anticoagulante. PROCEDIMIENTO El método es únicamente manual. Se mide el volumen de suero remanente después de incubar la sangre recién extraída durante una hora tras la extracción del coagulo formado en este lapso. La técnica puede manejarse con tubo convencional 13x100 o con tubo de centrífuga graduado a 10 ml. Para fijar el coágulo y retirarlo fácilmente del tubo se utilizan aplicadores de madera o un alambre de cobre en espiral. (3) 1. Recolectar con jeringa y aguja estériles 5 ml de sangre en un tubo de ensayo de cristal de 13 X 100 mm o 10 ml (aforados) para el tubo graduado. 37



2. Colocar el tubo a 37oC en Baño María. Introducir dos aplicadores de madera o el alambre de cobre en este momento. Incubar una hora. 3. Examinar visualmente el tubo hasta que aparezca un coágulo firme. 4. Si se usa tubo 13x100 mm, medir la distancia desde la base del tubo al menisco de la muestra. 5. Retirar cuidadosamente el coágulo a través de los aplicadores de madera o el alambre de cobre, desprendiéndolo suavemente y exprimiéndolo ligeramente contra las paredes del tubo, dejando el suero liberado del coágulo en el tubo. 6. Medir la distancia entre la base del tubo y el menisco del suero o leer el afore del suero en el tubo graduado. 7. Anotar como porcentaje en relación con el volumen total de sangre inicial.(4) CALCULOS % DE RETRACCION DEL COAGULO= DISTANCIA DEL SUERO X 100 DISTANCIA TOTAL % DE RETRACCION DEL COAGULO= AFORE DEL SUERO X 100 AFORE TOTAL VALORES DE REFERENCIA Retracción del coágulo más del 40%. INTERPRETACION DE RESULTADOS La retracción del coágulo se basa en la capacidad de contracción de las plaquetas, gracias a estructuras celulares tales como los sistemas de microtúbulos y microfilamentos, formados principalmente por complejos de actina y miosina, la proteína contráctil trombastenina y ATP plaquetario. (2) Esta prueba es anormal en trombocitopenias, Trombastenia de Glanzmann, en ciertas enfermedades sistémicas e insuficiencia renal aguda y crónica. Esta prueba es influenciada por los niveles de fibrinógeno y por el valor de hematocrito del paciente. (3,4) NOTA. Los tubos y las varillas de madera y/o cobre deben estar totalmente limpios con el fin de evitar la adhesión del coágulo al tubo.

38



Se debe retirar el coágulo cuidadosa y suavemente, para evitar que se comprima con la posterior liberación del suero. CUESTIONARIO 1. Explica en que consiste el defecto plaquetario que se evalúa en la prueba de retracción del coágulo 2. Explica que otra prueba evalúa de un modo más sensible y específico este defecto. BIBLIOGRAFIA 1. Korvich Lucia, S. A. (1990). MANUAL DE HEMOSTASIA Y

TROMBOSIS. Argentina: grupo (CLAHT).P-430. 2. Martinez Murillo Carlos, Q. G. (2001). MANUAL DE HEMOSTASIA Y

TROMBOSIS. México,D.F.: Prado. P-94. 3. Mc Kenczie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno. P383 4. Steve Kitchen, A. M. (2008). DIAGNOSTICO DE LA HEMOFILIA Y

OTROS TRANSTORNOS DE LA COAGULACION. EL COMITE DE CIENCIAS DEL LABORATORIO DE LA FEDERACION MUNDIAL DE HEMOFILIA. P-91,92

39



PRACTICA 7 TIEMPO DE PROTROMBINA FUNDAMENTO El plasma citratado en presencia de tromboplastina (factor tisular más una mezcla de fosfolípidos) y de cloruro cálcico se coagula a una velocidad dependiente de las actividades de la protrombina (factor II), los factores V, VII, X y el fibrinógeno, siempre que no existan inhibidores de la reacción.(2) Esta prueba refleja la eficacia global

de la llamada “vía extrínseca”. Es

sensible a cambios en los factores V, VII, X y en menor grado para el factor II (protrombina). Es también poco apropiada para detectar cambios en los niveles de fibrinógeno, pero además puede ser anormal si los niveles de fibrinógeno son muy bajos o si esta presente un inhibidor. (1) OBJETIVOS •

•

Describir el fundamento del método Ejecutar correctamente la prueba

y los procedimientos para su

calibración •

Identificar la utilidad clínica de la medición del tiempo de protrombina

EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS Material por equipo de 4 alumnos: •

1 Gradilla

•

10 Tubos de ensayo 10 X 75 mm

•

4 Pipetas Pasteur

•

4 Hojas de papel milimétrico

Material biológico, equipo y reactivos por grupo: •

Centrifuga.

•

Coagulómetro 40



•

Bloque térmico para incubar o baño María a 37oC

•

Cronómetro

•

Pipetas automáticas de 100 µl y 200 µl

•

12 tubos de ensayo de vidrio 10 X 75 mm

•

Plasma citratado del paciente

•

Plasma citratado normal

•

Tromboplastina Cálcica (se recomienda que el Índice de Sensibilidad Internacional –ISI- sea lo más cercano a 1) (REACTIVO 2)

•

Solución salina isotónica (REACTIVO 3)

PROCEDIMIENTO El procedimiento aquí presentado corresponde al Método Manual. Aunque se utilizan en el mundo una gran diversidad de instrumentos para las pruebas de coagulación, muchos centros todavía usan con éxito la técnica de agitación manual del tubo de ensayo. Hay que destacar que aunque se disponga de métodos automáticos, algunas pruebas requieren el uso de la técnica manual, en este manual y con fines didácticos, se presenta la técnica manual para familiarizar al alumno con la observación del coágulo de fibrina, desde el inicio de su formación hasta su consolidación final. En la clínica también se usa el método manual como alternativa práctica, bien sea por incompatibilidad de la muestra o por la propia instrumentación. Como ejemplo de ello mencionaremos las concentraciones muy elevadas de lípidos en plasma, las muestras ictéricas, o aquellas en las que el patrón de formación del coágulo de la muestra sea muy diferente al de las muestras normales, sobre todo cuando la concentración de fibrinógeno esté muy reducida. 1. Preparar dos tubos de 10x75 mm colocando 1 volumen (100 µl) de plasma normal en cada uno. Incubar a 37ºC durante dos minutos. 2. Añadir 2 volúmenes (200 µl) de tromboplastina cálcica previamente atemperada a 37º C. La adición del reactivo debe ser brusca e instantánea poniendo simultáneamente en marcha el cronómetro. 3. Mezclar agitando suavemente el tubo según las recomendaciones. 41



4. Registrar el tiempo de coagulación en segundos y décimas. Tomar como resultado el valor medio de ambos tubos. 5. Repetir el procedimiento para cada muestra de pacientes también por duplicado, anotando el tiempo de coagulación de cada una en segundos y décimas, tomando el promedio de ambas como resultado del paciente. 6. Tanto para el plasma control como para los pacientes, si el tiempo de coagulación entre los dos tubos difiere en más del 10%, se deberá repetir la prueba. (1)

GRAFICO DE CALIBRACIÓN PARA PORCENTAJE DE ACTIVIDAD Aunque la expresión en forma de tantos por ciento de actividad ha sido muy discutida en años recientes por diversos autores y especialistas que argumentan que carece de justificación en una valoración global, en varios centros de trabajo sigue siendo utilizada y solicitada. Para establecer esta forma de expresión, es preciso crear una tabla de correspondencias entre tiempos de coagulación y actividades por ciento

(1).

Para ello debe construirse

una recta de calibración como a continuación se describe: 1. Obtener muestra de sangre anticoagulada con citrato de sodio de 20 personas sanas que no tomen medicación que pueda interferir con los factores y reacciones de la coagulación. Lo ideal es tener un número aproximadamente igual de hombres que de mujeres. El rango de edad recomendable es entre 20 y 50 años. 2. Separar por centrifugación el plasma citratado y mezclar la misma cantidad de cada uno en un recipiente de plástico o vidrio para hacer un pool. 3. Preparar una serie de tubos según la tabla siguiente:

42



TUBO

POOL DE

SOL. SALINA

PORCENTAJE DE

PLASMAS

ISOTONICA

ACTIVIDAD

1

1.0 ml

0.0 ml

100 %

2

0.9 ml

0.1 ml

90 %

3

0.8 ml

0.2 ml

80 %

4

0.7 ml

0.3 ml

70 %

5

0.6 ml

0.4 ml

60 %

6

0.5 ml

0.5 ml

50 %

7

0.4 ml

0.6 ml

40 %

8

0.3 ml

0.7 ml

30 %

9

0.2 ml

0.8 ml

20 %

10

0.1 ml

0.9 ml

10 %

4. Realizar a cada tubo el tiempo de Protrombina por duplicado, la diferencia entre ambos tubos no debe ser superior a 0.5 segundos, en caso contrario se deberá repetir la prueba. 5. Promediar los tiempos obtenidos para cada par de tubos y graficar en papel milimétrico tiempo en segundos contra porcentaje de actividad. (2) Control del tratamiento anticoagulante oral Los resultados se expresarán en forma de “Razón Normalizada Internacional” o mejor aún como Tasa Internacional Normalizada de protrombina (INR por sus siglas en inglés). Este valor representa el cociente que se hubiera obtenido si se hubiera realizado la prueba (TP) con la primera tromboplastina de referencia humana de la Organización Mundial de la Salud (OMS). (1, 5) 43



El cálculo de la INR se obtiene dividiendo el TP del paciente entre el TP del plasma control y requiere además que conozcamos la sensibilidad de nuestra tromboplastina, expresada como ISI (Índice de Sensibilidad Internacional). El ISI compara las distintas tromboplastinas comerciales con una tromboplastina que se usa como control consensuado internacionalmente. Cada preparado de tromboplastina tiene su propio ISI. Conocida ésta, el cálculo se realiza de la siguiente manera: TP paciente/ TP control = IP (Índice de protrombina) INR= IPISI Ejemplo: Si el TP del paciente es 27 seg. y el del control 12 seg., el índice de protrombina será 27/12= 2.25. Si el ISI del reactivo de tromboplastina es 1.15, entonces: INR= 2.251.15 = 2.54 Esta forma de expresión permite comparar resultados de control realizados sensibilidad

en y

diferentes debe

laboratorios

reservarse

para

con el

reactivos control

del

de

distinta

tratamiento

anticoagulante oral, no siendo necesario ni adecuado su uso en los estudios de carácter diagnóstico. La mayoría de los modernos coagulómetros calculan de forma automática el valor de la INR y además las tromboplastinas comerciales suelen aportar en su instructivo, tablas de conversión del TP en segundos en la INR. Todas las tromboplastinas deben hacer referencia al valor de su ISI, teniendo en cuenta que éste puede variar según el método de determinación (manual, mecánico u óptico) (1, 4, 5) VALORES DE REFERENCIA Cada laboratorio debe establecer sus propios valores a través de la preparación del pool de plasmas normales, para ajustarlos a su población, además como se menciona arriba, estos dependen de diversos factores como el método utilizado, la tromboplastina comercial, el ISI, etc. En general para un 44



plasma control comercial el TP oscila entre 12 y 15 segundos. Este valor debe ser igualmente controlado diario. (1, 4,5)

INTERPRETACION El TP es sensible al déficit de los factores VII, X, V y protrombina (II), todos ellos también incluidos en el TTPa excepto el factor VII. La prueba es muy sensible a la hipo o disfibrinogenemia y a cualquier trastorno de la polimerización de la fibrina. Se altera un poco en presencia de heparina, aunque no se recomienda para monitoreo de este anticoagulante. Al combinarse los resultados del TP con el TTPa y el TT pueden obtenerse datos muy valiosos respecto a la deficiencia hereditaria de factores de coagulación o en la evaluación de la gravedad de daño hepático. (1, 2, 4,5) CUESTIONARIO 1. Menciona que factores evalúa el tiempo de protrombina y explica porqué 2. El tiempo de protrombina es considerado la prueba más sensible de los tres tiempos de coagulación. Explica porqué. 3. Investiga sobre las llamadas tromboplastinas recombinantes y sus ventajas sobre las convencionales.

BIBLIOGRAFIA: 1. Vives Corrons Joan Lluis, A. b. (2006). MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO EN HEMATOLOGIA. Barcelona, España: MASSON, S.A. p627,629 2. Steve Kitchen, A. M. (2008). DIAGNOSTICO DE LA HEMOFILIA Y OTROS TRANSTORNOS DE LA COAGULACION. EL COMITE DE CIENCIAS DEL LABORATORIO DE LA FEDERACION MUNDIAL DE HEMOFILIA. P-34,35. 3. Molinari, S. (s.f.). "Banco de sangre" evoluciòn de kits diagnostico. NOTIWIENER No. 16 . p- 4 4. Ruiz Arguelles, G. (2003). FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGIA. México. Panamericana. 45



5. San Miguel, J. e. (2003). CUESTIONES EN HEMATOLOGIA. España. Harcourt.

46



PRACTICA 8 TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPa) FUNDAMENTO El plasma citratado coagula en presencia de fosfolípidos (cefalina activada) y cloruro cálcico a una velocidad dependiente de la actividad de los factores de la llamada “vía intrínseca” XII, XI, IX, VIII, y “vía común”: X, V, protrombina y fibrinógeno (3) si no existe la presencia de inhibidores. Se conoce como cefalina activada al extracto fosfolipídico (tromboplastina parcial, o sea fosfolípidos sin factor tisular) que además contiene un activador de los factores llamados “de o”; la sustancia activadora generalmente es caolín, celite o ácido elágico. (5) OBJETIVO • Comprender el fundamento del método. • Realizar correctamente la técnica. • Identificar activado

la utilidad clínica del tiempo de tromboplastina parcial


1 Gradilla

•


•

4 Pipetas Pasteur

Material biológico, equipo y reactivos por grupo: • Cronómetro • Baño María a 37oC • Centrífuga • Pipeta automática de 100 µl • Plasma citratado del paciente • Tromboplastina parcial activada. (REACTIVO 4) • Solución de cloruro cálcico 25 mmol/L. (REACTIVO 5) 47



• Plasma citratado control preparado (REACTIVO 6)

en el laboratorio o comercial

PROCEDIMIENTO Se presenta la técnica manual para fines didácticos. Todas las muestras se realizan por duplicado. 1. Colocar un tubo con cloruro cálcico y otro tubo con la tromboplastina parcial a 37oC, durante 5 minutos, antes de su utilización, calcular la cantidad necesaria para las pruebas a realizar.( 100 µl por prueba de cada uno) 2. Pipetear un volumen (100 µl) de reactivo de plasma problema en un tubo de ensayo a 37oC. 3. Agregar un volumen (100 µl) de reactivo de tromboplastina parcial (previamente incubada), mezclar e incubar de 2 a 3 minutos. 4. Agregar un volumen (100 µl) de cloruro cálcico 25 mmol/l y echar a andar el cronometro simultáneamente a la adición del reactivo 5. Mezclar agitando suavemente el tubo según las recomendaciones. 6. Al notar la primera señal de aparición del coágulo, parar el cronometro. Anotar el tiempo en segundos. 7. Es necesario realizar simultáneamente la valoración de un plasma control. VALORES DE REFERENCIA Tiempo de Tromboplastina parcial: 25 a 35 segundos Los valores de referencia varían entre los diferentes lugares de acuerdo con la población de pacientes, el tipo de reactivo, el tipo de instrumento automatizado en su caso y el pH y pureza del diluyente usados. El resultado de TTPa se reportará en segundos tanto para el paciente como para el control y se recomienda acompañarlo del cociente paciente/control para una más fácil interpretación, especialmente cuando se destina al control del tratamiento con heparina. Actualmente a nivel mundial, para corregir ligeras desviaciones en el valor del plasma control, se toma el valor del cociente de un mínimo de 50 sujetos sanos, se eliminan los resultados que se hallen fuera de + 2DE, se establece de nuevo la media y se calcula el número por el cual ésta debería multiplicarse para que su valor fuera exactamente 1.00. Este número es el factor por el que 48



deberán multiplicarse todos los resultados que se obtengan, bajo las mismas condiciones de trabajo y de reactivos, para que realmente se adapten a la población atendida en cada laboratorio.

INTERPRETACION DE RESULTADOS El TTPa detecta todas las deficiencias congénitas y adquiridas de los factores XII, XI, IX, VIII, X, V, II y I. Es especialmente dependiente de la concentración de factor VIII (el tiempo es inversamente proporcional al logaritmo de la concentración de dicho factor), de manera que las elevaciones reactivas de factor VIII pueden enmascarar deficiencias moderadas de los otros factores involucrados. Entre los factores cuyo déficit puede prolongar el TTPa se hallan algunos no necesarios para el desarrollo de la coagulación in vivo y cuya anomalía es un simple hallazgo de laboratorio que no comporta riesgo hemorrágico, estos factores son: factor XII, precalicreína y cininógeno de alto peso molecular. El TTPa también se realiza para monitorear los efectos del tratamiento con heparina no fraccionada y detectar los anticoagulantes circulantes como anticoagulante lúpico y anticuerpos anti-factor VIII. Para control de anticoagulante heparina se consideran habitualmente, valores normales los cocientes 1.2 o menores. El margen terapéutico se halla entre los cocientes de 1.5 a 3 dependiendo de la sensibilidad de la cefalina utilizada. CUESTIONARIO 1. Menciona que factores evalúa el tiempo de tromboplastinas parcial y porqué. 2. Explica porque algunos pacientes sin ningún antecedente clínico o subclínico

de

tendencia

hemorragípara

pueden presentar TTPa

prolongado. 3. Explica porque la prueba se denomina tiempo de tromboplastina PARCIAL activada

BIBLIOGRAFIA 1. Korvich Lucia, S. A. (1990). MANUAL DE HEMOSTASIA Y TROMBOSIS. Argentina: grupo (CLAHT).P-425.

49



2. Martinez Murillo Carlos, Q. G. (2001). MANUAL DE HEMOSTASIA Y TROMBOSIS. México,D.F.: Prado. P-93,94. 3. Mc Kenczie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno. P-381 4. Steve Kitchen, A. M. (2008). DIAGNOSTICO DE LA HEMOFILIA Y OTROS TRANSTORNOS DE LA COAGULACION. EL COMITE DE CIENCIAS DEL LABORATORIO DE LA FEDERACION MUNDIAL DE HEMOFILIA. P-32,33. 5. Vives, A. y. (2002). MANUAL DE TECNICAS EN HEMATOLOGIA. Masson. Serie Manuales Espiral. P-618. 6. Rodak, B. (2004). HEMATOLOGIA FUNDAMENTOS Y METODOS. España. Mèdica Panamericana.

50



PRACTICA 9 PRUEBAS DE COAGULACION CON MEZCLA DE PLASMAS Y PRUEBAS DE SUSTITUCION FUNDAMENTO Cuando el TP o el TTPa o ambos son anormales, pueden practicarse pruebas adicionales para identificar la anormalidad específica. Los estudios con mezclas se practican para diferenciar entre la deficiencia de un factor y la presencia de un inhibidor circulante. La prueba de coagulación con resultados anormales se repite con el uso de varias diluciones distintas del plasma del paciente y de plasma mezclado normal. La deficiencia de un factor se indica por la corrección del resultado de la prueba prolongada con el plasma mezclado normal, es decir éste último aporta o suple el factor deficiente. La presencia de un inhibidor circulante se indica por la falta de corrección de la prueba prolongada con el plasma mezclado normal y el inhibidor circulante también inhibe los factores de coagulación del plasma normal.(1) La detección de un inhibidor circulante debe ir seguida por una prueba específica para identificar y cuantificar el inhibidor. Si se detecta deficiencia de un factor, deben practicarse estudios de sustitución y de análisis de factor para identificar y cuantificar la actividad del factor específico. (3,4) OBJETIVO • Comprender el fundamento de las pruebas de mezcla de plasmas • Ejecutar correctamente las técnicas • Valorar la utilidad clínica del uso de mezcla de plasmas. EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS Material por equipo de 4 alumnos: • 1 Gradilla • 48 Pipetas Pasteur • 45 Tubos de ensayo 12 X 75 Material biológico, equipo y reactivos por grupo:

• 6 Tubos de ensayo 13 X 100 51



• 2 tubos de ensayo de 15 X 150 • Cronómetro • Baño María a 37oC • Plasma citratado del paciente. • Plasma normal • Plasma envejecido • Plasma absorbido con sulfato de bario • Suero normal • Pipetas automáticas de 100µl y 200µl • Tromboplastina cálcica (se recomienda que el Índice de Sensibilidad Internacional –ISI- sea lo más cercano a 1) (REACTIVO 2) • Solución salina isotónica (REACTIVO 3 • Tromboplastina parcial activada. (REACTIVO 4) • Solución de cloruro cálcico 25 mmol/L. (REACTIVO 5) • Sulfato de Bario (REACTIVO 7) o Hidróxido de aluminio (REACTIVO 8)

PROCEDIMIENTOS PARA PREPARACION DE PLASMA NORMAL Y REACTIVOS DE SUSTITUCION: a. PLASMA NORMAL El plasma fresco normal contiene casi todos los factores de la coagulación (con excepción del factor tisular que no está normalmente en la sangre y el calcio removido por el anticoagulante) y se mezcla con el plasma del paciente para detectar en principio la causa de la anormalidad en la prueba de coagulación del paciente. Si la causa es deficiencia de un factor, la prueba de coagulación se corrige pues el plasma normal aporta el factor deficiente y será necesario continuar con pruebas de sustitución para definir cual es ese factor disminuido. 52



Si la prueba no se corrige, el responsable de la anormalidad de la prueba es un inhibidor circulante que ejerce su acción incluso sobre los factores del plasma normal. (1,3,4) Para obtener plasma normal se procede así: 1. Obtener por punción venosa y sistema al vacío, sangre anticoagulada con citrato de sodio y sin anticoagulante de por lo menos 6 donadores sanos. 2. Centrifugar las muestras obtenidas con citrato de sodio durante 5 minutos a 2500 rpm 3. Separar 2 ml de plasma de cada tubo colocándolos en un tubo de 15 X 150, mezclar suavemente para homogeneizar. 4. Una vez coagulada la muestra obtenida en los tubos sin aditivo, centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm, separar 2 ml de suero de cada uno en un tubo 15 X150 mm. Agitar suavemente para homogeneizar. 5. Realizar TP y TTPa a la mezcla de plasmas. Ambos deben resultar normales.

REACTIVOS DE SUSTITUCION Como la presencia de una prueba de coagulación corregida con la mezcla de plasma del paciente con plasma normal, indica DEFICIENCIA DE FACTOR, se debe proseguir con nuevas mezclas pero ahora con los llamados reactivos de sustitución: Plasma envejecido, plasma adsorbido y suero normal. Estas nuevas mezclas solo deberán realizarse si hubo CORRECCION en la mezcla inicial plasma paciente/plasma normal. En caso contrario, si la prueba no corrigió, (presencia de inhibidor) no procede el uso de reactivos de sustitución. (1,3)

b. PLASMA ENVEJECIDO. El plasma envejecido se diferencia del plasma normal porque carece de los factores V y VIII (molecularmente lábiles). Si en la mezcla de plasma envejecido/plasma del paciente el tiempo de coagulación se corrige, el factor deficiente es aportado por el grupo presente en el plasma envejecido. I, II, VII, IX, X, XI Y XII. (1) Si la mezcla no se corrige se pensará en deficiencia de factor V o del factor VIII. 53



Para obtener plasma envejecido se separa una alícuota del plasma normal mezclado indicado anteriormente y se incuba a 37oC durante 2-3 horas. Esta incubación desnaturaliza a los factores V y VIII. (2) c. PLASMA ADSORBIDO El plasma adsorbido con sales solubles, sulfato de bario o hidróxido de aluminio, carece de los factores II, VII, IX y X (los dependientes de la vitamina K). Si se agrega plasma absorbido al plasma del paciente y se corrige el tiempo de coagulación, la deficiencia implica a un factor presente en el plasma absorbido factor I, V, VIII, XI, XII. (1) Si por el contrario el resultado no corrige se pensará en deficiencia de algunos de los factores vitamina K dependientes (II, VII, IX y X) (1,2) Adsorción con sulfato de bario (BaSO4 ) 1. Colocar en un tubo de ensayo 12 X 75 mm, 1 ml de la mezcla de plasmas normales. 2. Agregar 100 mg de sulfato de bario. Mezclar perfectamente e incubar a 37oC por 15 minutos agitando cada 3 minutos. 3. Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm, separar el sobrenadante (plasma adsorbido) y desechar el precipitado. Adsorción con hidróxido de aluminio (Al (OH)3) 1. En un tubo de ensayo 12 X 75 mm, colocar 1 ml de la mezcla de plasmas normales y agregar 100 mg de hidróxido de aluminio. 2. Se incuba la mezcla a 37oC durante 3 minutos. 3. Centrifugar la mezcla inmediatamente a 3000 rpm por 5 minutos. 4. Separara el sobrenadante (plasma adsorbido) y desechar el precipitado.

PROCEDIMIENTO DE MEZCLAS PARA INVESTIGACION DE PROBABLE CORRECCION El plasma problema, con TP ó TTPa prolongados, se ensaya nuevamente, pero mezclándolo con el plasma normal de la siguiente manera: 1. En tubos de 12 X 75 mm, preparar diluciones de 1:2 y 1:4 del plasma problema usando como diluyente la mezcla de plasmas normales preparada anteriormente. Se prepara un testigo normal haciendo las 54



mismas diluciones pero de plasma normal mezclado y solución salina isotónica. 2. Realizar a cada dilución y al testigo, la prueba que haya resultado prolongada (TP, TTPa o ambas). 3. Si el plasma problema corrige, es decir se acorta el tiempo prolongado, obteniendo un tiempo similar al del testigo, indicará deficiencia de un factor. Si no corrige, se tratará de la presencia de un inhibidor y en este caso NO APLICA seguir haciendo mezclas de sustitución. 4. Si la prueba SE CORRIGIO, se debe proceder de la siguiente manera para identificar el factor deficiente 5. En tubos de 12 X 75mm, preparar series de diluciones 1:2, 1:4 y 1:8 del plasma problema con a) plasma envejecido, b) suero y c) plasma adsorbido. Se recomienda rotular adecuadamente cada tubo, dada la variedad de reactivos y cantidad de tubos. 6. Realizar a cada tubo la prueba alterada (TP, TTPa o ambas) por duplicado. Los tiempos se deben comparar con los obtenidos para el testigo en las mismas diluciones (plasma mezclado normal y solución salina isotónica) (2,3)

Contenido de factores de los componentes sanguíneos de sustitución y sus productos (1,4)

Componente o producto

Factores presentes

Factores ausentes

Todos Ŧ

Ninguno Ŧ

I, II, VII, IX, X, XI, XII

V, VIII

VII, IX, X, XI, XII

I, II**, V, VIII, XIII**

Plasma normal Plasma normal envejecido Suero normal

Plasma adsorbido en BaSO4 I, V, VIII, XI, XII, XIII II, VII, IX, X o Al(OH)3 Ŧ Entiéndase todos los factores normalmente presentes y/o ausentes en la sangre ** Puede haber, pero en cantidad notablemente disminuida por lo que se consideran ausentes

INTERPRETACION DE RESULTADOS Las mezclas de plasma y de componentes de sustitución están indicadas únicamente en casos de deficiencia hereditaria de factores de coagulación y presencia de 55



inhibidores circulantes. Si la historia clínica y la exploración física sugieren deficiencias adquiridas, estas pruebas no resultan pertinentes ni útiles. En la mezcla de plasma de paciente/plasma normal la interpretación será: •

PRUEBA ALTERADA CORRIGE = DEFICIENCIA DE FACTOR, SE DEBE CONTINUAR CON MEZCLAS DE SUSTITUCION

•

PRUEBA ALTERADA NO CORRIGE = PRESENCIA DE INHIBIDOR, SE DEBEN REALIZAR OTRAS PRUEBAS PARA DETECCION DE INHIBIDORES.

Los resultados de las mezclas con componentes de sustitución se interpretarán de acuerdo con la tabla siguiente (1, 3,4)

Deficiencia de factor

TP

TTPa

Pruebas corregidas con plasma envejecido

Pruebas corregidas con suero

Pruebas corregidas con plasma adsorbido

X

A

A

Si

Si

No

V

A

A

No

No

Si

II

A

A

Si

No

No

I

A

A

Si

No

Si

VII

A

N

Si

Si

No

XII

N

A

Si

Si

Si

XI

N

A

Si

Si

Si

IX

N

A

Si

Si

No

VIII

N

A

No

No

Si

A: Anormal; N: Normal

CUESTIONARIO 1. Explica la interpretación de los siguientes patrones de resultados de los tiempos de coagulación: a. TP prolongado, TTPa y TT Normales b. TP normal, TTPA prolongado y TT normal c. TP y TTPa prolongados y TT normal d. TP, TTPa y TT prolongados 56



2. En un paciente con TP y TT normales pero TTPa alterado que corrige al repetirse con mezcla del plasma del paciente y plasma normal y después no corrige en una segunda mezcla con plasma envejecido ¿Cuál será el diagnóstico más probable?

BIBLIOGRAFIA 1. McKenzie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno. P.p 636,637. 2. Steve Kitchen, A. M. (2008). DIAGNOSTICO DE LA HEMOFILIA Y OTROS TRANSTORNOS DE LA COAGULACION. EL COMITE DE CIENCIAS DEL LABORATORIO DE LA FEDERACION MUNDIAL DE HEMOFILIA. P-40,41. 3. Rodak, B. (2004). HEMATOLOGIA FUNDAMENTOS Y METODOS. España. Mèdica Panamericana. 4. Vives, A. y. (2002). MANUAL DE TECNICAS EN HEMATOLOGIA. España. Masson. Serie Manuales Espiral.

57



PRACTICA 10 TIEMPO DE TROMBINA FUNDAMENTO La adición de bajas concentraciones de trombina al plasma da lugar a la coagulación del fibrinógeno en un tiempo que no solo dependerá de la concentración de este, sino también de la presencia de inhibidores de la fibrinoformación. (4) OBJETIVO • Comprender el fundamento del método. • Ejecutar correctamente la técnica. • Valorar la aplicación clínica del Tiempo de Trombina. EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS Material por equipo de 4 alumnos: • 12 Tubos de ensayo 12 X 75 Material biológico, equipo y reactivos por grupo: • Cronómetro • Puntas para pipeta automatizada • Baño María a 37oC • Plasma citratado del paciente • Plasma control (preparado en el laboratorio o comercial)(REACTIVO 6) • Trombina humana de 4U/ml (REACTIVO 9) • Pipeta automatizada de 200 µl PROCEDIMIENTO En este método se mide el tiempo durante el cual el fibrinógeno presente en el plasma se transforma a fibrina por la acción de una cantidad estandarizada de trombina. Se realizan determinaciones cualitativas y cuantitativas del fibrinógeno, o la presencia de inhibidores de la conversión de fibrinógenofibrina.(1,2) 58



6. Todas las muestras se realizan por duplicado. 7. Disponer 2 volúmenes (200 µl) del plasma problema en un tubo de ensayo e incubar 2 minutos a 37oC. 8. Añadir dos volúmenes (200 µl) de reactivo de trombina preincubada, poner en marcha el cronometro simultáneamente. 9. Anotar el tiempo de coagulación. VALORES DE REFERENCIA Tiempo de Trombina: 10 a 15 segundos. INTERPRETACION DE RESULTADOS El Tiempo de Trombina se considerará prolongado, cuando su diferencia con el control resulte mayor de 4 segundos. Se observa prolongado en hipofibrinogenemia, coagulación intravascular diseminada, fibrinólisis primaria, presencia de antitrombinas (especialmente heparinas o anticoagulantes tipo heparinoides) e hipergammaglobulinemias. También en pacientes con uremia, hepatopatías y en otras anormalidades moleculares del fibrinógeno. (1,3) La prueba se prolonga no solamente debido a una baja concentración del fibrinógeno, sino también a su marcada elevación (fibrinógeno arriba de 6 g/L) y a alteraciones funcionales en su molécula (disfibrinogenemia), frecuentes en las enfermedades hepáticas. Es muy sensible a la presencia de heparina y se prolonga también por interferencias en la polimerización de la fibrina, como es la presencia de productos de degradación del fibrinógeno (PDF). El resultado de la prueba tiene mayor valor diagnóstico cuando se acompaña de la cuantificación de fibrinógeno. Otra prueba que se utiliza simultáneamente es el tiempo de Reptilasa, que puede considerarse una variante del tiempo de trombina, aunque utiliza como reactivo una solución del veneno de las víboras del género Bothrops, el cual contiene una enzima que coagula el fibrinógeno y cuya actividad no es interferida por la presencia de heparina, por lo que su normalidad en presencia de un tiempo de trombina prolongado señala, pues, la presencia de heparina. Por otra parte permite detectar otras causas de prolongación del tiempo de polimerización de la fibrina (como una elevada concentración de PDF) en pacientes tratados con heparina. (4)

59



CUESTIONARIO 1. Explica la importancia de incluir el tiempo de trombina siempre dentro de las pruebas básicas de coagulación. 2. Explica la utilidad e interpretación de utilizar el tiempo de trombina y el tiempo de reptilasa en ciertos pacientes con trastornos del fibrinógeno. BIBLIOGRAFIA 1. Korvich Lucia, S. A. (1990). MANUAL DE HEMOSTASIA Y TROMBOSIS. Argentina: grupo (CLAHT).P-175. 2. Mc Kenzie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno. P-415 3. Steve Kitchen, A. M. (2008). DIAGNOSTICO DE LA HEMOFILIA Y OTROS TRANSTORNOS DE LA COAGULACION. EL COMITE DE CIENCIAS DEL LABORATORIO DE LA FEDERACION MUNDIAL DE HEMOFILIA. P-43,44. 4. Vives, A. y. (2002). MANUAL DE TECNICAS EN HEMATOLOGIA. Masson. Serie Manuales Espiral. P-631,632.

60



PRACTICA 11 CUANTIFICACION DE FIBRINOGENO POR EL METODO DE CLAUSS

FUNDAMENTO El logaritmo del tiempo de coagulación es inversamente proporcional al logaritmo de la concentración de fibrinógeno cuando se añade una elevada concentración de trombina al plasma citratado diluido en una solución tamponada. (1, 5,3) OBJETIVO • Comprender el fundamento del método. • Ejecutar correctamente la técnica. • Valorar la aplicación clínica de la cuantificación del fibrinógeno. EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS Material por equipo de 4 alumnos: • 1 Gradilla. • 22 Tubos de ensayo 12 X 75mm. •

4 Pipetas Pasteur.

•

4 Hojas de papel doble logaritmo.

Material biológico, equipo y reactivos por grupo: • Cronómetro. • Coagulómetro. • Bloque térmico para incubación o baño María a 37oC. • Plasma citratado. • Pipeta automatizada 100 µl. • Pipeta automatizada de 200 µl. 61



• Copillas de reacción para Coagulòmetro. • Reactivo de Trombina 50-100 UNIH/ml.(REACTIVO 10) • Tampón veronal de Owren de pH 7.35 (REACTIVO 11) • Plasma citratado de referencia comercial (calibrador) con un nivel de fibrinógeno funcional conocido. (REACTIVO 12) PROCEDIMIENTO El método de Clauss es el de referencia internacional pues permite evaluar la cantidad y función del fibrinógeno plasmático aún en bajas concentraciones. Se practicará una medición cuantitativa de fibrinógeno con el empleo de una modificación del tiempo de trombina. Se realiza una curva estándar normal con el uso de diluciones de un plasma de referencia de fibrinógeno. Se practica una prueba de TT en cada dilución estándar y se construye una grafica con el TT registrado en segundos en las abscisas y la concentración del fibrinógeno en mg/dl en la ordenada. Se practica entonces una prueba de TT en el plasma del paciente y se anota el tiempo de coagulación y se compara con el valor del plasma de referencia en la gráfica. Si se agrega calcio al sistema de la prueba, se puede hacer un estimado aproximado de la actividad del factor XIII. (3,2) 1. Diluir las muestras del plasma problema y plasma control con el tampón veronal a 1:10 (1 volumen de plasma y 9 de tampón) 2. Incubar 2 volúmenes de plasma diluido (200µl) a 37oC durante 2 minutos. 3. Añadir un volumen de trombina concentrada (100 µl), conservada a temperatura ambiente, y medir el tiempo de coagulación. Hacer muestras por duplicado. ELABORACIÓN DE LA RECTA DE CALIBRACIÓN 1. Sobre una muestra de plasma calibrador comercial se realizan diluciones crecientes con tampón veronal: 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25. 2. Obtener el tiempo de coagulación de estas diluciones tal como se ha indicado para la muestra problema. 3. Sobre el papel doble logarítmico, trazar la recta de calibración, enfrentado los tiempos en segundos con las concentraciones de fibrinógeno, que resultan de las diluciones realizadas sobre el plasma calibrador, expresadas en mg/dl.(5)

62



LECTURA DE RESULTADOS Llevar el tiempo sobre la línea de calibración, previamente establecida, para su lectura. Si los tiempos de dilución a 1:10 se encuentran fuera de la curva lineal (por presentar concentraciones de fibrinógeno muy altas o muy bajas), preparar diluciones a 1:5 ó 1:20, según sea necesario. Si la muestra se diluye a 1:5 dividir el resultado de la curva estándar entre 2; si la muestra se diluye a 1:20, multiplicar el resultado de la curva por 2 para obtener el resultado final. ELABORACIÓN DE LA RECTA DE CALIBRACIÓN 1. Sobre una muestra de plasma calibrador comercial se realizan diluciones crecientes con tampón veronal: 1:3.5, 1:5, 1:10, 1:15, 1:35. 2. Obtener el tiempo de coagulación de estas diluciones tal como se ha indicado para la muestra problema. 3. Sobre el papel doble logarítmico, trazar la recta de calibración, enfrentado los tiempos en segundos con las concentraciones de fibrinógeno, que resultan de las diluciones realizadas sobre el plasma calibrador, expresadas en mg/dl.(5) DILUCION

FACTOR DE DILUCION

FIBRINOGENO mg/dl

TC MEDIO (segundos)

1:3.5

10/3.5=2.9

304 X 2.9=882

5.8

1:5

10/5=2

304 X 2= 638

7.3

1:10

10/10=1

304 X 1= 304

13.4

1:15

10/15=0.67

304 X 0.67=234

20.8

1:35

10/35= 0.29

304 X 0.29

49.2

VALORES DE REFERENCIA FIBRINOGENO: 200 a 400 mg/dl. INTERPRETACION DE RESULTADOS

63



La hipofibrinogenemia suele asociarse con coagulación intravascular diseminada (CID), fibrinolisis sistémica y enfermedad hepática grave. La enfermedad hepática moderadamente grave, el embarazo y cualquier enfermedad inflamatoria crónica pueden producir niveles elevados de fibrinógeno, debido a que éste es un reactante de fase aguda. La afibrinogenemia congénita presenta tiempos de coagulación prolongados y se asocia con un trastorno hemorrágico variable. La disfibrinogenemia puede dar los mismos resultados que la hipofibrinogenemia en este método de prueba, porque algunas formas anómalas de fibrinógeno se hidrolizan con mayor lentitud por la trombina que el fibrinógeno normal. Algunas formas de disfibrinogenemia pueden asociarse con trombosis. Las mediciones de fibrinógeno por otros métodos (inmunitarios y turbidimétricos) son normales en la disfibrinogenemia. (5,6) CUESTIONARIO 1. Describe el fundamento del método de Clauss para cuantificación de fibrinógeno 2. Investiga dos métodos alternos para cuantificación de este factor 3. Explica la interpretación si los valores de fibrinógeno son normales pero el tiempo de trombina esta prolongado BIBLIOGRAFIA 1. Korvich Lucia, S. A. (1990). MANUAL DE HEMOSTASIA Y TROMBOSIS. Argentina: grupo (CLAHT).P-288 2. Martinez Murillo Carlos, Q. G. (2001). MANUAL DE HEMOSTASIA Y TROMBOSIS. México,D.F.: Prado. P-427. 3. Mc Kenczie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno. P637 4. Steve Kitchen, A. M. (2008). DIAGNOSTICO DE LA HEMOFILIA Y OTROS TRANSTORNOS DE LA COAGULACION. EL COMITE DE CIENCIAS DEL LABORATORIO DE LA FEDERACION MUNDIAL DE HEMOFILIA. P-46 5. Vives, A. y. (2002). MANUAL DE TECNICAS EN HEMATOLOGIA. Masson. Serie Manuales Espiral. P-630,631 6. Rodak, B. (2004). HEMATOLOGIA FUNDAMENTOS Y METODOS. España. Mèdica Panamericana.

64



PRACTICA 12 PRUEBA DE RASTREO DEL FACTOR XIII Solubilidad del coagulo en ácido acético al 2% o urea 5M FUNDAMENTO La acción de la trombina sobre el fibrinógeno

lleva a la formación de

monómeros de fibrina, que se polimeriza, generando la malla o red de fibrina. El polímero es estabilizado por acción del factor XIIIa (cimógeno) en presencia del ion calcio, debido a la formación de uniones covalentes entre grupos adyacentes de las cadenas de los monómeros de fibrina.

(2)

Este proceso da

lugar a la formación de fibrina que es insoluble en soluciones de ácido acético ó urea, a diferencia de la fibrina inicial o no estabilizada. En caso de ausencia o de concentraciones muy bajas de factor XIII (las necesidades fisiológicas son muy pequeñas), el coagulo de fibrina será soluble en dichas soluciones.(4) OBJETIVOS •

Comprender el fundamento del método.

•

Ejecutar correctamente la técnica.

•

Identificar la utilidad clínica de la determinación del factor XIII.


1 Gradilla

•

4 Pipetas Pasteur

•

4 Pipeta graduada de 5 ml.

•

12 Papel parafilm ó tapones.

•



Centrifuga. 65



•


•

Cronómetro

•


•

Plasma obtenido con EDTA. (control positivo)

•

Plasma citratado normal (control negativo)

•

Pipetas automatizadas de 100 µl y 200 µl

•

Puntas para pipetas automatizada

• Solución salina 0.9% (REACTIVO 3) • Trombina 30 U/ml. (REACTIVO 13) • Acido acético al 2%. (REACTIVO 14) • Urea 5M (REACTIVO 15)

PROCEDIMIENTO La trombina y el calcio son necesarios para la activación del factor XIII que estabiliza el entrecruzamiento de la fibrina. En este método, a pasar de usar plasma citratado, hay suficientes iones de calcio disponibles para activar el factor XIII. Para su control se usa plasma obtenido con EDTA. En este plasma, el EDTA se liga completamente a los iones calcio, lo que significa que el factor XIII no puede unirse a la fibrina. La adición de ácido acético al 2% ó urea 5M termina lisando los coágulos no ligados. El plasma citratado que contenga mas de 10 U/dl de actividad de factor XIII tiene un coágulo insoluble: La prueba es más sensible si se emplea ácido acético en vez de urea. (3) 1. En un tubo de ensayo 12 X 75 se colocan 200 µl de plasma citratado del paciente a 200 µl de solución salina 0.9%. 2. Para control positivo, repetir con 200 µl de plasma con EDTA. 3. Para control negativo, repetir con 200 µl de plasma citratado normal. 4. Añadir a cada uno de los tubos100 µl de trombina de 30 U/ml. Mezclar. 5. Dejar durante 30 minutos a 37oC.

66



6. Sacudir suavemente los tubos para separa el coágulo de la pared del tubo. 7. Agregar 5 ml de ácido acético al 2% y tapar el tubo 8. Dejar a temperatura ambiente durante 12 horas. (3) VALORES DE REFERENCIA La prueba se considera normal cuando el coágulo no se solubiliza en 12 horas en ácido acético al 2%. Si se utiliza urea 5M en lugar del ácido acético al 2%, se debe incrementar a 24 horas el tiempo de incubación para la disolución del coágulo. Este método es menos sensible que el realizado con ácido acético.

INTERPRETACION El plasma con EDTA no debe tener un coágulo visible. El plasma citratado normal debe tener un coágulo integro visible. El coágulo normal permanece insoluble a las 12 horas. En caso de ausencia total del factor XIII, el coagulo se disuelve totalmente a los 10 minutos. (2) El tiempo que tarda el coágulo en disolverse, se halla en relación directa al nivel del factor XIII presente en el plasma. La sensibilidad de la prueba es escasa (resulta anormal con niveles inferiores al 2-3% del factor XIII), sin embargo, permite detectar aquellos pacientes con riesgo

de

desarrollar

complicaciones

hemorrágicas.

La

aparición

de

manifestaciones clínicas se observa con niveles inferiores al 3% de la actividad funcional del factor XIII. Esta prueba no permite detectar deficiencias moderadas (pacientes heterocigotos). (2) CUESTIONARIO 1. Investiga la reacción a nivel molecular de la acción del factor XIIIa sobre el polímero de fibrina 2. Si el factor XIIIa no actúa sobre la fibrina que productos de degradación de ésta última no se producirían durante la fibrinolisis. BIBLIOGRAFIA: 67



1. Mc Kenzie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. México.

Manual

Moderno p-637 2. Korvich

Lucia,

S.

A.

(1990).

MANUAL DE HEMOSTASIA Y

TROMBOSIS Argentina: grupo (CLAHT) P-303. 3. Steve Kitchen, A. M. (2008). DIAGNOSTICO DE LA HEMOFILIA Y OTROS TRANSTORNOS DE LA COAGULACION. EL COMITE DE CIENCIAS DEL LABORATORIO DE LA FEDERACION MUNDIAL DE HEMOFILIA. P-48, 49 4. Vives Corrons Joan Lluis, A. b. (2006). MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO EN HEMATOLOGIA. Barcelona, España: MASSON, S.A. p-636

68



PRACTICA 13 INVESTIGACION DE ANTICOAGULANTES CIRCULANTES INTRODUCCION Un resultado prolongado en los tiempos de coagulación o la detección de niveles aparentemente disminuidos de un factor de la coagulación no siempre son debido a una deficiencia en su síntesis. De hecho una causa más frecuente aún puede ser la presencia de inhibidores circulantes.

Estos

inhibidores pueden ser de dos tipos: Un inhibidor llamado anticoagulante lúpico ó un anticuerpo dirigido contra algún factor de coagulación específico. ANTICOAGULANTES LUPICOS (AL): Son anticuerpos dirigidos contra complejos proteína-fosfolípidos que impiden la correcta unión de los factores de la coagulación a la superficie fosfolipídica. Los anticoagulantes lúpicos dañan la actividad factores X, IX y protrombina.

in vitro de los

A pesar de que in vitro se presentan como

alargamientos de las pruebas de coagulación (TTPa), la presencia de estos anticuerpos en el paciente se asocian con tendencia trombótica más que hemorrágica. Hay una gran variedad de técnicas para la detección de AL, la mayoría de ellas basadas en observar el alargamiento de las pruebas de coagulación de un plasma en presencia de pequeñas cantidades de fosfolípidos o, por lo contrario, ver la normalización de las pruebas de coagulación

al

incrementar

la

concentración

de

fosfolípidos.

Los

anticoagulantes lúpicos se denominan inhibidores inespecíficos adquiridos y se pueden presentar en pacientes con lupus eritematoso sistémico (de ahí su nombre original) aunque también se encuentran en otras colagenosis, neoplasias, incluso en individuos sin otra enfermedad evidenciable donde se denomina anticuerpo antifosfolípido primario (1,4, 6) Los criterios recomendados por la ISTH (International Society for Thrombosis and Haemostasis) para el diagnóstico de Anticoagulantes lúpicos son: 69



1. Prolongación de al menos una prueba de coagulación que necesite fosfolípidos, 2. Confirmación de que la alteración se debe a un inhibidor y no a un defecto de factor, 3. Evidencia que la actividad inhibitoria depende de los fosfolípidos y 4. Evidencia de que el inhibidor no va dirigido contra factores de coagulación. Detección de anticoagulantes lúpicos. Las pruebas mas ampliamente utilizadas son los test de Exner y de Rusell. El primero consiste en el tiempo de coagulación de un plasma problema mezclado con diferentes proporciones con un plasma control, mediante caolín y CaCl2, es sensible a la heparina y también a los inhibidores específicos contra factores de la coagulación, por lo que hay que descartar la presencia de estos ante un test de Exner positivo. El test de Russell consiste en la coagulación de un plasma en presencia del veneno de la serpiente de Russell, que activa directamente al factor X en presencia de pequeñas cantidades de fosfolípidos. Se recomienda realizar el test en mezcla de partes iguales de plasma problema y plasma control, para descartar el déficit de factores. También es sensible a la heparina (4,5). INHIBIDORES ESPECIFICOS DE FACTORES: Los inhibidores específicos son anticuerpos contra factores de la coagulación. Se originan en deficiencias congénitas

graves en factores en respuesta a

tratamiento con concentrados del factor. El Ac antifactor VIII, el más común, se detecta en un 10

al 20 % de los hemofílicos graves. En ocasiones

autoanticuerpos (AAc) antifactor VIII pueden presentarse en no hemofílicos, por lo general como parte del síndrome de hemorragia posparto o en pacientes mayores con trastornos autoinmunes. El AAc antifactor VIII se asocia con hemorragia anatómica grave. (3) Detección del inhibidor del factor VIII. 70



El inhibidor

del factor VIII se puede cuantificar mediante varias

soluciones del plasma del paciente con una mezcla de plasma que contiene una cantidad conocida de actividad de este factor. Después de la incubación se mide la actividad residual del factor VIII

con el análisis del factor VIII. La

actividad residual del factor VIII se calcula al comparar su actividad en la dilución del plasma del paciente con su actividad en el plasma mezclado normal. La actividad residual del factor VIII se convierte en una unidad Bethesda de inhibidor que se define como la cantidad de inhibidor que inactiva 50% de la actividad presente del factor VIII. El análisis Bethesda de titulación fue desarrollado originalmente para medir inhibidores del factor VIII y se puede modificar para el análisis de los inhibidores del factor V y del factor IX. Un inhibidor débil del factor VIII no se puede detectar con este procedimiento. Para detectar inhibidores más débiles deben alterarse la temperatura y la duración de la incubación. Las diluciones deben incubarse a 37oC durante un periodo mayor. El titulo del inhibidor no se correlaciona con la hemorragia ni

la predice. Las características

de un

inhibidor varían de un paciente a otro. (2) FUNDAMENTO Se trata de anticuerpos que interfieren en el proceso de la coagulación y dan lugar a una prolongación de las pruebas básicas de la coagulación. Esta prolongación no se corrige por la mezcla de partes iguales de plasma normal, es a diferencia de lo que ocurre cuando existe déficit de factores. Los anticoagulantes circulantes llamados lúpicos son muy frecuentes, se trata en realidad de anticuerpos antifosfolípidos sin acción anticoagulante in vivo, y que por lo contrario se asocia a complicaciones trombóticas y abortos de repetición. (6) INVESTIGACIÓN DE ANTICOAGULANTES LÚPICOS: Su presencia es demostrable por la prolongación de cualquier prueba de coagulación en la que se utilice una baja concentración de fosfolìpidos, por lo

71



que casi siempre se alarga el TTPa pero sólo los más potentes logran prolongar al TP. Se recomienda llevar a cabo, al menos, dos pruebas para su diagnóstico, que puede ser la realización de un TTPa utilizando cefalina diluida, el tiempo de caolín, el tiempo de veneno de víbora Russell (VVR) diluido o la prueba de inhibición de la tromboplastina. Estas pruebas no pueden efectuarse en presencia de heparina ya que dan falsos positivos OBJETIVOS •

•

•

Comprender el fundamento de los métodos Ejecutar correctamente las pruebas. Identificar

la utilidad clínica de la investigación de anticoagulantes

circulantes. EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS Material por equipo de 4 alumnos. •

1 Gradilla

•

10 Pipetas Pasteur

•

4 Hojas de papel milimétrico

•




•

Puntas para pipeta automatizada

•

Centrifuga.

•

Coagulómetro

•


•

Cronómetro

•

Plasma citratado del paciente 72



•


•

Sangre citratada fresca. Para obtener plaquetas.

•

Suspensión de plaquetas lavadas o liofilizadas.

•

Mezcla de plasma normal

• Solución salina isotónica (REACTIVO 3) • Solución de CaCl2 25 mmol/l. (REACTIVO 5) • Suspensión de caolín de 20 g/l en NaCl al 0.9 % (REACTIVO 16) • VVR diluido en tampón veronal-acetato de pH7.35 a una concentración de 50 µg/l. (REACTIVO 17) • Tromboplastina parcial activada (cefalina) diluida 1:8 en el mismo tampón (REACTIVI 18) • Plasma estándar

para factor VIII preparado o plasma comercial.

(REACTIVO 19) • Plasma deficiente de factor VIII(comercial o puede ser obtenido de un donante cuyo nivel de factor VIII sea menos de 1 u/dl que no tenga anticuerpos anti VIII) (REACTIVO 20) • Solución tampón Barbitúrico Owren (OBS)(REACTIVO 11) • Tampón de suero salino de Owren.(REACTIVO 21) • Tampón de Tyrode de pH 6.5 (REACTIVO 22)

PROCEDIMIENTOS TIEMPO DE CAOLÍN Es la prueba de rutina más sensible para la detección del inhibidor lúpico, el sistema mas frecuente en nuestro medio utiliza como fosfolìpidos cefalina (que puede tener distintos orígenes) y como activador caolín. 1. Incubar 100 µl de plasma problema con 100 µl de suspensión de caolín a 37oC, durante 3 minutos. 2. Añadir 100 µl de CaCl2 y medir el TTPa. 73



3. Repetir de igual forma con el plasma problema y con una mezcla preparada a partes iguales de plasma problema y plasma normal. 4. Hacer muestras por duplicado.

VALORES DE REFERENCIA El plasma normal coagula en un tiempo inferior a 120 segundos. INTERPRETACION Tiempos superiores para la muestra problema son sospechosos de la presencia de anticoagulante, que se confirma si la prolongación no se corrige en la mezcla problema-control. Preparación de Plaquetas Lavadas para DRVVT 1. Preparar plasma rico en plaquetas (PRP) de sangre citratada fresca, por centrifugación a 170g (1200 rpm) durante 10 minutos a temperatura ambiente o usar concentrados de plaquetas como para el tratamiento de pacientes. 2. Diluir PRP 1: 2 con tampón de Tyrode. 3. Las plaquetas diluidas se colocan en un tubo de centrifugado de plástico y de fondo cónico, y se centrífuga durante 10 minutos a 850 g y a temperatura ambiente. 4. Retirar el sobrenadante mediante una pipeta de Pasteur de plástico y resuspender el grumo de plaquetas en tampón de Tyrode (añadir la misma cantidad de tampón que el volumen original de PRP). Centrifugar a 850 g como antes. Este proceso se repite dos veces. 5. Retirar el sobrenadante y resuspender en tampón de Tyrode usando un volumen de tampón igual al 25% del volumen original de PRP. 6. Dividir las plaquetas lavadas finales en cantidades alícuotas de 1,0 ml en tubos de plástico y congelar y descongelar dos veces a –20ºC antes de ser usadas.

TIEMPO DE VENENO DE VÍBORA DE RUSSELL 74



Es una prueba de gran sensibilidad para la detección del inhibidor lúpico. El veneno de víbora de Russell (VVR) contiene una enzima que activa directamente el factor X. El factor X activado posteriormente activa la protrombina en presencia de fosfolípidos, iones de calcio y factor V. La dilución del veneno y el fosfolípido hacen que la prueba sea específicamente sensible a la presencia de anticoagulantes lúpicos sobre anticuerpos antifosfolípidos. Un tiempo de veneno de víbora de Russell prolongado puede ser causado por inhibidores de

fosfolípidos, o también puede producirse por deficiencias o

anomalías de los factores II, V, X o fibrinógeno. (5) 1. Incubar 100 µl de plasma problema con 100 µl cefalina diluida, a 37oC durante 90 minutos. 2. Añadir 100 µl de VVR diluido e incubar durante 30 segundos más, al cabo de los cuales se añaden 100 µl de CaCl2 y se mide el TTPa. 3. Repetir de igual forma con el plasma normal y con una mezcla a partes iguales de plasma problema y plasma normal. 4. Si el plasma problema tiene un tiempo prolongado con respecto al control, que no se corrige en la mezcla de ambos, repetir la determinación sustituyendo por la cefalina diluida

por 100 µl de

suspensión plaquetaria. VALORES DE REFERENCIA El valor normal para el cociente del

tiempo VVR debe establecerse

localmente, usando plasma de sujetos sanos. INTERPRETACION Un tiempo prolongado del plasma problema que no corrige en la mezcla con el control y sí, al menos parcialmente (> 20 %), al sustituir la cefalina por suspensión plaquetaria, es diagnostico de anticoagulante lúpico. (5)

INVESTIGACION DE INHIBIDORES ESPECIFICOS CONTRA UN FACTOR DE COAGULACION Ensayo de factores basado en el TTPa Nos referiremos al inhibidor del factor VIII por ser el más frecuente, dentro de su rareza. El ensayo compara la capacidad de diluciones del plasma 75



estándar y de plasma de prueba, para corregir TTPa de un plasma que se desconoce totalmente deficitario de factor VIII, pero que contiene los demás factores necesarios para la coagulación normal. Para los factores IX, XI y XII el ensayo es básicamente el mismo y se realiza mediante la sustitución del plasma deficiente apropiado en lugar del plasma deficiente en factor VIII, y tras la selección del plasma de referencia adecuado. 1. Hacer diluciones a 1:10 de plasma estándar y de plasma problema con solución salina tampón (Si se desea que el plasma de prueba tenga un nivel muy bajo de factor VIII, empezar en la dilución 1:5). 2. Usando volúmenes de 200 µl, hacer dobles diluciones en OBS de plasma estándar y plasma problema desde 1:10 a 1:40, en tubos de de 12 X 75 mm. (Mezclar bien cada dilución antes de transferir al siguiente tubo). Mantener todas las diluciones en hielo ya que el factor VIII es lábil (fácilmente destruible). (Esto sólo es necesario si las diluciones no se procesan inmediatamente tras su preparación o la temperatura ambiente excede los 25oC). 3. Pipetear 100 µl, de cada dilución estándar en tubos de ensayo 12 X 75 mm. 4. Añadir 100 µl, de plasma deficiente en factor VIII y transferirlo a baño María a 37oC 5. Añadir 100 µl, de reactivo de TTPa e incubarlo durante 5 minutos. 6. A los 5 minutos añadir 100 µl, de CaCl2 y registrar el tiempo de coagulación. Una prueba en blanco también puede establecerse de la siguiente forma: • 100 µl de OBS • 100 µl de plasma deficiente en VIII • 100 µl de reactivo de TTPa • 100 µl de CaCl2 Una prueba en blanco debe ser mayor que el tiempo de la actividad del factor VIII al 1% del estándar según el grafico de calibración. Si el tiempo es menor, indica que el plasma no es totalmente deficiente en el factor VIII y de este modo no es adecuado para la prueba. VALORES DE REFERENCIA 76



El valor normal debe establecerse localmente, pero frecuentemente tienen límite inferior de 50-60 u/dl. INTERPRETACION Representar

el tiempo de coagulación

del plasma control frente a la

concentración de del factor VIII en papel semilogarítmico. Representar la concentración sobre la escala logarítmica y el tiempo de coagulación sobre una escala lineal. Ejemplo de gráfico de calibración:

A la dilución 1:10 se le asigna arbitrariamente un valor de 100%, a la 1:20 un valor de 50% y a la 1:40 un valor de 25%. Se deben obtener líneas rectas y paralelas entre sí. (4,5) CUESTIONARIO 1. Investiga más características de los llamados anticoagulantes lúpicos y su papel tanto in vitro como in vivo. 2. Investiga sobre la utilidad de las unidades Bethesda para determinación de anticoagulantes circulantes. BIBLIOGRAFIA: 1. Korvich Lucia, S. A. (1990). MANUAL DE HEMOSTASIA Y

TROMBOSIS. Argentina: grupo (CLAHT).P-221,222 2. McKenczie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno. P-763,764. 77



3. Rodak, B. (2004). HEMATOLOGIA FUNDAMENTOS Y METODOS. España. Médica Panamericana. P743,744.

4. Sans-Sabrafen, C. R. (2006). HEMATOLOGIA CLINICA. España: Elsevier. P 674,675 5. Steve Kitchen, A. M. (2008). DIAGNOSTICO DE LA HEMOFILIA Y OTROS TRANSTORNOS DE LA COAGULACION. EL COMITE DE CIENCIAS DEL LABORATORIO DE LA FEDERACION MUNDIAL DE HEMOFILIA. P-53 a 56, 78 a 82,86. 6. Vives Corrons Joan Lluis, A. b. (2006). MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO EN HEMATOLOGIA. Barcelona, España: MASSON, S.A. p-638

78



PRACTICA 14 PROTEINAS C Y S FUNDAMENTO La proteína C es una glucoproteína plasmática

de síntesis hepática

dependiente de la vitamina K. Es precursora de la proteína C activada, ésta se produce tras la unión de la trombina a la trombomodulina. Así, la trombina pierde su efecto procoagulante y se constituye en el paso inicial de activación de la vía de la proteína C. La proteína C activada es la responsable de la degradación de los factores Va y VIIIa. Para ello requiere de la unión de la proteína S, que es una glucoproteína plasmática sintetizada en el hígado, endotelio, megacariocitos y células de Leydig testiculares y también es dependiente de vitamina K.

(1)

La proteína S existe en dos formas: libre y fija.

Un 60% de la proteína S está enlazada a la proteína fijadora de complemento C4b; en esta forma la proteína S no es funcional; 40% de la proteína S está libre. Esta proteína S libre actúa como un cofactor para aumentar la actividad de la proteína C. (2)

OBJETIVOS •

•

Entender el fundamento del método Ejecutar correctamente la prueba


calibración •

Identificar la utilidad clínica de la Proteína C y Proteína S


1 Gradilla 79



•

8 Pipetas Pasteur

•

4 Papel milimétrico

•



Centrifuga.

•

Coagulómetro

•


•

Cronómetro

•

Espectrofotómetro o colorímetro con filtros de 450 nm

•


•


•

Plasma calibrador comercial valorado (REACTIVO 23)

•

Celdas para fotocolorímetro

•


•

Puntas para pipetas automatizadas

• Sustrato cromogénico S-2366 a una concentración de 1.5 mmol/l. (REACTIVO 24) • Activador de proteína C procedente de veneno de serpiente. (REACTIVO 25) • Acido acético al 20 % (REACTIVO 26) PROCEDIMIENTOS A) PROTEINA C : La proteína C puede medirse por análisis cromogénico; se activa esta proteína por un activador específico derivado del veneno

de la serpiente

Agkistrodon contortrix. Se incuba plasma con este activador y la cantidad de 80



proteína C activada se mide por la acción enzimática sobre un sustrato cromógeno. La actividad enzimática resulta en la liberación del pNA (pnitroanilina) del sustrato cromógeno espectofotométrica a 405 nm.

y la pNA

se mide de forma

La absorbancia de la pNA es directamente

proporcional a la cantidad de proteína C activada. Se prepara una gráfica (estándar) mediante el registro de la actividad de la proteína C (%) para cada dilución

de

plasma

de

referencia

con

relación

a

su

absorbancia

correspondiente. Los resultados de plasmas problemas y plasmas testigos se leen en esta gráfica comparando por extrapolación con sus respectivas lecturas de absorbancia. (2) 1. Poner 25 µl de plasma problema en un tubo de ensayo de 12 X 75 y agregar 200 µl del activador de la proteína C (veneno de serpiente) conservado a temperatura ambiente, mezclar e incubar por 5 minutos a 37oC. 2. Añadir 200 µl de sustrato S-2366 conservado a 37oC, mezclar e incubar durante 5 minutos a 37oC. 3. Añadir

200 µl de ácido acético al 20 % para detener la reacción.

Transferir a una cubeta y leer la absorbancia, frente a blanco de agua destilada, a 405 nm. 4. Los resultados de la absorbancia se llevan sobre la línea de calibración para hallar la actividad de la proteína C. GRAFICO DE CALIBRACION PARA PROTEINA C: Con un plasma calibrador no diluido, que corresponde a una actividad cercana a 100 U/dl (100%), establecer diluciones con agua destilada que correspondan a valores de 75, 50 y 25 U/dl respectivamente. Procesar los 4 elementos (3 diluciones y el plasma sin diluir) como se ha descrito para la muestra de pacientes. Establecer la gráfica de calibración en papel milimétrico, llevando el resultado de la absorbancia sobre las ordenadas y las concentraciones (unidades) sobre las abscisas. (4)

81



B) PROTEINA S: La determinación funcional, basada en el efecto potenciador de la proteína S sobre la proteína C activada en su efecto inhibidor sobre el factor V, puede resultar interferida en pacientes con la mutación factor V Leiden. Esto da lugar a falso déficit funcional. Debido a este hecho, actualmente se recomienda la determinación inmunológica de esta proteína. VALORACION INMUNOLOGICA El método clásico es la determinación por ELISA. Los anticuerpos monoclonales específicos contra la proteína libre S permiten su determinación directa sin previo fraccionamiento del plasma. Actualmente

se han desarrollado métodos basados en la utilización de

anticuerpos monoclonales fijados a micropartículas de látex que permiten una rápida determinación de la proteína S superior a la medición en coagulómetro con resultados equivalentes a los obtenidos por ELISA.(4)

IDENTIFICACION DEL FACTOR V LEIDEN

El factor Va es inactivado por la proteína C activada (PCA) por proteólisis sobre los residuos de arginina en las posiciones 306, 506 y 679. La mutación del gen del factor V da lugar a la sustitución de la arginina 506 por glutamina, lo que bloquea el proceso de la inactivación, se denomina factor V Leiden, y es una de las causas mas frecuentes de trombofilia. Como prueba de escrutinio del factor puede utilizarse la prueba denominada resistencia a la proteína C activada, modificada mediante la adición de un exceso de plasma pobre de factor V (lo cual permite, además la realización de la prueba en pacientes bajo tratamiento anticoagulante oral). En caso de resultados patológicos o en el límite inferior del margen de referencia, se realizará el estudio genético de la presencia de la mutación por proteína C reactiva.

RESISTENCIA A LA PROTEINA C ACTIVADA BASADA EN EL FACTOR V

PRINCIPIO Y METODO: 82



La adición de la PCa al plasma del paciente da lugar a una prolongación del TTPa que en sujetos normales al menos duplica la duración del TTPa del mismo plasma sin dicha adición. En pacientes portadores de la mutación la prolongación es menor, especialmente en los homocigotos.

Existen equipos comerciales para la realización que aportan PCa, una mezcla de fosfolìpidos y sílice coloidal optimizada, plasma pobre en factor V, así como solución de CaCl2 para la realización del TTPa en

presencia y

ausencia de PCa.

EXPRESIÓN E INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO: El resultado se expresa como una simple razón entre el valor del TTPa en presencia de PCa y el del TTPa en su ausencia, que debe ser igual o superior a 2 (aunque cada laboratorio deberá establecer su margen de referencia). (4)

VALORES DE REFERENCIA El valor de normal de Proteína C por esta técnica se encuentra entre 60 a 150%. Aunque cada laboratorio debe establecer su propio valor de referencia. El valor normal de la proteína S en hombres 70 a 125 U/dl, en mujeres es ligeramente inferior, 55 a 110 U/dl, , en gestantes es aún menor, lo que se debe tener en cuenta para evitar falsos diagnósticos de déficit congénito. Como para otros parámetros cada laboratorio deberá establecer

su margen de

referencia. INTERPRETACION Las deficiencias adquiridas de proteína C se vinculan con CID, deficiencias de la vitamina K, enfermedades del hígado, terapéutica anticoagulante oral y después de cirugías. El déficit de proteína C se hereda de forma autosómica dominante. Los pacientes heterocigotos suelen contar con cifras de proteína C menores de 60% del valor normal, no todos para la deficiencia sufren de fenómenos vaso oclusivos y se han identificado algunos 83



factores que propician que ocurra trombosis en dichos sujetos: anovulatorios, embarazo, infecciones graves, lupus eritematoso, uso de algunos agentes quimioterapéuticos. Los homocigotos son muy poco frecuentes y presentan una clínica trombótica muy grave, la purpura fulminans neonatal, condición extrema que termina con la vida del recién nacido en pocos días; en ellos, la concentración de proteína C es menor al 1% del valor normal.(3) Los valores antigénicos de la proteína C

se determinan con técnicas

inmunológicas como ELISA o Inmunodifusión radial. Las deficiencias hereditarias de proteína S pueden implicar una disminución en la proteína o una proteína disfuncional. Las deficiencias adquiridas de la proteína S se vinculan con enfermedades del hígado, embarazo, CID, diabetes mellitus tipo1 y terapia anticoagulante oral. (1,2,) CUESTIONARIO 1. Describe las funciones de la proteína C activada 2. Investiga otras causas de trombofilia asociadas a la proteína C y S 3. Investiga las causas más frecuentes de trombofilia en nuestro país y su evaluación por laboratorio

BIBLIOGRAFIA: 1. J. Sans-Sabrafen, C. R. (2006). HEMATOLOGIA CLINICA. España: Elsevier. P 762,763. 2. McKenczie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno. P-765,766 3. Ruiz Arguelles, G. (2009). FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGIA. México. Panamericana.P-291

4. Vives Corrons Joan Lluis, A. b. (2006). MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO EN HEMATOLOGIA. Barcelona, España: MASSON, S.A. p- 642, 643,644

84



PRACTICA 15 VALORACION DE LA ANTITROMBINA III FUNDAMENTO La antitrombina es una glucoproteína plasmática de síntesis hepática, es el principal inhibidor de la trombina y de los factores Xa, IXa y XIa, mediante la formación de un complejo irreversible.(1) La antitrombina III (AT-III)

Es

responsable del 75% de la actividad inhibitoria sobre la trombina. (4) OBJETIVOS •

•

Comprender el fundamento del método Ejecutar correctamente la prueba


calibración •

Identificar la utilidad clínica de la medición de antitrombina III

EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS Material por equipo de 4 alumnos: • 32 Tubos de ensayo 10 X 75 mm •

4 Pipeta graduada de 5 ml

•

1 Gradilla

•

4 Pipetas Pasteur

•

4 Papel milimétrico


Centrifuga.

•

Coagulómetro

•


•

Cronómetro

•

Fotocolorímetro 405 nm. 85



•


•


•


•


•

Celdas para fotocolorímetro

• Sustrato cromogénico S-2238 (o similar) a una concentración de 0.75 mmol/l. (REACTIVO 27) • Solución de trombina de 35 µkat/l (REACTIVO 28) • Tampón Tris diluido. (REACTIVO 29) •

Acido acético al 20%.(REACTIVO 26)

PROCEDIMIENTO La actividad de la antitrombina III (AT-III) se puede medir con un análisis cromogénico. La acción poderosa de la AT-III en presencia de heparina se determina en una reacción pareada. La primera reacción incluye la incubación de plasma con un exceso conocido de trombina en presencia de heparina. La segunda reacción determina la actividad residual de la trombina sobre un sustrato cromógeno. La actividad de la AT-III da lugar a la liberación de pnitroanilina

(pNA)

del

sustrato

cromógeno,

la

cual

se

mide

espectrofotométricamente a 405 nm. La actividad residual de la trombina es inversamente proporcional a la concentración de AT-III

en el plasma. Se

prepara una curva de referencia (estándar) mediante el registro de la actividad AT-III (%) para cada dilución del plasma de referencia compara con su absorbancia correspondiente. Los resultados para plasma problema y plasma testigo se leen es esta curva con uso de sus respectivas lecturas de absorbancia. (2), 1. Se diluyen 50 µl de plasma problema en un tubo de plástico con 3 ml de tampón diluido. 2. Incubar 400 µl de la dilución a 37oC durante 3-4 minutos.

86



3. Añadir 100 µl de trombina (conservada a temperatura ambiente), mezclar e incubar 30 segundos a 37oC. 4. Añadir 300 µl de solución de sustrato (conservado a 37oC) mezclar e incubar a 37oC por 30 segundos. 5. Añadir 300 µl de ácido acético para detener la reacción. Transferir a una cubeta para leer la absorbancia, frente agua destilada, a 405 nm. El resultado de la lectura se lleva la línea de calibración para encontrar la actividad de la antitrombina. GRAFICA DE CALIBRACION. Con el plasma calibrador diluido (50 µl + 3.0 ml de tampón), que corresponderá a una actividad cercana a 100 U/dl (100%), dependiendo del valor del calibrador, establecer

cuatro nuevas diluciones

en tampón, que

equivaldrán a valores próximos a 75, 50, 25 y 0 U/dl, y procesar las cinco diluciones como se ha descrito para el plasma problema. Establecer la línea de calibración, en papel milimétrico, llevando los resultados de la absorbancia sobre las ordenadas y las concentraciones (unidades) sobre las abscisas. (3)

VALORES DE REFERENCIA Los valores normales oscilan entre 80y 120 U/ml, (aunque cada laboratorio deberá establecer sus valores de referencia).

INTERPRETACION La deficiencia hereditaria de la AT-III puede implicar una disminución en la proteína o una proteína disfuncional. Las deficiencias adquiridas de AT-III se vinculan

con CID, enfermedades del hígado (cirrosis), mujeres que toman

anticonceptivos orales ó reciben terapéutica con estrógenos

(2)

, con cierta

frecuencia las complicaciones tromboembólicas pueden ser fatales (embolia pulmonar masiva, trombosis venosa mesentérica, etc.), rara vez se presenta trombosis arterial.

(1)

Los valores antigénicos de AT-III se determinan con

técnicas inmunológicas como ELISA ó inmunodifusión radial (IDR). (2)

87



CUESTIONARIO 1. Investiga el mecanismo de acción a nivel molecular de la antitrombina III sobre los factores II, VII, IX y XI. 2. Describe otros mecanismos de regulación de la coagulación y su evaluación por laboratorio.

BIBLIOGRAFIA:

1. J. Sans-Sabrafen, C. R. (2006). HEMATOLOGIA CLINICA. España: Elsevier. P 762

2. McKenzie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno. P765 3. Vives Corrons Joan Lluis, A. b. (2006). MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO EN HEMATOLOGIA. Barcelona, España: MASSON, S.A. p- 642, 643 4. Ruiz Arguelles, G. (2009). FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGIA. México. Panamericana.p 291

88



PRACTICA 16 TIEMPO DE LISIS DE EUGLOBULINAS FUNDAMENTO Las euglobulinas son un grupo de proteínas del plasma que se precipitan cuando éste se diluye y se acidifica. Incluyen el fibrinógeno, la plasmina, el plasminógeno y los activadores del plasminógeno (activador tisular de plasminógeno -t-PA- y activador tipo urokinasa), FXII, precalicreína (PK) y cininógeno de alto peso molecular (CAPM). La lisis de euglobulinas es el tiempo que transcurre entre que los activadores del plasminógeno actúen sobre él y lo transformen en plasmina, y ésta lise la malla de fibrina. En condiciones normales esto ocurre después de dos horas. Si se presenta antes de este lapso, indica aumento de la actividad de los activadores del plasminógeno, traduciéndose en mayor actividad fibrinolítica en el plasma. (2) OBJETIVOS •

•

Comprender el fundamento del método Ejecutar correctamente la prueba


calibración •

Identificar la utilidad clínica del tiempo de lisis de euglobulinas

EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS Material por equipo de 4 alumnos: • 1 Gradilla • 4 Pipetas Pasteur • 4 Pipeta graduada de 10 ml. • 4 Varilla de vidrio de 3 mm de diámetro •

4 Papel filtro 89



•


•

16Tubos de ensayo 13 X 100 mm


Centrifuga.

•

Coagulómetro

•


•

Cronómetro

•


•


•

Pipetas automáticas de 100 µl

•

Pipeta automatizada de 10 µl

•

Puntas para pipetas automatizada

•

Cloruro de calcio 0.02 M (REACTIVO 30) ó Solución de trombina

•

Acido acético al 1% ó HCl 0.1M (REACTIVO 31)

• Amortiguador de Borato (REACTIVO 32) • H2O destilada

PROCEDIMIENTO El método manual se basa en la precipitación de las euglobulinas del plasma con ácido acético al 1%. La fracción de euglobulina precipitada se disuelve en solución amortiguada de borato y se agrega trombina para coagular la euglobulina. El coágulo producido actúa como sustrato para la plasmina, la cual se genera a partir del plasminógeno por los activadores del plasminógeno. El coágulo resultante se incuba a 37oC durante 2 horas; éste se observa a intervalos de 30 minutos para detectar evidencia de lisis. La lisis del coágulo de euglobulina es el tiempo requerido para su degradación completa. (3,1) 1. En un tubo 15 X 150 mm, se colocan 9 ml de H2O destilada se le agrega 0.1 ml (100 µl) de ácido acético o HCl para obtener una solución con un 90



Ph de 3.65 a 3.7.(preparar dos tubos, uno para plasma problema y otro para plasma normal) 2. Agregar 0.5 ml (50 µl) de plasma. 3. Colocar los tubos en hielo (4oC) durante 30 minutos con la finalidad de precipitar las euglobulinas. 4. Transcurrido ese tiempo, agitar los tubos y dividir el contenido de cada uno en dos tubos 13 X 100 mm. 5. Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos. 6. Decantar y secar las paredes del tubo. 7. Dejar los tubos en posición invertida sobre papel filtro durante 2 minutos para eliminar el exceso de humedad. 8. Disolver con 0.5 ml (50 µl) de solución amortiguada de boratos con ayuda de una varilla de vidrio. 9. Agregar 0.5 ml (50 µl) de cloruro de calcio o trombina (0.25 ml). 10. Mantener a 37oC y observa a intervalos de 10 minutos hasta observar la lisis completa del coágulo. Anotar el tiempo final.(1)

VALORES DE REFERENCIA Lisis completa después de 120 minutos.

INTERPRETACION Lisis de euglobulinas acortada, significa fibrinólisis anormal, por aumento de activadores del plasminógeno y la presencia de plasmina. Se debe considerar la posibilidad de hipofibrinogenemia, como causa del acortamiento. Lisis de euglobulinas prolongada, mayor a 16 a 18 horas, hace pensar en cuadros de hipofibrinólisis. La principal causa de error es la contaminación de los reactivos y la dificultad de la disolución del precipitado de la euglobulinas. Esto puede 91



ocasionar la falta de formación del coágulo y si no se tiene la suficiente vigilancia se puede confundir con una lisis anormal. (1) CUESTIONARIO 1. Describe el fundamento de la prueba de lisis de euglobulinas 2. Explica los dos principales mecanismos de activación del plasminógeno 3. Explica la interpretación clínica de la prueba BIBLIOGRAFIA 1. Korvich Lucia, S. A. (1990). MANUAL DE HEMOSTASIA Y TROMBOSIS. Argentina: grupo (CLAHT).P-367, 368 2. Martinez Murillo Carlos, Q. G. (2001). MANUAL DE HEMOSTASIA Y TROMBOSIS. México,D.F.: Prado. P-437 3. McKenczie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno. P765

92



PRACTICA 17 DETERMINACION DE ALFA-2-ANTIPLASMINA FUNDAMENTO La α2-antiplasmina es el principal inhibidor fisiológico de la plasmina. Es una glicoproteína en cuya molécula cabe distinguir dos regiones, una con residuos de lisina, capaz de unirse al plasminógeno o a la plasmina, y otra en la que se localiza el centro inhibidor propiamente dicho, que se une al centro activo de la plasmina. La α2-antiplasmina forma un complejo con la plasmina muy estable que se produce por una fuerte interacción entre la cadena ligera de la plasmina y el inhibidor. Cuando existe un exceso de plasmina da lugar al complejo inactivo α2-antiplasmina-plasmina y una cantidad de plasmina residual que actuando sobre un sustrato cromogénico, permitirá la liberación de la pnitroanilina (pNA). La cantidad de plasmina residual será mayor cuanto menor sea la cantidad de α2-antiplasmina), (1,3) OBJETIVOS •

•

Comprender el fundamento del método. Ejecutar correctamente la prueba


calibración. •

Identificar

la utilidad clínica de la medición de determinación deα

2-

antiplasmina. EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS Material por equipo de 4 alumnos: • 1 Gradilla • Pipetas Pasteur • Pipeta graduada de 5 ml. • 30 Tubos de ensayo 12 X 75 93



• Papel milimétrico • 8 Tubos de ensayo 13 X 100 mm Material biológico, equipo y reactivos por grupo: •

Centrifuga.

•

Coagulómetro

•


•

Cronómetro

•

Pipetas automáticas de 100 µl, 200 µl, 600 µl.

•


•

Fotocolorímetro.

•


•


•

Cubetas para Fotocolorímetro

•

Sustrato cromogénico S-2251 o similar , a una concentración de 35 mmol/l (REACTIVO 33)

•

Solución de plasmina de 2µkat/l en glicerol-HCl (REACTIVO 34)

•

Tampón Tris 0.05 mol/l de pH 7.4 (REACTIVO 35)

•

Acido acético al 20% (fracción de volumen) (REACRIVO 26)

PROCEDIMIENTO El inhibidor bioquímico de la plasmina es la α

2-antiplasmina.

En una primera

reacción se incluye la incubación del plasma con un exceso conocido de plasmina; y la segunda determinación la actividad de la plasmina residual sobre la actividad enzimática sobre un sustrato cromógeno. La actividad que desarrolla la plasmina da la liberación de pNA del sustrato cromógeno. La liberación de pNA se mide espectrofotométricamente a 405 nm. La actividad residual de la plasmina es inversamente proporcional a la concentración de la α2-antiplasmina. Se prepara una curva de referencia (estándar) por evidente actividad de la α2-antiplasmina (%) para cada dilución del plasma de referencia con

relación de su absorbancia correspondiente. Los resultados para los

plasmas problemas y plasmas control se leen en esta curva. (1)

94



1. Se diluyen 100 µl de plasma problema en un tubo de ensayo13X100 mm con 3.0 ml de tampón. 2. Incubar 600 µl de la dilución, a 37oC, durante 3 a 4 minutos. 3. Añadir 200 µl de plasmina (conservada a temperatura ambiente), mezclar e incubar durante 20 segundos a 37oC. 4. Añadir 200 µl de solución del sustrato (conservada a 37oC), mezclar e incubar durante 2 minutos a 37oC. 5. Añadir 100 µl de ácido acético al 20 % para detener la reacción. Transferir a una cubeta y medir la absorbancia, frente a agua destilada, a 405 nm. El resultado de la lectura se lleva sobre la línea de calibración para hallar la actividad de la α2-antiplasmina. En caso de disponer de fotocolorímetro con cubeta termostatada a 37oC, la metodología se realizará en la misma microcubeta e, inmediatamente tras la adición del sustrato, se medirá el incremento de la absorción por minutos (A/min) a 405 nm y no será necesario añadir ácido acético.(3) CURVA DE CALIBRACION. Con el plasma calibrador diluido (100 µl + 3.0 ml de tampón) (valor aproximado de 100 U/dl, dependiente del valor del calibrador), establecer nuevas diluciones con tampón próximas a 75, 50, 25 y 0 U/dl y procesar las cinco diluciones como se ha descrito para el problema. Establecer la línea de calibración, en papel milimétrico, llevando los resultados de la absorbancia

(o del incremento de A/min)

sobre las ordenadas y las

concentraciones (unidades) sobre las abscisas. (3) VALORES DE REFERENCIA Valores normales de α2-antiplasmina alrededor de 80 a 120 U/dl. (%) Cada laboratorio deberá establecer su propio margen. (3)

95



INTERPRETACION La medición de concentraciones circulantes de α 2-antiplasmina es útil en la vigilancia de la terapéutica fibrinolítica; una disminución en estos valores refleja la eficacia de la terapéutica. Las deficiencias adquiridas se vinculan en enfermedades hepáticas graves, CID y septicemia. En cambio es normal en pacientes con enfermedades cardiovasculares, renales o malignas. (2,1) CUESTIONARIO 1. Describe el fundamento de la prueba para determinación de alfa 2 antiplasmina. 2. Menciona como sucede el control fisiológico de la acción de la plasmina 3. Explica la interpretación clínica de la prueba.

BIBLIOGRAFIA: 1. J. Sans-Sabrafen, C. R. (2006). HEMATOLOGIA CLINICA. España: Elsevier. P 669,670. 2. McKenzie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno. P766. 3. Vives Corrons Joan Lluis, A. b. (2006). MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO EN HEMATOLOGIA. Barcelona, España: MASSON, S.A. p- 645,646.

96



PRACTICA 18 PRODUCTOS DE FRAGMENTACION DEL FIBRINOGENO Y LA FIBRINA FUNDAMENTO Los productos de la fragmentación (degradación) de la fibrina y el fibrinógeno (PDF) son fragmentos proteicos solubles formados por la acción proteolítica de la plasmina sobre la fibrina o el fibrinógeno. Los PDF y sus complejos dañan profundamente el proceso hemostático y son la causa principal de la hemorragia en la coagulación intravascular y la fibrinólisis. (1,2) OBJETIVOS •

•

Describir el fundamento del método Ejecutar correctamente la prueba


calibración •

Identificar

la utilidad clínica de los productos de degradación de la

fibrina y el fibrinógeno. EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS Material por equipo de 4 alumnos: •

12 Tubos de ensayo 12 X 75

•

1 Gradilla

•

4 Pipetas Pasteur


Centrifuga

•


•


•

Pipetas automáticas de 0 a 100 µl

•

Puntas para pipetas automatizadas 97



•

Prueba comercial de látex para determinación de PDF. (REACTIVO 36)

PROCEDIMIENTO En el método siguiente cada uno de los productos de degradación de la fibrina se identifica a través de una reacción antígeno-anticuerpo específica. Se mezclan partículas

de látex recubiertas con anticuerpo monoclonal

antihumano con una muestra del paciente. La sensibilidad del sistema de la prueba y la elección de la muestra varían según el fabricante. La mayor parte de los procedimientos requieren de la preparación de dos diluciones de cada muestra (1:2 y 1:8) lo cual permite la graduación de los resultados. (2) VALORES DE REFERENCIA Normalmente las personas tienen valores de los

PDF menores de

5µg/ml. La aglutinación macroscópica en ambas diluciones corresponde a un valor de los PDF superior a 20 µg/ml. Si se observa aglutinación macroscópica en la dilución 1:2, pero no en la 1:8, los resultados corresponden a un valor de los PDF superior a 5 µg/ml, pero inferior a 20 µg/ml; la ausencia de aglutinación macroscópica con cualquiera de las diluciones indica un valor de lo PDF menores a 5 µg/ml. (2)

INTERPRETACION Los padecimientos vinculados con

aumento de los PDF son la

coagulación intravascular diseminada (CID), las enfermedades hepáticas, la cirrosis alcohólica, las enfermedades renales, las enfermedades cardiacas, las complicaciones postquirúrgicas, el carcinoma, el infarto al miocardio, la embolia pulmonar, la trombosis venosa profunda y los estados de eclampsia.(2) CUESTIONARIO 1. Menciona cuantos y cuales son los productos de fragmentación del fibrinógeno y los de la fibrina 2. Describe la interpretación clínica de la prueba 98



BIBLIOGRAFIA: 1. Korvich Lucia, S. A. (1990). MANUAL DE HEMOSTASIA Y

TROMBOSIS. Argentina: grupo (CLAHT).P- 363 2. McKenczie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno. P-764,765.

99



PRACTICA 19 DETERMINACION DE DIMERO D (METODO DE AGLUTINACION) FUNDAMENTO Durante el proceso de la disolución del coágulo a cargo de la plasmina, ocurre la proteólisis de la fibrina y el fibrinógeno, produciendo fragmentos de diferentes tamaños (denominados fragmentos X, Y, E, D y dímeros D). Algunos de estos productos de degradación son comunes entre el fibrinógeno y la fibrina, y otros son específicos de la fibrina como el dímero D, contiene la porción de fibrina enlazada de manera cruzada con el factor XIIIa de la coagulación (factor estabilizador de la fibrina activado), estos son detectables hasta después de la estabilización y lisis de la fibrina, es decir representan la existencia del fenómeno de fibrinólisis. (2,3) OBJETIVOS •

•

•

Describir el fundamento del método Ejecutar correctamente la prueba cualitativa y semicuantitativa. Identificar la utilidad clínica de la determinación de Dímero D.


24 Tubos de ensayo 12 X 75

•

1 Gradilla

•

4 Pipetas Pasteur

•

Aplicadores

•

4 Placa de vidrio con fondo negro

Material biológico, equipo y reactivos por grupo: 100



•

Centrifuga.

•

Cronómetro

•


•

Puntas para pipetas automatizadas.

•

Plasma del paciente

•

Plasma normal Pueden ser citratado, con EDTA o heparina. Se pueden almacenar (20 – 25oC por 8 horas ó 2 – 8o C por 4 días ó

congelado hasta 2 meses) REACTIVOS • Reactivo de látex (anticuerpo monoclonal anti D-D humano) mantener a temperatura ambiente (20-25oC) (REACTIVO 37) • Buffer fosfatos. (REACTIVO 38) PROCEDIMIENTO En esta prueba aplicaremos método cualitativo y semicuantitativo de látex en placa para determinar productos de fragmentación de fibrina en plasma humano. En el cual se mezclan partículas de látex recubiertas con anticuerpos monoclonales dirigidos al dímero D con una dilución del plasma del paciente y si hay dímero D se produce aglutinación de las partículas de látex. La mayor parte de los procedimientos prueba una muestra no diluida y una diluida (1:2), lo cual permite realizar una proporción de los resultados. Las partículas de látex poseen un anticuerpo monoclonal altamente específico contra dímero D. (3) PRUEBA CUALITATIVA. 1. Depositar en una placa de fondo negro una gota (25µl) del reactivo de látex y añadir 10 µl de plasma problema no diluido. 2. Mezclar con un aplicador de plástico hasta que se distribuya uniformemente. 101



3. Rotar la placa suavemente por 2 minutos. 4. A los 3 minutos exactamente cheque la aglutinación bajo una fuerte fuente de luz (la prueba es imprecisa si se efectúa después de 3 minutos la lectura). PRUEBA SEMICUANTITATIVA. Preparar diluciones del plasma con buffer de fosfatos 1. Preparar en tubos de ensayo 12 X 75 mm una dilución 1:2, 1:4, efectuar más diluciones si se considera necesario. 2. Realizar el procedimiento de método cualitativo con las diluciones del plasma. VALORES DE REFERENCIA Valores Normales de dímero D menor a 0.5 µg/ml El título será la dilución más alta en la cual se presente aglutinación visible. TITULO

MUESTRA

CONC. APROX. DE

1:2

1:4

1:8

SIN DILUIR D-D (mg/L) 0

NORMAL

-

-

-

-

1

0.25 - 0.5

+

-

-

-

2

0.5 - 1.0

+

+

-

-

4

1.0 – 2.0

+

+

+

-

8

2.0 – 4.0

+

+

+

+

INTERPRETACION Valores

aumentados

sugieren

la

existencia

de

una

fibrinólisis

secundaria, es decir formación de fibrina intravascular y posterior fibrinólisis; se han observado en drepanocitosis, infección severa, enfermedad hepática, 102



coagulopatía en preclampsia. Los valores representativos de CID son habitualmente muy aumentados. Además se ha utilizado para diferenciar rápidamente entre hemorragia aracnoidea y una punción lumbar traumática, además como indicador predictivo de infarto agudo de miocardio. La cuantificación se ha usado para seguir terapia trombótica. También

se

puede

realizar

enzimoinmunoanálisis

(ELISA),

procedimiento que permite la determinación cuantitativa de Dímero D en plasma o suero. Es una prueba muy específica y sensible. Permite detectar estados protrombóticos iniciales, ayuda a realizar diagnóstico diferencial, control en tratamientos antitrombóticos, trombolíticos. (1, 3,4) LIMITACIONES. La presencia de factor reumatoide puede dar pruebas falsas positiva

CUESTIONARIO 1. Explica cual es el factor de la coagulación directamente implicado en la formación de los dímeros D 2. Explica las diferencias entre la llamada fibrinolisis primaria y fibrinolisis secundaria 3. Menciona algunas metodologías usadas para determinación de dímeros D

BIBLIOGRAFIA 1. Korvich Lucia, S. A. (1990). MANUAL DE HEMOSTASIA Y TROMBOSIS. Argentina: grupo (CLAHT).P-405, 4072. 2. Martinez Murillo Carlos, Q. G. (2001). MANUAL DE HEMOSTASIA Y TROMBOSIS. México,D.F.: Prado. P-436 3. McKenzie, S. (2000). HEMATOLOGIA CLINICA. Manual Moderno. P-765

4. Vives Corrons Joan Lluis, A. b. (2006). MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO EN HEMATOLOGIA. Barcelona, España: MASSON, S.A. p-646 103



APENDICE DE REACTIVOS 1. Oxalato de Amonio al 1% Oxalato de amonio 1.0 gr Agua destilada c.b.p. 100 ml Azul de metileno 0.2 ml Filtrar y conservar en refrigeración. Filtrar con frecuencia. Se debe desechar en cuanto aparece turbio. 2. Tromboplastina Càlcica ( se recomienda la que tenga un ISI lo mas cercano a 1) Reactivo Comercial 3. Solución Salina Isotónica Cloruro de Sodio 9.0 gr Agua destilada c.b.p. 1000 ml 4.

5.

Tromboplastina Parcial activada. Reactivo comercial. Solución de Cloruro de Cálcio 25 mmol/L Cloruro de cálcio 0.6937 gr Agua destilada 250 ml Llevar 0.6937 gr de cloruro de cálcio a 250 ml de agua destilada, incubar antes de usarse.

6. Plasma Citratado control. Reactivo Comercial. o puede ser preparado en el laboratorio. 7.

Sulfato de Bario. Reactivo comercial.

8. Hidróxido de Aluminio Reactivo comercial. Gel de Alúmina 1 gr Agua destilada 4 ml 9. Trombina humana 4 U/ml Reactivo comercial. Trombina humana de 3 a 5 U/ml. 104



10. Trombina 50 – 100 UNIH/ml. Reactivo comercial. Trombina humana 5000 U/ml Solución Madre de trombina 50 U/ml. Trombina humana 5000 U/ml 1.0 ml Solución salina isotónica 100 ml 11. Tampón veronal Owren de pH 7.35 (OBS) Dietilenbarbitúrico sódico Cloruro de sodio

5.875 gr 7.335 gr

• Colocar las sustancias mencionadas en un frasco volumétrico y disolverlos en aproximadamente 780 ml de agua destilada. • Añadir 215 ml de ácido clorhídrico 0.1 M. • Ajustar el volumen 1 litro de agua destilada. • Comprobar el pH y ajustarlo a 7.35 en caso necesario con HCl ó NaOH. 12. Plasma citratado de Trombina (calibrador) con un nivel de fibrinógeno funcional conocido. Reactivo comercial. 13.

Trombina 30 U/ml. Reactivo comercial.

14. Acido acético al 2%. Acido acético glacial 2 ml. En Agua destilada 98 ml 15. Urea 5M Pesar 75.05 gr de urea y llevar a 250 ml de agua destila. 16. Suspensión de caolín Suspensión de caolín al 4% Caolín 4 gr en Solución fisiológica 100 ml. 17. VVR veneno de víbora de Russell Reactivo comercial. 18.

Tromboplastina Parcia activada 1:8 Cefalina diluida en el mismo tampón veronal (reactivo 11).

19. Plasma estándar para factor VIII Preparado o plasma comercial 105



20. Plasma deficiente de factor VIII Reactivo comercial o puede ser obtenido de un donante cuyo nivel de factor VIII sea menos de 1 u/dl que no tenga anticuerpos anti VIII. 21. Tampón de suero salino de Owren. 200 ml de tampón barbitúrico de Owren (OBS) (REACTIVO 11) 800 ml de solución salina (0.9 % de cloruro de sodio) 22. Tampón de Tyrode de pH 6.5 8.0 g de NaCl 0.2 g de KCl 0.065 g de NaH2PO42H2O 0.415 g de MgCl2 6H2O 1.0 g de NaHCO3 Disolver en 900 ml de agua destilada y ajustar el pH a 6.5. Completar hasta 1 litro con agua destilada 23. Plasma calibrador para proteina C. Reactivo comercial. 24. Sustrato cromogénico S-2366 a una concentración de 1.5 mmol/l Reactivo comercial. 25. Activador de proteína C Procedente de veneno de víbora. Reactivo comercial. 26. Acido acético a 20 % Acido acético glacial Agua destilada

20 ml en 80 ml

27. Sustrato cromogénicoS-2238 o similar a una concentración 0.75 mmol/L. Reactivo comercial. 28. Solución de trombina de 35 µkat/l Reactivo comercial. 29. Tampón diluido Tris. Tampón concentrado Tris Tris 0.5 mol/l EDTA 75 mmol/l Heparina 30 u/ml Polietilenglicol 6000 la 10%.

106



Diluirlo 1:10 en agua destilada para obtener una solución de pH 8.4 30. Cloruro de calcio 0.02 M Cloruro de calcio anhidro Agua destilada c.b.p.

1.11 gr 500 ml.

31. Acido acético al 1% ó HCl 0.1 M Acido acético q.p. Agua destilada

1 ml 100 ml

32. Amortiguador de boratos Borato de sodio 1 gr Cloruro de sodio 9 gr Agua destilada c.b.p. 1000 ml El pH final debe ser de 9.0 33. Sustrato cromogénico S-2251 Reactivo comercial. 34. Solución de plasmina de 2µkat/l en glicerol, HCl Reactivo comercial 35. Tampón tris 0.05 m0l/l pH 7.4 Tris 605 mg Na Cl 0.9 gr Agua destilada 70 ml Ajustar pH con HCl 0.1 N y aforar a 100 ml 36.

Prueba para determinación de Productos de degradación de fibrina Prueba comercial de làtex para determinación de PDF.

37.

Reactivo para Dímero –D Reactivo en Látex (anticuerpos monoclonales anti-Dimero-D humano)

38.

Buffer fosfatos pH 7.5 Solución A (NaH2PO4 0,2 M): Disolver 27.6 g de NaH2PO4 . H2O en agua destilada, completando un litro. Solución B (Na2HPO4 0,2 M): 53.65 g de Na2HPO4. 7 H2O se disuelven en agua destilada, llevando el volumen final a 1 litro. Para pH 7.5 se agrega 80 ml de solución A con 450 ml de solución B y 500 ml de agua destilada 107



Manual De Hemostasia Fac. Bioanalisis. r392r

Overview 26281t

More details 6y5l6z

Related Documents 3h463d

Manual De Hemostasia Fac. Bioanalisis. r392r

Hemostasia 57616i

Hemostasia 57616i

Fac 6c6j4o

Fac 6c6j4o

Metodos De Hemostasia 5l6o2q

More Documents from "Daniel Mendoza" 273w42

Metodo Del Sifonado 433e4s

Manual De Hemostasia Fac. Bioanalisis. r392r

Consecuencias De La Quema De Restos De Cultivos Y Basura Para El Ambiente 4u2u40

1.1 Metales Ferrosos Y No Ferrosos 6l223l

Historia Cuantitativa.docx 1g1q6h

Ley De Poiseuille 1h6l1m