Cultivo Por Lote 6t345u

INFORME N° 01

ASIGNATURA:  LABORATORIO DE BIOPROCESOS. DOCENTE:  Ms. Augusto Castillo Calderón. INTEGRANTES:  Diestra Balta Jesús.  Domínguez Alba Alejandro.  Jimenez Gonzales Liliana.  Margarito Aguilar Lucas.  Sánchez Jara Milagros.

Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS

INFORME N° 01 TÍTULO: DESARROLLO DEL INÓCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE

Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126

RESUMEN El presente trabajo está referido al desarrollo del inóculo y cultivo celular por lote de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126,

desarrollado por alumnos en el laboratorio de

Bioprocesos. Para este trabajo se contó con cepas de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126, la cual fue tomada de un medio en el cual se encontraba inactivada. Se procedió a preparar un determinado medio de mantención, activación y fermentación. Seguido fue la activación y acondicionamiento de la cepa Saccharomyces cerevisiae. La experiencia consistió en obtener la cinética de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae. Este proceso se realizó en un matraz en Shaker, por 11 horas. Evaluando parámetros como consumo de sustrato (sacarosa), densidad óptica. Se observó cómo se va produciendo el crecimiento celular del Saccharomyces con los nutrientes de los medios y como va disminuyendo el sustrato, la Sacarosa (principal fuente de carbono). Y esto fue posible determinarlo mediante las lecturas de absorbancia (640 nm) en el espectrofotómetro y con las prueba de determinación de azúcares reductores – DNS, absorbancia de 540 nm. El monitoreo de la cinética de crecimiento de microorganismos es de gran importancia, en especial la de Saccharomyces cerevisiae, por sus tantas aplicaciones, ayudando así a obtener productos con la calidad o características deseadas u optimizar procesos.

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I.

INTRODUCCIÓN:

Las levaduras son importantes para la ciencia desde hace 200 años (recordemos por ejemplo, a Louis Pasteur, considerado padre de la enología moderna, y que realizó grandes descubrimientos acerca de las fermentaciones). La importancia tecnológica de estos microorganismos es evidente: llevan a cabo reacciones de importancia crucial para la elaboración de productos como el vino o la cerveza. Sin embargo, con el desarrollo de la genética, la biología molecular y el estudio de los genomas, las levaduras se han convertido en herramientas de experimentación en laboratorio. Ejemplo de ello es que la levadura Saccharomyces cerevisiae que se utiliza para la elaboración del pan, la cerveza y el vino ha sido el primer organismo eucariota completamente secuenciado, en un proyecto llevado a cabo por un programa internacional. Las industrias que utilizan esta levadura para la alimentación o para la producción de medicamentos o de vacunas estaban interesadas en obtener los resultados de esta secuencia para intentar mejorar sus procedimientos de producción. Al hablar de Saccharomyces, es inevitable pensar en la gran utilidad práctica de la levadura en la vida del hombre, desde tiempos antiguos. Fue tal vez un descubrimiento casual de nuestros predecesores y que actualmente agradecemos profundamente. La realidad de la alimentación que conocemos actualmente, fermentada, es una realidad histórica, basada en el tipo de agricultura que implementaron nuestros antepasados mesopotámicos. Pero en muchas partes del mundo los seres humanos controlan fermentaciones de productos sólidos o líquidos, y las especies de levaduras implicadas no son siempre las mismas.

Saccharomyces cerevisiae es un hongo ambiental levaduirforme, unicelular, sus células son ovoides y se reproduce por gemación, miden entre 5 y 10 micras, vienen estado aislado hasta que adquieren el tamaño necesario para dividirse, taxonómicamente pertenece al Phylum Ascomycota, a la clase Hemiascomycetes, del orden Saccharomycetales y de la familia de las Sacchacromycetaceae. Su metabolismo le permite crecer tanto en condiciones de aerobiosis como de anaerobiosis (Feldmann, 2005).

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Además posee alta actividad metabólica, por lo que en la fase aerobia se caracteriza por la producción de biomasa y la fase anaerobia generalmente por la producción de etanol, fermentando alrededor del 90% del medio. Es importante la fase aeróbica, ya que la levadura presenta una fase de adaptación para producir las enzimas necesarias (tipo invertasa) que le permitan metabolizar el sustrato y así alcanzar la biomasa adecuada para la fermentación en donde la mayor parte del carbono se emplea como energía y sólo el 2% se asimila como material celular (Sánchez, 2010).

En el transcurso de la fermentación hay 4 fases de crecimiento: 1) lag o de adaptación en el que no hay incremento en el número de células, sino que se adaptan al medio y en ocasiones sintetizan enzimas o componentes estructurales; 2) exponencial o log, donde las células se reproducen sin limitación de de sustancias nutritivas a velocidad máxima y toman sustratos, excretando productos metabolizados; 3) estacionaria, que es la estapa donde el crecimiento celular desciende o para completamente ya que se han transformado las sustancias nutritivas, el sustrato se ha metabolizado y las condiciones el medio se han modificado y la 4) muerte, en donde las células mueren, debido a que su reserva de energía se ha agotado (Sánchez, 2003).

Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de fermentación (Feldmann, 2005). En esta práctica se monitoreó el crecimiento de Saccharomyses cerevisiae en un medio determinado. La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar.

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II.

OBJETIVOS: 2.1

OBJETIVOS GENERALES 1. Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces, empleando una cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126.

2.2

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Diseño y preparación del medio de cultivo. 2. Activación celular y desarrollo del inóculo 3. Determinación de la cinética de crecimiento de la Biomasa - Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126. 4. Determinación de la cinética de consumo de la fuente de carbono, sacarosa. 5. Determinación de la cinética de producción de etanol. 6. Determinación del µM y los rendimientos del nutriente limitante en células y en etanol (YX/S, YP/S.), además de las respectivas productividades. 7. Evaluación y control del valor del pH mediante tampón citrato.

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III.

MARCO TEÓRICO CRECIMIENTO DE BIOMASA EN UN CULTIVO POR LOTES

CRECIMIENTO MICROBIAL Para la obtención de datos confiables, la evaluación del crecimiento microbial requiere la normalización de métodos experimentales. En un cultivo por lotes, después de proveer las sustancias nutritivas al fermentador y suministrar los materiales y la energía requeridos para la síntesis de biomasa, se inocula el medio con una cantidad determinada de células viables con lo que el cultivo se desarrolla sin intercambio de materiales con los alrededores, excepto por la transferencia de gases tales como aire, dióxido de carbono e hidrógeno. El desarrollo de un cultivo por lotes bajo condiciones fisicoquímicas adecuadas en un sustrato simple y homogéneo (cSi), libre de gradientes de concentración y de sustancias inhibitorias, donde las células se reproducen a intervalos regulares, puede representarse mediante una curva típica, en la cual se observan las diferentes etapas representativas de los cambios de la biomasa (X) y de su ambiente. Curva de crecimiento microbial

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS El período de latencia (lag) (A), es el período de adaptación de la célula a los cambios de su ambiente fisicoquímico. Puede ser el tiempo requerido para desactivar un inhibidor presente en el medio, o el tiempo de germinación de un inóculo de esporas. En el período de crecimiento acelerado (B), la velocidad aumenta desde cero hasta un valor máximo. En el período de crecimiento exponencial (C), las células se reproducen, en un medio sin limitación de sustancias nutritivas, a la máxima velocidad compatible con el conjunto de condiciones existentes. En el período de desaceleración (D), la velocidad disminuye al limitarse la disponibilidad de sustancias nutritivas. El período estacionario (E) se produce cuando se agota una sustancia nutritiva. El período de muerte o decaimiento (F) ocurre en aquellos cultivos, en condiciones de inanición, por la formación de enzimas autolíticas. En algunos cultivos puede apreciarse un período de crecimiento críptico, producido por las sustancias nutritivas liberadas por el citoplasma de las células lisadas.

VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO En los procesos de fermentación los microorganismos desarrollan su actividad vital en medios de elevada complejidad. El agente responsable de la transformación es una célula viva que asimila diversos materiales, se reproduce y produce otras sustancias, algunas de interés económico. Uno de los aspectos más importantes del estudio de la cinética de estos procesos es la selección de los métodos analíticos seguros para evaluar confiablemente las sustancias consumidas y producidas por el microorganismo y la variación de su concentración con el tiempo.

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS La concentración de células en el medio constituye una medida adecuada de la concentración del sistema enzimático responsable de la transformación. Por esta razón las velocidades crecimiento, consumo de sustrato y de formación de producto, generalmente se expresan como velocidades específicas referidas a la concentración de células activas. Velocidad específica de crecimiento

Velocidad específica de consumo de sustrato

Velocidad específica de formación de producto

INFLUENCIA DE ALGUNAS CONDICIONES AMBIENTALES SOBRE LA VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO Temperatura La temperatura afecta la velocidad de las reacciones celulares, la naturaleza del metabolismo, los requerimientos nutricionales y energéticos y la composición de la biomasa. Generalmente los microorganismos crecen en un intervalo de temperatura ambiente entre 25 y 30ºC, aunque existen microorganismos que se desarrollan a temperaturas inferiores a 0ºC y otros a temperaturas superiores a 93ºC. El requisito fundamental es la presencia de agua líquida. En la Antártida existen bacterias que se reproducen a 7ºC, pero que se desarrollan a mayor rapidez a temperaturas entre 20 y 30ºC, (Pelczar, 1977). En la siguiente tabla se presenta una clasificación de los microorganismos en función de la dependencia de la velocidad de crecimiento con la temperatura.

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS Temperatura (ºC) Grupo

Mínimo

Óptimo

Máximo

Termófilos

40 – 45

55 – 75

60 – 80

Mesófilos

10 – 15

30 – 45

35 – 47

Psicrófilos

-5 – 5

15 – 18

19 – 22

-5 – 5

25 – 30

30 – 35

obligados Psicrófilos facultativos

Energía de activación En el intervalo adecuado de temperatura, se estimula inicialmente el crecimiento de los microorganismos. Cuando es demasiado alta, los destruye. La ecuación de Arrhenius constituye una hipótesis apropiada para describir el efecto de la temperatura sobre el crecimiento:

Donde, m

EF

es la velocidad efectiva de crecimiento que es igual a la velocidad de síntesis

menos la velocidad de muerte; A, AD son los factores de frecuencia; EA es la energía de activación para el crecimiento, y es la energía necesaria para llevar las moléculas a un estado energético en el cual puedan reaccionar; ED es la energía de activación para la muerte térmica; R es la constante de los gases, y T la temperatura absoluta. La aplicación de la ecuación de Arrhenius a un proceso microbiológico es un procedimiento cinético formal. Sin embargo, la complejidad del crecimiento microbial, entendido como una secuencia de reacciones, permite prever desviaciones de este comportamiento.

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS pH En muchos procesos de fermentación aerobia y anaerobia, el pH del medio de cultivo cambia como respuesta a la actividad microbial: se genera H+ durante la demanda de NH4+; se consume H+, en el metabolismo de NO3- y en la utilización de aminoácidos como fuente de carbono. Estos cambios muestran la necesidad de determinar y controlar el pH de un cultivo, usualmente mediante la adición de ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y una de las bases: hidróxido de sodio, de potasio o de amonio; al medio. Se prefiere el amoníaco gaseoso en lugar del hidróxido de amonio, por la posibilidad de contaminación de éste con esporas bacterianas. La concentración del ion hidrógeno puede afectar en gran medida el crecimiento celular y, si el pH no está regulado, se debe considerar como un factor inhibitorio

MEDIOS DE FERMENTACION La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Como ya se explicó, los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varían considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distinción de las siguientes categorías de componentes: a. Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que están representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg; b. Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro; y c. Factores de crecimiento, que están constituidos generalmente por componentes orgánicos suministrados en baja concentración y que no son sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporados a estructuras celulares y de función

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS metabólica específica, como vitaminas, algunos aminoácidos, ácidos grasos no saturados, etc.. Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza química de los componentes, en 1. Medios sintéticos o medios químicamente definidos, y 2. Medios complejos en cuya composición intervienen sustancias de origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son químicamente indefinidas y de composición variable. En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer lugar el diseño para tratar a continuación la formulación y optimización de los mismos. Diseño El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas. Otros aspectos que son también importantes se refieren a todos los procesos y operaciones previos y posteriores a la etapa de fermentación y al conocimiento de los mecanismos bioquímicos que regulan la formación de algunos productos. Requerimientos nutricionales Los requerimientos nutricionales están determinados por el tipo de metabolismo celular, ya sea autotrófico, que corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del C02 como las algas y algunas bacterias, y los heterotróficos que necesitan compuestos orgánicos como fuente de carbono. Otro factor esencial está determinado por las condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. El 02 es uno de los oxidantes más comunes en el metabolísmo energético. En la ausencia del 02, el N03 o S04 son utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias. Las bacterias metanogénicas son auxótrofos anaerobios que utilizan H2 para reducir el C02 a CH4 para obtener energía. Otras protistas obtienen su energía, en condiciones

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS anaerobias por reacción de óxido-reducción realizadas sobre compuestos orgánicos. Las fuentes de carbono cumplen también el rol de ser fuente de energía. Otro requerimiento nutricional está constituido por las fuentes de nitrógeno que pueden ser de naturaleza inorgánica u orgánica. El nitrógeno es utilizado para la biosíntesis de proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular. Para la síntesis de proteína se requieren en general L-aminoácidos, aunque también son necesarios algunos aminoácidos de la serie D como D-alanina y D-aspártico para su incorporación a la pared de las células. En algunos casos se requieren también póptidos de histidina. Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son suministrados en forma de P04H y S04 (o aminoácidos azufrados). El fósforo se incorpora en ácidos nucleicos, y polímeros celulares. El S es asimilado para la síntesis de aminoácidos azufrados, y además se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes. Los requerimientos de K y Mg son también esenciales. Una parte importante del primero está unida al RNA de manera que los requerimientos de K aumentan con los factores que influyen en el aumento del RNA de las células, como la velocidad de crecimiento. El ión K actúa como coenzima y probablemente actúa como esencial para la estabilidad de los ribosomas y actua como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y sulfato. Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categorías: a. Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn y b. Los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn, e I. En general los requerimientos de trazas de elementos son conocidas cualitativamente. A veces es difícil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente está presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Los requerimientos de éstos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "strees", como por ejemplo por aumento de temperatura por encima de un valor óptimo. Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos aminoácidos y vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, ácido pantotético, niacina, etc., que representan para muchas bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS crecimiento celular. La mayor parte de las vitaminas son constituyentes de co-enzimas. Otros factores de crecimientoson las purinas, poliaminas, putrescinas, cte. En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, a parte de los nutrientes requeridos por los microorganismos y que representan los requerimientos específicos del proceso considerado. Materias primas fundamentales Los componentes empleados en la industrias de fermentación son generalmente complejos, siendo importante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad y la estabilidad en su composición química. Si tenemos en cuenta que el costo de los nutrientes representa entre al 10 y el 60% del costo total de mucho productos obtenidos por fermentación, se hace prioritario disminuir el costo de los medios. Las materias primas más importantes corresponden a fuentes de carbono y de nitrógeno. Las fuentes de carbono pueden ser: 1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidón, dextrina; 2) Alcoholes como el glicerol y manitol; y 3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros. Son muy importantes también por su disponibilidad y costo reducido otras materias primas que contienen hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas, suero de queso, etc. También se pueden emplear otros subproductos o efluentes de industrias que por su contenido en fuentes de carbono son interesantes para algunos procesos como las vinazas de destilería, alpechín y residuos sulfiticos, que son sin embargo solamente útiles para procesos de producción de biomasa destinados al consumo animal, ya que si bien contienen hidratos de carbono y otras fuentes de carbono asimilables por los microorganismos, también contienen muchas impurezas que impiden su utilización en otros procesos por las dificultades y costo elevado que presentan las operaciones de separación y purificación de los productos. Las fuentes de nitrógeno de naturaleza inorgánica más comunes son el amoníaco o las sales de amonio. Las orgánicas están representadas por varios productos, como ser: 1) Hidrolizados de proteínas (Peptonas) que son obtenidas por hidrólisis ácida o enzimática de distintas fuentes proteicas como carne de diferentes órganos y animales, pescado, caseína, gelatina, harina de soja, algodón, girasol, etc.. Mediante ajuste de la relación enzima-sustrato y variando tiempo de hidrólisis es posible variar el tamaño de la cadena de polipéptidos. Aparte de su función como fuente nitrogenada, las peptonas aportan algunas vitaminas y sales inorgánicas como fosfatos y suministran también algunos micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu. 2) Extracto de

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS carne, que se obtiene por extracción acuosa y concentración posterior variando su tipo de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extracción y temperatura de la misma. 3) Extracto de levadura, que es disponible en forma de pasta o polvo, y puede ser obtenida mediante autólisis o plasmólisis de la levadura, es básicamente una mezcla de aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en H2O y carbohidratos. 4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada y 5) "Cornsteep", el agua de maceración de la industria del maíz tiene mucha importancia por su utilización como componente esencial de los medios para la producción de varios antibióticos y enzimas. Es muy importante también la correcta elección de una determinada fuente cuando se presentan varias alternativas posibles. En este sentido deben considerarse los costos, la disponibilidad y el problema de impurezas que puede acompañar a las distintas materias primas utilizadas.

Formulación La formulación tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir debe establecer las concentraciones de cada componente a ser utilizadas. Una primera aproximación con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la composición de biomasa del microorganismo a ser empleado. Una composición elemental y típica de la biomasa es (en % de peso seco): Carbono, 46-48; Nitrógeno, 7-12; Fósforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%. Es decir, que si queremos formular un medio para producir una determinada cantidad de biomasa debemos promover las distintas fuentes que aseguren como mínimo las cantidades de elementos que deben ser suministrados. La composición de un medio mínimo basado en este principio, que además tiene en cuenta los requerimientos de las fuentes de energía. Por el conocimiento de la estequiometría de crecimiento y de formación del producto, es posible formular adecuadamente un medio. Aunque este tema se tratará en el capítulo 5 es conveniente adelantar aquí algunos aspectos necesarios. En general podemos escribir para cualquier proceso de fermentación: Fuente de C + Fuente de N + 02 + Minerales + nutrientes específicos ---> biomasa + productos + C02 + H20.

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS Conservación de la calidad nutriente Como ya dijimos anteriormente, los medios de fermentación utilizados en la industria son casi siempre complejos y a menudo con sólidos en suspensión, de manera tal que los cambios que se producen durante la esterilización pueden ser importantes. A veces puede haber modificaciones beneficiosas o perjudiciales dependiendo del tiempo de esterilización. Existen casos en los cuales si se prolonga la esterilización 50 a 60 min se producen pérdidas de rendimiento que llegan hasta el 65% con respecto al medio normal. En ciertos casos cuando el tiempo es solamente de 15-20 min se puede producir un efecto beneficioso. La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los componentes de un medio, durante la esterilización por calor, dependerá no solamente de la naturaleza de los componentes sino también de la temperatura, duración del calentamiento, pH del medio, y de la agitación. Un ejemplo típico de interacción es la reacción de Maillard que tiene lugar entre los grupos carbonilos de los azúcares con los grupos amino de proteínas, aminoácidos, etc. Se forman así productos de condensación con lo cual se inactivan significativas cantidades de carbohidratos y nitrógeno amínico. Por ese motivo es necesario que los carbohidratos se esterilicen por separado de los compuestos nitrogenados orgánicos. Las sales de NH4+ se deben autoclavar a pH 7 o menor, si no el amonio se volatiliza. En medios químicamente definidos se puede observar pérdida importante de magnesio, potasio, amonio, sodio y fosfatos por precipitación de sales poco solubles como MgNH4PO4, MgKP04 y MgNaP04. Es importante por lo tanto autoclavar las sales de calcio y magnesio aparte de los fosfatos. Los aminoácidos y factores de crecimiento son muy lábiles al calor. Entre los aminoácidos, el triptofano, glutamina, asparagina, y entre las vitaminas hidrosolubles, la tiamina, riboflavina y piridoxina son las más susceptibles de sufrir descomposición. En todos estos casos es aconsejable disolverlas separadamente en pequeños volúmenes de H2O y luego esterilizarlas por filtración. Como ya dijimos es fundamental, además de esterilizar correctamente los medios, conservar al máximo la calidad nutriente de los mismos. En la misma forma que la inactivación de microorganismos puede ser considerada una reacción cinética de primer orden, también la destrucción de algunos compuestos sensibles al calor puede ser tratada en la misma forma.

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS LEVADURAS Levadura es un nombre genérico que agrupa a una variedad de hongos, incluyendo tanto especies patógenas para plantas y animales, como especies no solamente inocuas sino de gran utilidad. De hecho, las levaduras constituyen el grupo de microorganismos mas íntimamente asociado al progreso y bienestar de la humanidad. Las levaduras tienen importancia económica, social y de salud en la culturahumana. A menudo, las levaduras han sido referidas como los primeros organismos “domesticados”, debido a que la fermentación para la producción de vinos representa, probablemente, la primera biotecnología Algunas especies de levaduras del género Saccharomyces son capaces de llevar a cabo el proceso de fermentación, propiedad que se ha explotado desde hace muchos años en la producción de pan y de bebidas alcohólicas, y que a su vez ha inspirado un sinnúmero de obras de arte que ensalzan al Dios del vino y a aquellos que disfrutan su consumo. Desde el punto de vista científico, el estudio de las levaduras como modelo biológico ha contribuido de manera muy importante a elucidar los procesos básicos de la fisiología celular. Dentro del género Saccharomyces, la especie cerevisiae constituye la levadura y el microorganismo eucariote más estudiado. Este organismo se conoce también como la levadura de panadería, ya que es necesario agregarla a la masa que se utiliza para preparar el pan para que este esponje o levante; de hecho el término levadura proviene del latín levare, que significa levantar.

SACCHAROMYCES CEREVISIAE Saccharomyces cerevisiae es una levadura, un hongo unicelular, del grupo de los ascomicetos. Este grupo incluye a más de 60000 especies, entre ellas las trufas, las colmenillas o el Penicillium, el hongo que produce la penicilina, pero también a hongos patogénicos tanto de plantas como de animales, el más conocido de los cuales es Candida. En la naturaleza se encuentra sobre sustratos ricos en azúcares o en los exudados y savias dulces de algunas

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS plantas. El término "levadura" (de "levare" en la acepción de subir o levantar) remite a la experiencia visual de la masa del pan que se "levanta" cuando se añade levadura a la harina.

Saccharomyces cerevisiae es un hongo ambiental levaduirforme,

unicelular,

sus

células

son

ovoides y se reproduce por gemación, miden entre 5 y 10 micras, vienen estado aislado hasta que

adquieren

el

tamaño

necesario

para

dividirse, taxonómicamente pertenece al Phylum Ascomycota, a la clase Hemiascomycetes, del orden Saccharomycetales y de la familia de las Sacchacromycetaceae. Su metabolismo le permite crecer tanto en condiciones de aerobiosis como de anaerobiosis (Feldmann, 2005).

Además posee alta actividad metabólica, por lo que en la fase aerobia se caracteriza por la producción de biomasa y la fase anaerobia generalmente por la producción de etanol, fermentando alrededor del 90% del medio.

Es importante la fase aeróbica, ya que la levadura presenta una fase de adaptación para producir las enzimas necesarias (tipo invertasa) que le permitan metabolizar el sustrato y así alcanzar la biomasa adecuada para la fermentación en donde la mayor parte del carbono se emplea como energía y sólo el 2% se asimila como material celular (Sánchez, 2010).

Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de fermentación (Feldmann, 2005).

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS La fisiología de las levaduras es definida como el entendimiento de su crecimiento y metabolismo. En términos generales explica cómo las levaduras interactúan con su medio biótico y abiótico, específicamente explica cómo las levaduras se alimentan, metabolizan, crecen, se reproducen y finalmente mueren. La biotecnología de levaduras se define como el uso de la fisiología de levaduras (Walker, 1998). A continuación se hará una revisión sobre los aspectos más importantes sobre la nutrición y metabolismo de las levaduras.

NUTRICIÓN DE LEVADURAS El término nutrición de levaduras se refiere a cómo las levaduras se alimentan; de forma específica involucra dos aspectos: requerimientos nutricionales y la adquisición de los nutrientes. El entendimiento de los requerimientos nutricionales y las estrategias de adquisición de nutrientes, junto con la regulación del transporte de nutrientes es importante no sólo para el cultivo de las levaduras en el laboratorio, sino también para la optimización del proceso de fermentación industrial.

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES Los compuestos orgánicos e inorgánicos en un medio de cultivo desempeñan funciones de activadores o inhibidores para el crecimiento, su efecto dependerá de su naturaleza y de las concentraciones en el medio de cultivo. Cada levadura presenta requerimientos nutricionales diferentes, sin embargo, es posible generalizar sobre sus requerimientos de la siguiente forma: carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo, oligoelementos y factores de crecimiento. CARBONO Las levaduras son organismos quimioorganotróficos porque obtienen la energía y el carbono de compuestos orgánicos. Estos compuestos son generalmente azúcares, de los cuales la glucosa es la más empleada en levaduras; sin embargo, no es el azúcar más efectivamente metabolizable para todas ellas, debido a queno se encuentra libre de forma natural en sus habitats. Además, la glucosa generalmente ocasiona efectos inhibitorios y de represión en la asimilación de otros azúcares. Las levaduras pueden asimilar azúcares (hexosas, pentosas,

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos, polisacáridos), alcoholes, ácidos orgánicos, ácidos grasos, hidrocarburos y compuestos aromáticos. Una pequeña proporción (5%) de sus requerimientos de carbono pueden ser incorporados del dióxido de carbono. GLUCOSA La glucosa es un monosacárido con fórmula empírica C6H12O6, la misma que la fructosa pero con diferente posiciones relativa de los grupos–OH y O=. Es una hexosa, es decir que contiene seis átomos de carbono y es una aldosa, esto es el grupo carbonilo está en el extremo de la moléculas, es una forma de azúcar quese encuentra libres en las frutas y en la miel. SACAROSA La sacarosa tiene la fórmula C12H22O11 que pertenece a un grupo de hidratos de carbono llamados disacáridos. Es el azúcar normal de mesa, extraída de la remolacha azucarera o de la caña de azúcar, es soluble en agua y ligeramente soluble en alcohol y éter. SULFATO DE AMONIO El sulfato de amonio y sulfato diamónico son las sales más utilizadas como fuente de nitrógeno, ya que aportan, al mismo tiempo, azufre y fósforo que la célula necesita. El ión amonio es empleado por las levaduras para la formación del ácido glutámico, que actúa como donador de un grupo amino para la síntesis de otros aminoácidos para la célula (Aguilar, 1998). La asimilación y utilización de nitrógeno amoniacal y nitrógeno amino pueden variar según la levadura utilizada, ya que puede ser afectada por numerosos factores como la aireación y la concentración de glucosa, entre otras. Por otro lado, el ion sulfato aporta el azufre necesario para maximizar el crecimiento de las levaduras. FOSFATO DE AMONIO El fosforo es esencial para las células de levaduras para su incorporación en moléculas estructurales, los ácidos nucleicos y sus metabolitos fosforilados. Levaduras también pueden almacenar fosforo en la vacuola, en forma de fosforo ortofofato polimérico común mente disponible para la levadura en forma de ortofosfato inorgánico. Que metabolizan muy rápidamente para el transporte de nucleótidos trifosfato, en la levadura se produce contra un

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS transporte de concentracion en contra de un gradiente de concentración y por lo tanto se activa. También depende de la presencia en la de un sustrato fermentable exógeno como la glucosa, pero sustratos respirables como acetato o etanol que no son compatibles con la absorción de fosfato. En s. Cerevisiae, al menos tres sistemas se cree que translocan ortofosfato. En s. cerevisiae es concebible que los bajos ylos sistema de alta afinidad pueden operar simultanea mente dependiendo sobre la disponibilidad de fosfato, de hecho la absorción de fosfato pueden ser controlados por la concentración de ortofosfato intracelular.

ADQUISICIÓN DE NUTRIENTES Para que las levaduras puedan cumplir con sus funciones, no solo es importante que en el medio de cultivo se tengan los compuestos necesarios, sino que la levadura sea capaz de adquirir estos nutrientes del medio y guarde un equilibrio con el mismo. El transporte de azúcares en levaduras ha sido estudiado por muchos años, debido a la importancia biotecnológica de esto en fermentaciones industriales. Así, se conoce que la velocidad de formación de etanol está limitada por la velocidad de transferencia de azúcares al interior de la célula (Walker, 1998).

Las levaduras, generalmente, transportan preferentemente la glucosa; sin embargo, las membranas celulares no son permeables a azúcares, por lo que existen varios mecanismos para la translocación de la glucosa y otros sacáridos; por ejemplo: en S. cerevisiae se conocen 20 transportadores de hexosas que difieren en su abundancia y afinidad para ciertas hexosas (Kruckeberg, 1996). Aunque cada levadura es diferente se pueden realizar ciertas generalidades con respecto al transporte de azucares: a. La glucosa es tomada en contra de un gradiente de concentraciones. b. Los transportadores de glucosa son estéreo específicos para ciertas hexosas, y pueden transportar glucosa, fructosa y manosa. c. El transporte de glucosa alcanza el equilibrio y no es acumulativo. d. Los transportadores de glucosa facilitan la difusión libre.

pág. 20

Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS e. Durante el transporte no hay consumo de energía. f.

La fosforilación acompaña a la glucosa al entrar a la célula.

TRANSPORTE DE NITRÓGENO Las levaduras no pueden fijar el nitrógeno atmosférico, pero son capaces de trasportar y utilizar compuesto de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno generalmente tienen una función anabólica de proteínas estructurales y enzimas funcionales. Algunas fuentes de nitrógeno pueden ser catabolizadas inmediatamente a la entrada de la célula. Las fuentes favorables de nitrógeno para maximizar el crecimiento de levaduras son los iones de amonio, glutamato y glutamina. Todas las levaduras son capaces de usar el amonio como una fuente de nitrógeno y sales de amonio.

pág. 21


IV.

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL: 4.1

DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas.

“COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN, ACTIVACIÓN Y CULTIVO PARA Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 “ 4.1.1

MEDIO SÓLIDO DE MANTENCIÓN (YM sólido)

TABLA 01: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (50 mL) Peso (g)

Nutriente

Concentración (g/l)

Extracto de Levadura

3

0.15

Peptona

5

0.25

Extracto de Malta

3

0.15

Agar

20

1.00

Glucosa

10

0.50

Para 50 mL

pág. 22

Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS 4.1.2

MEDIO DE ACTIVACIÓN

TABLA 02: Concentración de Nutrientes para el medio de activación (25 mL) Peso (g)

Nutriente


Glucosa

10

0.25

Extracto de levadura

3

0.075

Extracto de malta

5

0.125

Solución de sales

5 ml/L

0.125 ml

Para 25 mL

T 35°C, N 200 rpm

4.1.3

MEDIO DE FERMENTACIÓN 

Para un volumen de medio: 30% del volumen del matraz.



Para una concentración final: g/l.

TABLA 03, 04 y 05: Concentración de Nutrientes para el medio de fermentación (300 mL) TABLA 03

Nutriente Extracto de Levadura Solución de sales Tampón Citrato pH 4,5


Peso (g) Para 100 mL

1.8

0.18 g

10ml/L

1ml

100 ml/L

10 ml

pág. 23


Hallando ∆𝑿 ∶ Tenemos como dato: S’o=5.36 Si: 𝑆𝑜 = 𝑆ó 𝑥 1.5 → 𝑆𝑜 = Si : Y º X S 

𝑆′𝑜 1.5

→ 𝑆𝑜 =

5.36 1.5

= 3.57

X X , Entonces; So  º S Y X

S

∆𝑿 = 𝟑. 𝟓𝟕 𝒙 𝟎. 𝟓𝟔𝟏𝟒 = 𝟏. 𝟗𝟗𝟗 ≈ 𝟐 𝒈/𝑳 (Utilizando los datos de la sacarosa como fuente de C)

TABLA 04

Elemento

Nutriente

C

Sacarosa (C12H22O11)

N

Sulfato de Amonio

(NH4)2SO4

% en

% en

Célula

nutriente

45

Y x/s (g/g)

S0 (g/l)

S’0 (g/l)

42,105

0,5614

3.57

5.36

9

21,21

2,3567

0.8486

0.8486

0,4

9,86

24,65

0.0811

0.1216

0,25

12.99

51.96

0.0385

0.0577

Sulfato de Magnesio

Mg

Heptahidratado

(MgSO4.7H2O) Sulfato de Magnesio

S

Heptahidratado

(MgSO4.7H2O) K

Fosfato Potásico (KH2PO4)

0,5

28.67

57.34

0.0348

0.0523

P

Fosfato Potásico (KH2PO4)

2,0

22.79

11.395

0.1755

0.2632



Limitante: Fuente Nitrógeno.

pág. 24

Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS TABLA 05 Peso (g)

Nutriente

Fuente


C12H22O11

C

5.36

0.536 g

Extracto de Levadura

-

1.8

0.18 g

(NH4)2SO4

NyS

0.8486

0.08486 g

KH2PO4

KyP

0.2632

0.02632 g

MgSO4.7H2O

Mg y S

0.1216

0.01216 g

Soluciones de Sales Concentradas

10 ml/L

1 ml

Tampón Citrato pH 4,5

100 ml/L

10 ml



Para 100 mL

SOLUCIÓN DE SALES:

Tabla 06 Composición de la solución de sales 100 veces concentrado, utilizadas en los medios de cultivo en g/l Nutriente


CaCl2.2H2O

1.12

ZnSO4.7H2O

0.11

FeSO4.7H2O

0.06

CuSO4.5H2O

0.05

CoCl2.6H2O

0.01

MoO3

0.0005

MnCl2.6H2O

0.027

NaCl

0.28

pág. 25

Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS 4.2

PREPARACIÓN DE MEDIOS La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.

 Condiciones de Asepsia Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza para prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo. 1. Rotular el matraz con el nombre de la cepa, la fecha y el nombre del alumno o grupo. 2. Encender el mechero Bunsen. 3. Sostener los matraces. Si los matraces tienen un tapón de algodón, sácalo un poco de manera que no esté muy apretado. 4. Flamear en el mechero Bunsen, el cual da un área de desinfección de 30 cm a la redonda. 5. Retirar una tapa con el meñique, mientras sostienes los matraces. Nunca poner las tapas sobre la mesa. 6. Flamear la boca de ambos matraces para matar cualquier microorganismo presente en el aire y que pueda contaminar la parte superior durante las manipulaciones. 7. Los matraces abiertos deben mantenerse en posición inclinada para que el riesgo de contaminación sea mínimo. 8. Sembrar en el matraz estéril el inoculo. 9. De nuevo flamea las bocas de los matraces y tápalos de nuevo. Asegúrate de mezclar muy bien el inoculo en los matraces que contienen el caldo sembrado. 10. Flamea los tapones antes de que los coloques en los matraces.

pág. 26


4.2.1

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE MANTENCIÓN, según la TABLA 01 para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.



Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composición de medios de cultivo de mantención para Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.



Luego de acuerdo a la tabla Nº 1 anterior se pesan las cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado, con la ayuda de la balanza analítica.



Medir 50 ml de agua destilada, en una probeta graduada.



Mezclar todos los compuestos ya pesados en un matraz Erlenmeyer, y después agregar los 50 ml de agua destilada.



Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz; agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla 2 minutos.



Preparar 6 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 6-7ml de la mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml, e inmediatamente taparlos.



Colocar los tubos en un vaso de precipitado previa cobertura con cartón, y llevarlos a la olla a presión, previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio de gases.



Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC y a partir de ello controlar 20 minutos, finalizando la esterilización.



Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla, luego colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.

pág. 27


PREPARACIÓN DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN, según la TABLA 02 para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.



Pesar los componentes descritos en la tabla Nº2



Prepara 25 ml de medio de activación en un matraz de 125ml (separando fuente de carbono, extracto de levadura y malta, y sales).



Se esterilizan por separado el extracto de levadura y malta en un tubo de ensayo (hasta 5 ml con agua destilada), la sacarosa en un matraz de 125 ml (con 15 ml. de agua destilada); esto para evitar la reacción entre estos dos componentes; y por último las sales en otro tubo de ensayo (hasta 5 ml. De agua destilada), por un tiempo de 15 min, contando desde la primera burbuja.



Luego de enfriar, mezclar todo en el matraz en torno al mechero con todas las indicaciones de asepsia, y después llevar al Shaker por un tiempo de 10h; 30°C y 200rpm.

4.2.3

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN, según la TABLA 05 para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.



Pesar los componentes descritos en la TABLA 05.



Disolver completamente cada compuesto con agua destilada de la siguiente manera:  Sacarosa en un matraz de 500ml con 79.5 ml de agua destilada + 7.5ml de medio de activación.  (NH4)2SO4 + KH2PO4 + MgSO4.7H2O + tampón citrato + solución de sales en un tubo con 10 ml. de agua destilada.  Extracto de levadura en un tubo con 10 ml de agua destilada



Dentro de los 79.5 ml de H2O destilada se consideraron 2ml por las pérdidas en evaporación durante la esterilización.



Esterilizar las diluciones por separado durante 15min. contando desde la primera burbuja.



Terminada la esterilización dejar enfriar.

pág. 28


4.2.4 

PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN DE SALES CONCENTRADAS (1L) Pesar las correspondientes sales que conforman nuestra solución de sales concentradas para cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126:

Nutriente


CaCl2.2H2O

1.12

ZnSO4.7H2O

0.11

FeSO4.7H2O

0.06

CuSO4.5H2O

0.05

CoCl2.6H2O

0.01

MoO3

0.0005

MnCl2.6H2O

0.027

NaCl

0.28



Cada compuesto se pesara con cuidado.



Luego de pesar, cada compuesto lo diluiremos con agua destilada en un vaso de precipitado adicionándole 100 ml de agua destilada con la ayuda de un agitador de vidrio, la solución se colocara en una fiola de 1 litro y se enrazara con agua destilada hasta completar 1litro.



Una vez realizado el preparado se llevara a refrigeración para su posterior utilización.

pág. 29


4.3

MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL, CULTIVO DEL M.O, ETC. 4.3.1

RESIEMBRA CELULAR (Solido - sólido )

a. Materiales y equipos  Aza bacteriológica  Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra el M.O.  Mechero Bunsen, trípode y rejilla. b. Procedimiento 

Para la resiembra se siguieron las técnicas de asepsia y colocando bajo mechero con lo que se mantendrá un ambiente estéril.



El asa bacteriológica se somete al fuego del mechero hasta alcanzar el rojo vivo.



Se debe dejar enfriar por unos segundos, del tubo de ensayo que contenía las células desarrolladas en medio sólido, se extrae una azada, se flamea el tubo para cerrarlo.



El procedimiento de resiembra se hace en los tubos de ensayos preparados con medio sólido (con agar).



La azada se realiza en el tubo desde adentro hacia fuera.



Se llevan a la incubadora a 30 °C durante 24 a 48 horas.

4.3.2

ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INÓCULO

a. Materiales y equipos  Matraz de 125 ml.  Algodón  Gasa  Agua destilada  Shaker  Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

pág. 30

Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS b. Procedimiento 

Para la inoculación partimos con la cepa incubada en medio sólido Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.



Se toma una azada y se inocula en el matraz con los 30 ml del medio de activación.



Tapamos el tubo con un tapón de gasa y algodón.



Llevamos al Shaker a 180 rpm, T° = 35 °C y un t = 24 hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez del medio.

4.3.3

DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA

a. Materiales y equipos  Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentación  Espectrofotómetro  pHmetro  Gasa y algodón  Centrifuga  Tubos de ensayo  Capachos de papel aluminio b. Procedimiento 

Inocular los 5 ml de caldo (medio rico + biomasa) a un matraz de 1L conteniendo 95 ml. de medio definido. A partir de este paso se determinará la cinética de crecimiento de la biomasa.



Inmediatamente después, se extrae una muestra de 5 ml del caldo y medir X0 y S0 con D.O.



Se toman las medidas de asepsia en la zona de trabajo y el encendido del mechero.



La toma de muestras se inicia desde la dilución del medio de activación en el medio de fermentación.

pág. 31



Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS Estas se realizaran cada hora y media para la primera muestra y posteriormente cada hora de la siguiente manera:  Se extrae 5 mL del medio de cultivo, 3 mL se le agrega al tubo del espectrofotómetro y el resto se le agrego al tubo de centrifugado.  Se mide su absorbancia a 640 nm y pH; luego se devuelve al tubo de centrifugado para completar los 5 ml y se centrifuga a la máxima velocidad por 20 minutos; el sobrenadante se vierte a los viales y se guarda en el refrigerador con el fin de después determinar el consumo de sustrato.

4.3.4

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR D.O

a. Materiales y Equipos: 

Espectrofotómetro.



Centrífuga.



Estufa.

b. Reactivos: 

Muestra del medio.



Agua destilada.

c. Procedimiento: El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la concentración de microorganismos, esto puede ser detectado fácilmente por espectrofotometría a 640 nm. Para ésta determinación es necesario que previamente se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento: 1. Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a 1200 rpm. Durante 20 minutos.

pág. 32

Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS 2. Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con agua destilada. 3. Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la determinación. 4. Se elimina el sobrenadante, se redisuelve el precipitado y se seca en la estufa a 80 ºC hasta peso constante.

4.3.5

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO)

a. Materiales y equipos  Barra magnética  Vaso de precipitado 250 ml.  Matraz de aforo de 100 ml.  Papel aluminio  Balanza de platos  Balanza analítica  Frasco de vidrio  Agitador magnético  Mechero bunsen b. Reactivos La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:  10 g/l de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)  200 ml/l de NaOH 2N  300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado c. Procedimiento Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el ácido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta

la

completa

disolución

de

todos

los

componentes,

para

posteriormente aforar hasta un litro.

pág. 33


Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra: 5. Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a analizar. 6. Se mantiene la mezcla en un baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego dejar enfriar. 7. Se añaden 10 volúmenes de agua destilada. 8. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco. 9. La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado. La curva de calibrado para sacarosa se obtiene a partir de muestras de concentración conocida y analizadas según este procedimiento, previo hidrólisis ácida de cada muestra.

pág. 34


V.

PROCEDIMIENTOS: 5.1.

Preparación Del Medio De Mantención

De acuerdo con la tabla N° 01, se pesaron las cantidades requeridas, haciendo uso de la balanza analítica.

Se mezcló todos los compuestos ya pesados, en un matraz Erlenmeyer, y después se le agregó los 50 ml de agua destilada ya medidos.

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Se calentó el matraz en el mechero Bunsen agitando constantemente con ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual controlamos 2 minutos.

Se preparó 6 tubos de ensayo con tapa, y en caliente se le adicionó entre 6-7ml de la mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml, y se tapó inmediatamente.

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Luego se colocó los tubos en un vaso de precipitado y se puso dentro de la olla a presión, previamente se aflojaron las tapas, para permitir el intercambio de gases.

Se calentó hasta que la temperatura alcanzó los 121°C y a partir de ello controló 20 min. finalizando la esterilización. Se ajustó las tapas de los tubos y luego se les colocó en posición inclinada a temperatura ambiente.

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS 5.2.

Resiembra Celular (Solido - sólido )

Para la resiembra se siguieron las técnicas de asepsia y se colocó bajo mechero para mantener un ambiente estéril. El asa bacteriológica se sometió a fuego hasta alcanzar el rojo vivo.

El procedimiento de resiembra se hizo en los tubos de ensayos preparados con medio sólido (con agar). La azada se realizó en el tubo desde adentro hacia fuera. Luego se llevó a la incubadora a 30 °C durante 48 h.

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5.3.

Determinación de La Curva de Calibrado de DNS (Ácido Dinitrosalicílico)

Hidrólisis acida de la muestra Se tuvo una solución estándar de Sacarosa 4g/l, de la cual se prepararon 8 tubos de ensayo a diferentes concentraciones, indicados en la siguiente tabla:

N° Tubo

ml. Solución

ml. Agua

Concentración

Stándar

destilada

g/l

1

2

0

4

2

1.75

0.25

3.5

3

1.5

0.l50

3

4

1.25

0.75

2.5

5

1

1

2

6

0.75

1.25

1.5

7

0.25

1.75

1

8

0

2

0

pág. 39


A los 8 tubos que contenían diferentes concentraciones de sacarosa, se les agregó a cada uno 0.5 ml de HCl concentrado y se agitó bien en el agitador de tubos.

Se colocó los 8 tubos de ensayo en un vaso precipitado y se llevó a baño María a 60 °C por 10 minutos. Seguido se colocó el vaso precipitado con los tubos en baño con hielo por 3 minutos. Luego se agregó 3.5 ml de NaOH 1.7M y se llevó nuevamente al agitador de tubos.

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS Reactivo DNS

Se rotuló 8 tubos de ensayo con tapas y de las muestras de la Hidrólisis Acida, se cogió con una micropipeta 500 µl de cada una de ella y se vacío a estos tubos.

Se adición 500 µl de DNS a cada tubo y luego se llevaron a ebullición por 5, luego se llevó a agua con hielo por 3 minutos.

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Luego con una pipeta, se agregó 5 ml de agua destilada a cada tubo, y se dejó reposar por 15 minutos.

Después de reposar los tubos, se agitó en el Maxi mix 8agitador de tubos). Luego se llevó al espectrofotómetro y a 540 nm se midió la absorbancia.

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS LECTURA EN EL ESPECTROFOTÓMETRO A 540nm – CURVA DE CALIBRADO DNS:

Se había encendido el equipo al inicio de la práctica. Luego se calibró el espectrofotómetro con DNS (blanco). Después se realizó la lectura de cada tubo, para ello se vació la muestra en el tubo o celda del espectrofotómetro, se leyó la absorbancia a 540 nm, y seguido se lavó el tubo (3 veces con agua destilada), simultáneamente se había colocado en el equipo otro tubo con agua destilada. Seguido se vació la muestra del segundo tubo en el tubo que se lavó, se retiró el tubo con agua destilada, se colocó el tubo con la muestra en el equipo y se leyó su absorbancia. De la misma forma se leyó las absorbancias de las muestras de los tubos restantes. Así se obtuvo los datos para la curva de calibrado de DNS.

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Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS 5.4.

Preparación Del Medio De Activación para la curva de Calibrado de Biomasa.

Se pesó todos los componentes descritos en la tabla N°02 en la balanza analítica para un medio de activación de 25 ml. Previo a esto se elaboró un tapón hecho de gaza y algodón, para colocarlo en el matraz para evitar la contaminación del medio.

SEn un tubo de ensayo se colocó el extracto de levadura y malta y se le agregó 5ml de agua destilada, en otro tubo se agregó la solución de 9 sales y agregamos 5ml de agua destilada. En un matraz de 125ml se adicionó la glucosa y se agregó 15ml de agua destilada.

pág. 44


Luego se llevaron a esterilizar los 2 tubos y el matraz en la olla a presión, se cubrió los tapones con papel aluminio, además dentro de la olla se colocó cartón para evitar que se rompan los materiales de vidrio, se controló 15 minutos a partir de la primera burbuja.

Luego de enfriar, se vació el contenido de los tubos al matraz, en torno al mechero, así se tuvo preparado el medio de activación con todas las indicaciones de asepsia. Luego se inoculó (en el medio de activación) y se llevó el matraz al Shaker por 10h a 35°C y 200rpm.

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Después de las 10 horas se sacaron los matraces del Shaker, para tener el mismo medio de activación para los 3 subgrupos, se procedió a vaciar el contenido en un solo matraz. Luego se sacaron 4 muestras de 5 ml del matraz y se les midió absorbancia en el espectrofotómetro a 640 nm. de aquí se obtiene un promedio de absorbancia para el valor de 1:1 (sin dilución)

Luego se centrifugó los 4 tubos por 15 minutos, seguido se eliminó el sobrenadante y se quedó con el pellet (sólido); luego se agregó tampón citrato (aprox. 5ml).

pág. 46


Se agitó y se volvió a centrifugar en el Vortex (centrifuga) por 20 minutos, luego se volvió a botar el sobrenadante, nuevamente se agregó solución tampón y se centrifugó, al final se quedó el pellets en los tubos. Luego se colocó los pellets en los capachos, que previamente habían sido rotulados y colocados en la estufa. Se colocó los capachos con pellets en la estufa, por 12 horas a 80 °C.

Después que se retiró los capachos de la estufa (día siguiente), se colocaron en el desecador por media hora. Luego se procedió a pesar cada capacho. Así se obtuvo el peso seco de cada capacho, el promedio de este sirvió para saber la concentración de biomasa en el medio de activación (g/ml).

pág. 47


Con lo que quedó en el matraz de medio de activación se hizo diluciones según la tabla siguiente. A los cuales se les medió absorbancia en el espectrofotómetro a 640nm. CON LO CUAL SE OBTUVO LA CURVA DE CALIBRADO DE

Diluciones

ml. muestra

ml. Agua destilada

01:01

01

0

01:02

01

01

01:03

01

02

01:05

01

04

01:07

01

06

01:10

01

09

pág. 48


5.5.

Preparación Del Medio De Activación para la Cinética.

Se pesó todos los componentes descritos en la tabla N°02 en la balanza analítica para un medio de activación de 25 ml. Previo a esto se elaboró un tapón hecho de gaza y algodón, para colocarlo en el matraz para evitar la contaminación del medio.

SEn un tubo de ensayo se colocó el extracto de levadura y malta y se le agregó 5ml de agua destilada, en otro tubo se agregó la solución de 9 sales y agregamos 5ml de agua destilada. En un matraz de 125ml se adicionó la glucosa y se agregó 15ml de agua destilada.

pág. 49


Luego se llevaron a esterilizar los 2 tubos y el matraz en la olla a presión, se cubrió los tapones con papel aluminio, además dentro de la olla se colocó cartón para evitar que se rompan los materiales de vidrio, se controló 15 minutos a partir de la primera burbuja.

Luego de enfriar, se vació el contenido de los tubos al matraz, en torno al mechero, así se tuvo preparado el medio de activación con todas las indicaciones de asepsia. Luego se inoculó (en el medio de activación) y se llevó el matraz al Shaker por 10h a 35°C y 200rpm.

pág. 50


5.6.

Preparación Del Medio De Fermentación para la Cinética.

De acuerdo con la tabla N° 03, se pesó las cantidades requeridas en la balanza analítica, sobre capachos de papel aluminio.

Se disolvió los compuesto con agua destilada de la siguiente manera:  Sacarosa en un matraz de 500ml con 76 ml de agua destilada.  (NH4)2SO4 + KH2PO4 + MgSO4.7H2O + 10 ml tampón citrato + 1ml de solución de sales.  Extracto de levadura en un tubo con 10 ml de agua destilada. Dentro de los 76 ml de H2O destilada se consideró 2ml por las pérdidas en evaporación durante la esterilización.

pág. 51


Se esterilizó las diluciones en la olla a presión por 15min. ( a partir de la primera burbuja).

Terminada la esterilización, se dejó enfriar y luego se envolvió con papel para ser guardado en la refrigeradora.

pág. 52


5.7.

Determinación De La Cinética De Crecimiento De La Biomasa

Debido a que la preparación del Medio de Activación y las diluciones del medio de Fermentación se preparó la semana anterior, se retiraron del congelador. Seguido se colocó en la estufa el medio de activación (debió estar 1 hora pero solo se colocó por 40 minutos). Y se dejó que las diluciones del medio de fermentación se descongelen.

Cerca al mechero se preparó el medio de fermentación. Se vaciaron las mezclas de los tubos en el matraz (con su debido flameado). El medio de fermentación era un medio traslúcido. Se sacó los 3 matraces de medio de activación de la incubadora y se mezclaron frente al mechero. Seguido se agitó el medio de activación y se tomó de él 5ml los cuales se colocaron en el medio de fermentación.

pág. 53


Con una pipeta limpia y estéril se procedió a sacar 5 ml del medio de activación. Los 5 ml de muestra se agregaron en una celda del espectrofotómetro, y se realizó la lectura a 640 nm. se colocó el matraz en el Shaker, para las próximas lecturas.

Todas las lecturas registradas a través de las horas de fermentación se anotaron en una hoja de registro para ir evaluando el crecimiento de las levaduras durante 11 horas.

pág. 54


Una vez realizada la lectura en el espectrofotómetro, la muestra de la celda se colocó en un tubo de ensayo, y este se centrifugó por 15 minutos.

Terminado la centrifugación, se retiró el tubo de ensayo, y se colocó el sobrenadante en un vial, el cual se tapó. Se tuvo cuidado de que las levaduras no se combinen con el sobrenadante.

El sobrenadante depositado en los viales se colocaron en un recipiente (taper), y este se colocó en la refrigeradora, para su posterior análisis de azucares reductores. – DNS.

pág. 55


5.8.

Determinación De Azúcares Reductores: Método Del Dns (Ácido Dinitrosalicílico)

Hidrólisis acida de la muestra

Se colocó las muestras de los viales en tubos de ensayo, 2 ml y se les agregó a cada uno 0.5 ml de HCl concentrado luego se agitó bien en el agitador de tubos.

Seguido de la agitación se llevó los 5 tubos de ensayo a Baño María a 60°C por 10 minutos.

pág. 56


Después se colocó en baño con hielo por 3 minutos, a continuación se le adicionó a cada tubo 3.5ml de NaOH 1.70M y se agitó en el agitador de tubos.

Reactivo DNS

De las muestras de la Hidrólisis Acida, se cogió con una micropipeta 500 µl de cada una de ella y se vacío a estos tubos. Seguido se adicionó 500 µl de DNS a cada tubo.

pág. 57


Se llevó los tubos a ebullición por 5, luego se llevó a agua con hielo por 3 minutos.

Luego con una pipeta se agregó 5 ml de agua destilada a cada tubo, y luego dejar reposar durante 15 minutos.

Después de reposar los tubos, se agitó en el agitador de tubos - Maxi mix. Luego se procedió a leer a 540 nm en el espectrofotómetro.

pág. 58


LECTURA EN EL ESPECTROFOTÓMETRO A 540nm:

Se calibró el espectrofotómetro con DNS (blanco). Después se realizó la lectura de cada tubo (5 tubos), para ello se vació la muestra en el tubo o celda del espectrofotómetro, se leyó la absorbancia a 540 nm, y seguido se lavó el tubo (3 veces con agua destilada), simultáneamente se había colocado en el equipo otro tubo con agua destilada. Seguido se vació la muestra del segundo tubo en el tubo que se lavó, se retiró el tubo con agua destilada, se colocó el tubo con la muestra en el equipo y se leyó su absorbancia. De la misma forma se leyó las absorbancias de las muestras de los tubos restantes.

pág. 59


Plan de Muestreos y Registro de Datos Grupo: A1 Día de la experiencia: 23/10/12 Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 pHo ………………….....

Nº

01

HORA

Fuente Carbono: Sacarosa

T °C: 35°C

N rpm: 220 rpm

TIEMPO

Absorbancia (640

Nombre del

(horas)

nm)

alumno

0

Observaciones

Todos

02 03 04 05 06 07 08 09 10

pág. 60


VI.

MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS: 1.1

PREPARACIÓN DE MEDIO SÓLIDO DE MANTENCIÓN 1.1.1

3.1.2

1.2

Materiales y Equipos: 

Balanza analítica.



Matraz Erlenmeyer.



Mechero Bunsen.



Espátula.



Pipeta.



Tubos de ensayo.



Varilla de vidrio.



Algodón.



Gasa.



Papel aluminio – capachitos.

Reactivos y nutrientes: 

Material Biológico: Cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126



Extracto de levadura.



Peptona.



Extracto de malta.



Agar.



Glucosa.



Agua destilada.

PREPARACIÓN DE MEDIO DE ACTIVACIÓN: 1.2.1


Balanza analítica.



2 Matraces.

pág. 61

Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS  Mechero Bunsen.

1.2.2

1.3



Una probeta de 100ml



Pipeta.



Estufa.



Varilla de vidrio.



Espátula



Algodón.



Gasa.






pHmetro.



Agitador orbital - Shaker.

Reactivos y nutrientes: 

Glucosa



Extracto de levadura



Extracto de malta.



Solución de sales



Agua destilada



Alcohol

PREPARACIÓN DE MEDIO DE FERMENTACIÓN: 1.3.1


Matraz de 1 L



2 Matraces de 125 ml.



Varilla de vidrio.



Balanza analítica.



Algodón.



Gasa.






pHmetro.

pág. 62


1.4



Sacarosa.



Extracto de Levadura.



(NH4)2SO4



KH2PO4



MgSO4.7H2O



Solución de sales



Agua destilada



Alcohol

RESIEMBRA CELULAR (Solido - sólido ) 1.4.1

1.5

Reactivos y nutrientes:

Materiales y equipos 

Aza bacteriológica



Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra el M.O.



Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INÓCULO 1.5.1


Matraz de 125 ml.



Algodón



Gasa



Agua destilada



Aza bacteriológica



Shaker



Mechero Bunsen, trípode y rejilla

pág. 63


1.6

DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA 1.6.1

1.7


Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentación



Espectrofotómetro



pHmetro



Gasa y algodón



Centrifuga



Tubos de ensayo



Capachos de papel aluminio

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR DENSIDAD ÓPTICA: 1.7.1

1.7.2

1.8

Materiales y equipos: 

Espectrofotómetro.



Centrífuga.



Estufa.

Reactivos: 

Muestra del medio.



Agua destilada.

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO

DEL DNS

(ÁCIDO DINITROSALICÍLICO) 1.8.1

Materiales y equipos: 

Espectrofotómetro.



Agitador magnético.

pág. 64

Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS  Mechero bunsen.

1.8.2



Balanza analítica



Espátula.






2 Vasos de precipitado de 1 litro



Matraz de aforo de 1 litro.



Pipeta.



Gradilla.

Reactivos: 

10 g /L de ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)



200 mL / L de NaOH 2N



300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado



Sacarosa Estándar

pág. 65


VII.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS DÍA

ACTIVIDAD

17/09/12



Presentación del pre-informe.

18/09/12



Preparación

de

medio

de

mantención Agar.

25/09/12



Solución de Sales



Solución tampón citrato pH = 4.2



Resiembra.



Preparación de la curva de calibrado de DNS.



6 capachos de papel aluminio

a

80°C en la estufa (rotulados). 09/10/12

16/10/12



Medio de activación



Medición del peso seco.



Curva de calibrado de biomasa.



Preparación de medio Activación.



Preparación

de

medio

de

fermentación. 22/10/12

23/10/12



Esterilización de pipetas.



Esterilización de viales.



Inoculación seguimiento

de de

medios la

cinética

y de

crecimiento microbiano. 30/10/12



Presentación del informe final y examen.

pág. 66


VIII. A.

RESULTADOS Y DISCUSION CINETICA DE CULTIVO CELULAR POR LOTES

A continuación se darán a conocer los datos obtenidos en todo el desarrollo fermentativo de la levadura Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 para la producción de ETANOL, utilizando como fuente de carbono a la SACAROSA. Nuestro grupo de trabajo A-1 reporta los resultados obtenidos en el trabajo de laboratorio, en el cual no se cumplió con los objetivos de estudio de la cinética de crecimiento microbiano y por ende de análisis de consumo de sacarosa, la fuente de carbono, por ello también reportamos los resultados obtenidos por el grupo B…. en los cuales si se muestra los datos de crecimiento microbiano en un tiempo de 5 horas. TABLA 01: VALORES DE CONCENTRACION DE BIOMASA EN EL TIEMPO A-1 MUESTRA

Hora

Tiempo (h)

ABSORBANCIA

1 2 3 4 5

08:30 09:30 11:30 14:00 17:00

0 1 3 5.5 8.5

0.015 0.016 0.019 0.019 0.019

[BIOMASA] (g/l) 0.045130641 0.057007126 0.09263658 0.09263658 0.09263658

TABLA 02: VALORES DE CONCENTRACION DE BIOMASA EN EL TIEMPO B-3 Tiempo(h) concentración biomasa g/L 0.657143 1

2 3.5 4.5 5.2 6

1.685714 1.742857 1.742857 1.942857 2.142857

Absorbancia (640nm) 0.092

0.128 0.130 0.13 0.137 0.144

Ln X 0.4198538 5 0.52218938 0.5555258 0.5555258 0.66415964 0.76214005

pág. 67


CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO 2.000000

Concentracion de biomasa (g/L)

2.500000

1.500000 1.000000 0.500000 0.000000 0

FIG 1. CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO A-1

2

4 Tiempo(h)

6

FIG 2. CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO B-1

El medio de cultivo debe aportar todos los elementos necesarios para las síntesis celulares de material interno y de los sistemas enzimáticos para cubrir las necesidades energéticas de las levaduras. A modo de resumen

se puede indicar que la inclusión de factores

(temperatura y agitación) de crecimiento en el medio de cultivo favoreció el crecimiento de SacCharomyces cerevisiae y el pH del medio logrado con la adición de tampón citrato. La Sacarosa es un disacárido y para que la levadura pueda aprovechar la fuente de carbono en el medio es necesaria la síntesis de una enzima invertasa para un proceso de hidrolisis enzimática que convierta la sacarosa en fructosa y glucosa, fuentes energéticas del microorganismo. Esta enzima es la Beta fructosidasa.

pág. 68

8


En la figura 2. se pueden distinguir tres zonas:  Fase de latencia. En esta fase, el microorganismo, sometido a un crecimiento previo en un inóculo, se adapta a las condiciones del caldo de fermentación. Básicamente es un periodo de ajuste metabólico. El crecimiento es bajo, y prácticamente no se presenta producción de etanol. Debido a la transferencia del microorganismo del inóculo al nuevo medio, éste puede verse afectado por cambios en el pH, aumento en el suministro de nutrientes y descenso en los inhibidores de crecimiento  Fase exponencial. Esta fase es la más importante para el proceso, ya que la mayor parte del etanol se produce en este periodo. Depende parcialmente de la concentración inicial del sustrato, y la cantidad de etanol a producir está condicionada por la duración de esta fase. El tiempo en esta fase duro 9 horas.  Fase estacionaria. En este punto se detiene el crecimiento, debido al agotamiento de los nutrientes en el caldo de fermentación, así como al efecto inhibidor que provoca la concentración de etanol en el medio. La masa de los microorganismos permanece constante en esta fase, por el equilibrio que se da entre los que permanecen vivos y los muertos. En el estudio también podría haberse determinado los puntos que muestren la fase de decrecimiento debido a la muerte de microorganismos, sin embargo en el caso A-1, se detuvo la producción al observarse que no había crecimiento aparente y en el caso B-1 se detuvo por cuestiones de tiempo.

En la TABLA 02 se muestran los valores experimentales del crecimiento en función al tiempo de fermentación y en la Fig. 02 Se observó que el crecimiento celular se realizó rápidamente, esto probablemente ocurrió por la disponibilidad de la fuente de carbono utilizada, Sacarosa, durante la primera hora se observa un aumento acelerado de la concentración de biomasa celular. El crecimiento microbiano de la Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 se dio debido a que utilizamos Sacarosa como fuente de carbono y una alta concentración de extracto de levadura, entre los demás nutrientes y sales. Los compuestos carbonados son utilizados por las levaduras a la vez como fuente de energía y como fuente de carbono. En el cultivo A-1 después de 03 horas de fermentación con las condiciones de operación, se observa una ligera variación en la concentración de biomasa celular. Posteriormente los valores no varían y pareciera que el cultivo entra en una fase estacionaria de crecimiento.

pág. 69


Esto se reporta como un resultado anómalo que no concuerda con lo esperado en cuanto al crecimiento de la levadura y la síntesis de etanol. A continuación se hace una breve discusión acerca de los nutrienets utilizados en el medo de fermentación y su relación con el crecimiento microbiano El nitrógeno es cuantitativamente el segundo constituyente aportado por el medio de cultivo. Es utilizado por las células en los aminoácidos, los nucleótidos y algunas vitaminas. Pueden ser utilizadas numerosas fuentes de nitrógeno. Todas las levaduras son capaces de utilizar el nitrógeno en forma de ion amonio. Los iones amonio pueden ser aportados en el medio por el cloruro amoniaco, el nitrato amónico, el fosfato amónico y sobre todo el sulfato amónico, mejor compuesto pues aporta al mismo tiempo el azufre necesario para la síntesis de ciertos aminoácidos. (KREGER VAN RIJ, 1984). En nuestra experiencia se utilizó el Sulfato de Amonio como fuente de Nitrogeno para la levadura. Los extractos de levadura son excelentes substratos para muchos microorganismos. Son productos a partir de la levadura de panadería mediante autolisis a 50 – 55ºC. El extracto de levadura contiene aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos. (WOLG, 1989) También, mencionemos a cada uno de los nutrientes, como el fósforo se halla incluido en los ácidos nucleídos y los nucleótidos di y tri fosfato. Se encuentra también en forma de polímeros lineales de polifosfato que juegan un papel importante en la regulación del metabolismo celular. (KULAEV y VAGABOV 1983). 3

La concentración en iones fosfatos ( PO4 ) regula la síntesis de los lípidos y los glúcidos. 

El fosforo es asimilado por la célula en forma de iones ortofosfato ( H 2 PO4 ) las fuentes de fosforo en el medio de cultivo deben estar constituidas por el dihidrogenofosfato de potasio ( KH 2 PO4 ) o por el hidrogenofosfato disódico ( Na2 HPO4 ). En condición limitante de

pág. 70


fosforo en el medio, la célula sintetiza una fosfatasa acida (fosfomonoesteresa), localizada en la pared que libera fosforo a partir de los esteres fosfóricos (SCHURR y YAGIL, 1971). EL 60% del azufre está incorporado en las proteínas. El 5% está en forma de sulfato inorgánico libre el resto está en forma de enlace disulfuro y en aminoácidos sulfurados libres. El azufre esta igualmente presente en algunas vitaminas. La fuente de azufre más frecuentemente utilizada en los medios de cultivo es el sulfato amónico. (PARRY y col, 1976). El potasio es el elemento mineral cualitativamente más importante en la levadura. Tiene papeles fisiológicos importantes: 

Catión regulador: por cada penetración de un catión metálico divalente, hay

excreción de 2K+ (FUHRMANN y ROTHSTEIN, 1968). 

A PH acido, el potasio estimula la fermentación y la respiración (PENA, 1980).



Actúa como efector de numerosas enzimas: piruvato quinasa, aldolasa, aldehído

deshidrogenasa y permeasa (ATPasa) (MAIORELLA Y col. 1984). 

Interviene en la estructura de los ARN.

El magnesio es necesario para el buen funcionamiento de un centenar de enzimas del metabolismo; juega el papel: 

De activador de las enzimas glicoliticas.



De estimador de la síntesis de los ácidos grasos.



De regulador de las ATPasas de las membranas.



Participa con el potasio en la penetración del fosfato.

pág. 71


LOS FACTORES CONTROLADOS EN LA FERMENTACION La temperatura corriente de cultivo de las levaduras se sitúa entre 25 y 30ºC que permite efectivamente el crecimiento de la mayor parte de las levaduras. Sin embargo estas temperaturas no son reguladas a las temperaturas óptimas de crecimiento que las levaduras que se encuentran en su hábitat natural. Siendo la membrana citoplasmática de las células cultivadas a temperatura elevada mas resistente a las desnaturalizaciones térmicas que la de las células cultivadas a baja temperatura. (WALTON y PRINGLE 1980). En la experiencia realizada, el cultivo de los microorganismos se dio a 35°C. Lo cual es un valor cercano al reportado. Un factor importante a considerar en el cultivo de Saccharomyces cerevisiae es la aireación de medio de cultivo. En condiciones anaerobias, sin embargo, el crecimiento es lento y el piruvato producido durante el catabolismo es procesado por la piruvato descarboxilasa a acetaldehido y CO2. Se produce entonces etanol a partir de acetaldehido mediante la reducción por la alcohol deshidrogenasa. Los sistemas discontinuos para la producción de etanol se inician aeróbicamente para obtener la máxima biomasa, ya que si las condiciones anaerobias comienzan demasiado pronto la densidad de la población no será lo suficientemente alta para obtener una velocidad de conversión. Puede ser incluso necesaria la aireación forzada durante un tiempo corto a fin de evitar pérdidas de rendimiento. Durante la realización de la experiencia no se tomaron en cuenta consideraciones respecto a la aireación del matraz de fermentación. Lo cual no parece haber sido un factor de influencia en el desarrollo del crecimiento microbiano, pues se obtuvo altas concentraciones de biomasa microbiana y de síntesis de etanol. De acuerdo la composición del medio de cultivo se observa que el crecimiento de la Sacharomyces cerevisiae es óptimo en el caso del cultivo B-1, lo cual demuestra que el medio es propicio para el desarrollo del cultivo y cumple con los requerimientos mínimos que necesita las células para crecer.

pág. 72


Determinación Del µMÁX Del Microorganismo Sacharomyces cerevisiae en un Cultivo por Lote con SACAROSA como Fuente de Carbono

Tiempo (h) 0 1 2

Ln(X/Xo) 0 0.6421 0.9754

para obtener una relación lineal en el grafico siguiente, fue necesario realizar modificaciones en los valores. Asi se tiene la ecuación:

 CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO 𝑑𝑥 𝑑𝑥

𝑑𝑡

= µ. 𝑥

𝑥

= µ. 𝑑𝑡 pág. 73

Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS INTEGRANDO:

𝑥𝑓

ln( ) = µ. 𝑡𝑦 = 0.4877𝑥 + 0.0515 𝑥𝑜

µmáx=0.4877 h-1

pág. 74


CONSUMO DE SUSTRATO DE SACHAROMYCES CEREVISIAE A continuación se darán a conocer los datos obtenidos en el consumo de sustrato por parte de la levadura Sacharomyces cerevisiae para la producción de ETANOL, utilizando como fuente de carbono a la SACAROSA.

OBTENCION LA CURVA DE CRECIMIENTO DE [AZUCARES REDUCTORES] CON METODO DNS: Utilizando la ecuación de línea de tendencia de la curva de calibrado – Método DNS: 𝒚 = 𝟎. 𝟏𝟗𝟏𝟗𝒙 − 𝟎. 𝟎𝟎𝟖𝟐 𝑦 = 0.1919𝑥 + 0.0082 → 𝐴𝑏𝑠. = (0.1919)(𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛) − 0.0082 𝑥 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛. =

𝐴𝑏𝑠 − 0.0082 0.1919

Con esta ecuación hallamos las concentraciones de las 5 muestras en diferentes tiempos cada una, utilizando los valores de absorbancia brindados por el espectrofotómetro de ultravioleta visible: TABLA 03. Determinación de la concentración de azúcares reductores A-1 MUESTRA

ABSORBANCIA

1 2 3 4 5

0.596 0.565 0.577 0.591 0.594

[AZUCARES REDUCTORES] 3.0631 2.9015 2.9640 3.0370 3.0526

[AZUCARES REDUCTORES] Conc. de azúcares REductores

4.0000 3.5000

FIG.03 Consumo de Sacarosa en el tiempo A-1

3.0000 2.5000 [AZUCARES REDUCTORES]

2.0000 1.5000 1.0000 0

2

4

Muestra

6

pág. 75


Relación entre [Biomasa] y [Azúcares Reductores]: Analizamos las variaciones de los puntos respecto a las 5 muestras analizadas: Tabla. Relación entre concentración de biomasa y azúcares reductores respecto a la muestra analizada en diferentes tipos. MUESTRA 1 2 3 4 5

[BIOMASA] (g/l) 0.045130641 0.057007126 0.09263658 0.09263658 0.09263658

[AZUCARES REDUCTORES] 3.0631 2.9015 2.9640 3.0370 3.0526

Relación entre [Biomasa] y [Azúcares Reductores]

[Biomasa] y [Azúcares Reduc.]

6 5 4 3

[BIOMASA] (g/l) [AZUCARES REDUCTORES]

2 1 0 0

2

4

6

Muestra

En relación al consumo de sacarosa por el microorganismo para el crecimiento del cultivo, los resultados obtenidos también pueden reportarse como anómalos pues se espera que la concentración de sacarosa disminuya en el tiempo debido al consumo por parte de la levadura para obtener energia, pero esta oscila continuamente.

pág. 76


Podemos acotar que no existen diferencias sustanciales en la concentración y absorbancia reportadas lo cual podría indicar que no se dio crecimiento en el cultivo o que este fue mínimo por lo que no se perciben variaciones en los resultados. TABLA 05: Determinación de Azucares Reductores B-1

Concentración Absorbancia Sacarosa 0.768 3.8392 0.553 2.7588 0.465 2.3166 0.439 2.1859 0.422 2.1005 0.572 2.8543 FIGURA 4. Curva de calibración Sacarosa para prueba DNS

FIGURA 4. Consumo de Sacarosa en el tiempo B-1

pág. 77


FIGURA 6. Relación crecimiento microbiano y consumos de sacarosa B-1 4.5000

CONSUMO FIGURA 4. DE SACAROSA

4.0000

Consumo de Sacarosa en el tiempo B-1

Absorbancia

3.5000 3.0000 2.5000 2.0000 1.5000 1.0000 0.5000 0.0000 0

1

2

3

4

5

6

7

Tiempo (h)

pág. 78


B.

DESARROLLO DEL INOCULO EN EL TIEMPO DE FERMENTACION

OBTENCION LA CURVA DE CRECIMIENTO DE [BIOMASA] CON METODO DNS: Utilizando la ecuación de la curva original de Biomasa-Peso seco celular: 𝑦 = 0.0505𝑥 + 0.0112 → 𝐴𝑏𝑠. = (0.0505)(𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛) + 0.0112 𝑥 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛. =

𝐴𝑏𝑠 − 0.0112 0.0505

Con esta ecuación hallamos las concentraciones de las 5 muestras en diferentes tiempos cada una, utilizando los valores de absorbancia brindados por el espectrofotómetro de ultravioleta visible: MUESTRA

Hora

Tiempo (h)

ABSORBANCIA

1 2 3 4 5

08:30 09:30 11:30 14:00 17:00

0 1 3 5.5 8.5

0.015 0.016 0.019 0.019 0.019

[BIOMASA] (g/l) 0.075247525 0.095049505 0.154455446 0.154455446 0.154455446

ABSORBANCIA (540 nm)

[BIOMASA] (g/l) vs ABSORBANCIA 0.02 0.018 0.016 0.014 0.012 0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0

FIGURA 7. Relación crecimiento microbiano Absorbancia B-1

Biomasa (g/l)

0

0.05

0.1 BIOMASA (g/l)

0.15

0.2


pág. 79


[BIOMASA] - ABSORBANCIA TIEMPO FIGURA 8. Relación crecimiento microbiano y Absorbancia A-1

[Biomasa] ; Absorbancia

0.18 0.16 0.14 0.12 0.1

0.08

ABSORBANCIA

0.06

[BIOMASA] (g/l)

0.04 0.02


0 0

2

4

6

8

10

Tiempo (hrs)

FIGURA 9. Relación crecimiento microbiano y Absorbancia B-1

FIGURA 4. Consumo de Sacarosa en el tiempo B-1 En el caso del cultivo B-1 es posible describir una relación casi lineal entre la concentración de biomasa en g/L y la absorbancia reportada. Así se destaca que durante la primera hora se

pág. 80


tuvo un crecimiento sustancial de la población de microorganismos y con ello un aumento en la absorbancia.

RENDIMIENTO DE SACAROSA EN BIOMASA

Para determinar el rendimiento utilizamos los datos B-1 por ser el caso donde se reporto crecimiento significativo. Para ello utilizamos la formula.

𝑌𝑥/𝑠 = −

∆𝑋 ∆𝑆

REEMPLAZANDO

𝑌𝑥/𝑠 = −

(2.1428 − 0.6571) (2.8543 − 3.8392) YX/S = 1.5

RENDIMIENTO DE SACAROSA EN BIOMASA

También consideramos los datos de la experiencia B-1 𝑄𝑥 =

∆𝑋 ∆𝑡

REEMPLAZANDO

𝑄𝑥 =

(2.1428 − 0.6571) (5 − 0)

Qx=0.2971 g/l.h pág. 81


Parámetros cinéticos determinados en la experiencia realizada de la Saccaharomyces cerevisiae utilizando Sacarosa como fuente de carbono.

Parámetro cinético

Valor obtenido experimentalmente

m (h-1)

0,4877

td (h)

1,42

Yx/s (g/g)

0,56

Xmax (g/l)

2.14587

pág. 82


CONCLUSIONES

Se logró diseñar el medio de cultivo con los componentes necesarios para lograr crecimiento optimo de Saccaharomyces cerevisiae ATCC 4126.

El medio adecuado para la mantención de un cultivo debe poseer una fuente de carbono, nitrógeno y sales en cantidades adecuadas para así satisfacer los requerimientos nutricionales del microbio y favorecer la reproducción celular y la producción de etanol.

La activación celular permitió el reinicio de las actividades metabólicas de la Saccaharomyces cerevisiae con el desarrollo del inóculo se alcanzó una cantidad inicial de 0.6571 g/L de biomasa para iniciar la fermentación.

En el desarrollo de la fermentación notamos que el consumo del nutriente es más acelerado que el crecimiento de la biomasa.

El diseño de los diferentes medios tanto activación como fermentación debe tener la adecuada cantidad de fuente de N, fuente de carbono, vitaminas (extracto de levadura) y otros (las demás sales usadas) para que Saccharomyces cerevisiae pueda desarrollarse.

Se determinó que para el medio de cultivo mínimo utilizado de la Saccharomyces cerevisiae los valores cinéticos experimentales de µmáx = 0,4877 h-1 , un td= 1.42 hr, YX/S = 0,56g de Biomasa/g de Fructosa.

pág. 83


IX.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 

http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap4_mi.pdf



http://es.idoub.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-deMedios-de-Cultivo



http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap4_mi.pdf



http://biorreactores.tripod.com/C3CBCL.htm



http://www.acenologia.com/ciencia64_02.htm



http://www.google.com.pe/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=7 &ved=0CEUQFjAG&url=http%3A%2F%2Ffcqmicrodealimentos.wikispaces.com%2Ffile%2Fview%2FCientica%2Bde%2B S.cerevisiae.docx&ei=6HOPUKrEE5L69gTD9IDYCQ&usg=AFQjCNGJvUWxc2 3QunIlWBgir0IGA2YqGw&cad=rja

pág. 84


X.

ANEXOS: DISEÑO DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN Y DE FERMENTACIÓN Y ºXS 

X %Elemento en nutriente   f … (1)  S %Elemento en biomasa

Para fuente de carbono, f =0.6 Para otra fuente, f =1 Donde: Y ºXS 

%Elemento en nutriente  f … (2) %Elemento en biomasa

Y ºXS 

X … (3)  S

De (3):

Y ºX S 

X … (4)  S f  Si 

De (4):

Si  S f 

X f  Xi Y ºX S

Si Sf  0 . Entonces; S i g L 

X  n … (5) YºX S

pág. 85

Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOPROCESOS Para cada fuente, n =1.5 Para el limitante,

n =1

pág. 86

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